Name: Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Nieren-Immunzellen für die mehrfarbige Durchflusszytometrie. Diese kostengünstige Technik liefert lebensfähige Einzelzellsuspensionen in ausreichender Menge.

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Diese Arbeit wird durch einen Forschungszuschuss von Dialysis Clinics Inc. und durch den Zuschuss des University of Missouri Research Board unterstützt.

Alle Protokollschritte durchgeführt wurden von der University of Missouri Animal Care und Use Committee (ACUC) überprüft und genehmigt. Für dieses Protokoll, männlichen C57BL / 6-Mäuse im Alter von 15 Wochen wurden genutzt, obwohl theoretisch jeder Nagetier in jedem Alter kann für Experimente verwendet werden. Da dies ist ein Nicht-Überlebens Operation wird Euthanasie durch Ausbluten und bilaterale Pneumothorax erreicht. 1. Durchblutung der Nieren Hinweis: Perfusion von Organen wie Herz, Leber und Niere entfernt das Blut, das mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen kann. Daher, wenn möglich, wir perfuse immer die Organe. <ol><li> Platzieren Sie die Maus in einem Isofluran (3 ml / min) Induktionskammer, bis es unbeweglich ist. Dann entfernen Sie die Maus aus der Kammer lag es vom Rücken her auf dem Seziertisch und die Isofluran-Kegel auf der Maus Nase legen und Isofluran mit einer Rate von 1,5 ml / min durch den Regler schieben. </li><li> Schauen Sie sich die Zehe Prise response mit einer Pinzette zu beurteilen, ob das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat. Reinigen Sie das ventrale Abdomen mit Kochsalzlösung und schneiden Sie den Bauch mit einer Schere öffnen und die Bauchorgane drücken (aus dem OP-Feld) auf der linken Seite der Maus. </li><li> Sammeln von Blut aus der unteren Hohlvene mit einer 25-Gauge-Nadel-fixiert auf eine 1-ml-Spritze und fügen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA. Hinweis: Ansammlung von Blut ist optional. Plasma kann für biochemische Messungen verwendet werden. Leukozyten können für die Durchflusszytometrie-Tests verwendet werden. </li><li> Mit einer Schere, machen einen kleinen Schnitt in der rechten Vorhofs die Mischung aus Blut heraus zu lassen und PBS aus dem nächsten Schritt. </li><li> Nehmen Sie eine 50-ml-Spritze und füllen mit eiskaltem PBS (20-30 cc). Als nächstes befestigen Sie den linken Ventrikel an seiner Spitze an der Spritze, durchstechen eine 21-25 G-Nadel (während das Herz sanft zwischen Pinzette) und langsam den linken Ventrikel mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) über den Verlauf perfusevon 1-2 min. Anmerkung: Das Herz sofort nach den ersten paar Milliliter Perfusion blanches. Beachten Sie die Leber für blanchiert, da dies zeigt, dass die Perfusion Blut aus der Leber über den venösen Rückstrom durch die Hohlvene abzulassen. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht während der Infusion erweitern, da diese Einstich des rechten Ventrikels anzeigt. Wenn die Lunge zu erweitern waren, ziehen Sie die Nadel leicht nach hinten in den linken Ventrikel und die Perfusion fortzusetzen. Die Zeit vom ersten Schnitt bis Euthanasie genommen wird erreicht, weniger als 2 min </li></ol> 2. Dissection von Kidneys <ol><li> Nach Perfusion abgeschlossen ist, mit einer Schere und Pinzette die rechte Niere von ihrer Anhänge (Blutgefäße, Fett und Nebennieren) und die Verbrauch zu sezieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kapsel die Niere Abdeckung durch Schneiden und mit einer Zange zu sezieren. Wiegen Sie die Niere. Hinweis: Mit einem Gewicht der Niere ist optional. Jedoch einige Experimentekann in Änderung Nieren Größe / Gewicht führen, die verwendet werden können, Zellausbeute pro Gramm Gewebe zu normalisieren. </li><li> Nach der Niere mit einem Gewicht, legen Sie sie in 1 ml RPMI-1640 0,5% FBS oder Zytometrie Lösung Färbepuffers (50 ml konischen Schraubdeckel Rohr) fließen und das Rohr auf Eis bis zur weiteren Verwendung in Verkehr bringen. Anmerkung: Zur Vereinfachung der Beschreibung werden wir den Rest der Isolierung von Immunzellen in der Durchflusszytometrie Färbepuffer Lösung beschreiben. Darüber hinaus werden wir die Isolierung von Immunzellen aus einem einzigen Niere beschreiben, obwohl beide Nieren oder 1 + 1/3 rd der Niere in Abhängigkeit von den nachgeschalteten Experimenten verwendet werden können (optional). 