Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Das übergeordnete Ziel dieses Laborprotokolls ist es, durch die Identifizierung von Phospholipidfettsäuren Informationen über die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften im Boden zu liefern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der Wissenschaft zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung der mikrobiellen Reaktion des Bodens auf Änderungen der Landbewirtschaftung oder auf natürliche Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein leicht verständliches, robustes Protokoll handelt, das auf eine Vielzahl von Bodentypen angewendet werden kann.

Katelyn Pretzlaff, Technikerin an unserer Forschungsschule, wird dieses Protokoll vorführen. Um mit der Extraktion zu beginnen, bereiten Sie 5,0 molare Kaliumhydroxid und 0,15 molare Citratpuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie den 19:0-Nonadeconoat-Surrogatstandard täglich vor, indem Sie 250 Mikroliter der Stammlösung in 25 Millilitern Chloroform verdünnen.

Dies bietet einen ausreichenden Surrogatstandard für eine Charge von 23 Proben. Geben Sie 0,5 Milliliter der 19:0-Surrogat-Standardlösung in das Probenzentrifugenröhrchen. Um die Bligh- und Färberextraktion an der Bodenprobe durchzuführen, fügen Sie 2,0 Milliliter Citratpuffer hinzu, gefolgt von 2,5 Millilitern Chloroform und dann 5,0 Milliliter Methanol.

Verschließen Sie die Probe mit einer PTFE-ausgekleideten Kappe und wirbeln Sie sie 30 Sekunden lang ein. Legen Sie es dann für zwei Stunden in einen durchgehenden Shaker. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die Probe bei 226 mal G für 15 Minuten mit aufgesetzter Kappe.

Ziehen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Pipette ab und geben Sie ihn in ein beschriftetes 45-Milliliter-Glasfläschchen. Geben Sie eine zweite Runde Extraktionsmittel Bligh and Dyer zu jeder Probe und wiederholen Sie die Schüttel- und Zentrifugationsschritte. Ziehen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Pipette ab und geben Sie ihn in das gleiche beschriftete 45-Milliliter-Glasfläschchen.

Als nächstes geben Sie 5,0 Milliliter Chloroform und 5,0 Milliliter Citratpuffer in das beschriftete 45-Milliliter-Glasfläschchen mit dem Überstand. Verschließen Sie es mit einer weißen, mit PTFE ausgekleideten Kappe und wirbeln Sie das Glasfläschchen 30 Sekunden lang durch. Saugen Sie die obere wässrige Phase des 45-Milliliter-Fläschchens vorsichtig ab.

Pipettieren Sie die untere organische Phase in ein beschriftetes 15-Milliliter-Fläschchen. Stellen Sie eine Charge von 15-Milliliter-Fläschchen bei Raumtemperatur unter komprimierten Stickstoff, um Oxidation zu vermeiden. Verdampfen Sie das Chloroform langsam ab und stellen Sie den Stickstofffluss so ein, dass die Oberfläche der Flüssigkeit im Fläschchen gekräuselt wird, aber nicht an den Seiten des Fläschchens klettert.

Schrauben Sie eine PTFE-ausgekleidete Kappe auf und lagern Sie die Proben im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, eingewickelt in Aluminiumfolie. Beschriften Sie bei Bedarf neue Festphasenextraktions- oder SPE-Säulen. Platzieren Sie einen SPE-Säulenhalter mit Zapfen auf dem Glasbehälter und setzen Sie die beschrifteten Säulen in die Zapfen ein.

Konditionieren Sie jede Säule, indem Sie 5 Milliliter Aceton hinzufügen und abtropfen lassen. Fügen Sie dann zwei Zusätze von 5 Millilitern Chloroform hinzu. Lassen Sie die zweite Chloroform-Wäsche abfließen, bis sie etwa 1 Milliliter über dem ist, und schließen Sie dann den Zapfhahn.

Die Probe wird erneut aufgelöst, indem 0,5 Milliliter Chloroform in das Fläschchen gegeben und vorsichtig vortexiert werden. Übertragen Sie die gelöste Probe mit einer Pastuer-Pipette in die SPE-Säule. Legen Sie die Lipidprobe direkt auf die Mitte der Säule und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig in den Tank ablaufen.

Eluieren Sie die neutralen Lipide, indem Sie jeder Säule 5 Milliliter Chloroform hinzufügen. Lassen Sie das Lösungsmittel vollständig in den Tank ablaufen. Eluieren Sie Glykolipide, indem Sie jeder Säule 5 Milliliter Aceton hinzufügen, so dass das Lösungsmittel vollständig in den Auffangbehälter abfließen kann.

Entfernen Sie den Säulenständer vom Tank und entleeren Sie den Tank mit einem Vakuumgerät. Setzen Sie das Gestell mit sauberen und beschrifteten Zentrifugenröhrchen in den Tank ein und setzen Sie den Säulenständer wieder auf den Tank. Die beschriftete Spalte oben sollte mit dem beschrifteten Zentrifugenröhrchen unten ausgerichtet sein.

Eluieren Sie Phospholipide in Zentrifugenröhrchen, indem Sie jeder Säule 5 Milliliter Methanol hinzufügen. Warten Sie, bis die SPE-Säulen im Abzug ausgetrocknet sind, bevor Sie sie entsorgen. Trocknen Sie die Phospholipidfraktionen bei Raumtemperatur unter komprimiertem Stickstoff ab.

Nachdem Sie die Röhrchen mit Stickstoff gespült haben, schrauben Sie PTFE-ausgekleidete Kappen auf und lagern Sie die Proben im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, eingewickelt in Aluminiumfolie. Schalten Sie das heiße Wasserbad ein, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur kommen.

Zu jeder Probe werden 0,5 Milliliter Chloroform und 0,5 Milliliter Methanol gegeben, gefolgt von 1,0 Millilitern mathanolischem Kaliumhydroxid. Verschließen Sie die Röhrchen fest mit PTFE-ausgekleideten Kappen und schwenken Sie sie, um sie zu mischen. Legen Sie die versiegelten Proben für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Bad.

Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand mindestens ein bis zwei Millimeter über dem Niveau der Probenflüssigkeit liegt. Während sich die Proben im Wasserbad befinden, beschriften Sie kleine Glasfläschchen mit Proben-IDs. Nach 30 Minuten die Proben entnehmen und abkühlen lassen.

Geben Sie anschließend 2,0 Milliliter Hexan in jede Probe und schwenken Sie sie, um sie zu mischen. Geben Sie dann 0,2 Milliliter 1,0 molare Essigsäure zu jeder Probe und schwenken Sie sie erneut. Die Phasentrennung sollte sichtbar werden.

Geben Sie 2,0 Milliliter destilliertes Wasser zu jeder Probe, um die Phase zu unterbrechen. Nachdem die Proben 30 Sekunden lang vortexiert wurden, zentrifugieren Sie die Proben zwei Minuten lang bei 226 mal G. Übertragen Sie die obere Phase mit einer kurzen Pasteurpipette in saubere, beschriftete 10-Milliliter-Fläschchen.

Achten Sie darauf, dass Sie keinen Teil der unteren wässrigen Phase übertragen. Geben Sie 2,0 Milliliter Hexan in jedes Zentrifugenröhrchen der Probe und schwenken Sie es. Die Proben 30 Sekunden lang vorziehen und dann wie zuvor zentrifugieren.

Geben Sie mit einer kurzen Pasteurpipette erneut die obere Phase in die beschrifteten 10-Milliliter-Glasfläschchen. Verdampfen Sie das Lösungsmittel in den beschrifteten 10-Milliliter-Glasfläschchen bei Raumtemperatur unter Stickstoff. Schrauben Sie PTFE-ausgekleidete Kappen auf und wickeln Sie die Proben in Aluminiumfolie ein.

Lagern Sie die Proben im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, bis Sie mit der Gaschromatographie-Analyse fortfahren können, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Chromatogramm gezeigt, das durch das Durchführen einer Probe einer Kapillargaschromatographie mit einem Flammenionisationsdetektor erhalten wurde. Die Verweilzeiten in Minuten sind für die PLFAs in Klammern angegeben.

Die Reaktionen aller PLFAs können summiert werden, um die gesamte PLFA-Biomasse in Nanomol pro Gramm Boden zu erhalten. Auch die relative Verteilung verschiedener PLFA-Gruppen kann berechnet und zwischen den Böden verglichen werden. Die Ergebnisse deuten auf eine höhere Gesamt-PLFAs für den Boden an Standort eins hin, der sich unter älteren Bäumen befindet, gefolgt von dem Boden unter den Bäumen mittleren Alters an Standort zwei.

Und schließlich der Boden unter den jüngsten Bäumen, an Standort drei. Relativ mehr gesättigte PLFAs sind an der jüngsten Stelle vorhanden, während an der ältesten Stelle mehr ungesättigte PLFAs vorhanden sind. PLFA-Ergebnisse können mit multivariaten Ordinationstechniken weiter analysiert werden, wie z. B. einer nicht-metrischen, mehrdimensional skalierenden Ordination, wie hier dargestellt.

Die jüngste Fundstelle trennt sich sehr deutlich von den beiden älteren Standorten, die eine Überlappung in ihrer Zusammensetzung der PLFA-Mikrobengemeinschaft aufweisen. Das Ausmaß der Variation in den PLFA-Community-Daten, die durch die einzelnen Achsen erläutert werden, ist in Klammern angegeben. Sobald diese Technik beherrscht wird, ist es möglich, dass eine Person 20 Proben über vier Tage verarbeitet.

Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Lipide besonders anfällig für Oxidation sind. Daher ist es wichtig, die Proben vor Luft- und Lichteinwirkung zu schützen, z. B. durch Lagerung im Dunkeln und unter Stickstoff. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften im Boden quantifizieren können, indem Sie Phospholipidfettsäuren durch einen dreistufigen Prozess identifizieren: Lipidextraktion, Lipidfraktionierung und Lipidmethylierung.