1/3 der Niere könnte für Protein / RNA - Experimente eingefroren werden und 1/3 rd kann in Puffern für die Immunhistochemie oder Transmissionselektronenmikroskopie platziert werden. </li></ol> 3. Homogenisieren von Kidneys <ol><li> Beschriften Sie eine 5-80 ml Kapazität Homogenisieren Beutel mit Probenidentifikationsinformationen,Entfernen Sie das Innere Sieb (STR) und entsorgen. Füllen Sie den Beutel mit 5 ml eiskaltem Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und übertragen Niere in den Puffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Probe oder mehrere Proben, die verarbeitet werden müssen. </li><li> Falten Sie die Homogenisierung Beutel in der Hälfte, so dass die eine Hälfte der Niere in der Durchflusszytometrie Färbung Pufferlösung und die andere Hälfte wird einfach umgefaltet es unter Wasser hat. </li><li> Schalten Sie das Gewebe-Homogenisator und legen Sie es auf schnelle (Einstellung) Umdrehungen pro Minute. Legen Sie das gefaltete Homogenisieren Beutel mit der Niere das Paddel zugewandt, in der Nähe der unteren Kante, aber stellen Sie sicher, dass das untere Ende der Beutel sind nicht unter dem unteren Rand der Paddel schieben. <ol><li> Verarbeiten Sie die zweite Probe gleichzeitig, wie es 2 Paddel. Wählen Sie Zeit als 120 Sekunden. Beachten Sie die Paddel hin und her bewegen, um die Nieren zu homogenisieren. Anmerkung: In der Zwischenzeit können diese Ausfallzeiten verwendet werden 2 weitere Niere herzustellen (oder anderem Gewebe) Proben während der ersten beiden verarbeiten. </li></ol&gt; </li><li> Nach dem mit dem ersten Satz der Homogenisierung Abschluss übertragen, die Taschen zu Eis und das Gewebe-Homogenisator mit dem nächsten Satz von Proben neu zu laden und so weiter. Optisch sorgen, dass die Nieren sind ausreichend homogenisiert und keine großen Brocken sind sichtbar. Hinweis: Im Allgemeinen, 2 min in das Gewebe-Homogenisator bei schnellen rpm für die Niere ausreichend ist. </li><li> Legen Sie eine 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb in den 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Als nächstes Pipette vollständig auf das Homogenat in die Zelle Sieb. Stellen Sie eine Bodenzentrifuge bei 50 × g für 1 min bei 4 ° C und laden Sie die Proben in die Zentrifuge. Hinweis: Die Zentrifugation wird sichergestellt, dass alle Homogenat (mit Zellen) durch die Zelle Sieb passiert hat. </li><li> Entfernen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie wieder auf dem Eis. Entsorgen Sie die Zelle Siebe und das Homogenat halten. In gleichem Volumen (~ 6 ml) 1x RBC Lysispuffer zu dem Zellpellet / Überstand und Pipette nach oben und unten mehrmals eine einheitliche Zellsuspension zu machen. Visually, sofort ein Teil der roten Farbe in der Suspension Abnahme beobachten. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min maximale RBC-Lyse zu erreichen. Hinweis: der Schritt RBC-Lyse kann übersprungen werden, wenn die Ermittler der Nierenperfusion zuversichtlich ist und weniger Zellmanipulation erwünscht ist. Wir haben nicht durch Unterwerfen der Zellsuspension auf RBC-Lyse eine signifikante Zunahme der Nierenzellausbeute beobachtet. </li><li> Dreh die Röhrchen in der Zentrifuge, die mit 500 xg eingestellt wurde, 4 ° C für 5 min ein Zellpellet zu bilden. Hinweis: Während der Schritte 3.6 und 3.7, bereiten für kolloidales Siliciumdioxid (Percoll) basiert Dichtegradientenzentrifugation. <ol><li> Nehmen Sie sich 10 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen und beschriften sie mit entsprechenden Probennummern und legen Sie sie in einem Rohrgestell. Hinweis: Im Folgenden wird beschrieben, wie genug Dichtegradienten Reagenzien für 4 Nierenproben zu machen. </li><li> Nehmen Sie 7 ml Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Pipette in eine 15 ml konischen Röhrchen. 1 ml 2 M Sucrosevorbereiten 0,25 M Saccharose. </li><li> Dann nehmen Sie es 7,2 ml Dichtegradient Reagenz und Pipette in weiteren 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen 1,55 ml Durchflusszytometrie Staining Pufferlösung und 1,25 ml 2 M Saccharose 72% Dichtegradienten-Reagenz herzustellen und 0,25 M Sucrose. </li><li> Pipette 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz in einem runden Boden Polypropylen-Röhrchen für jede Probe. </li></ol></li></ol> 4. Gradientenzentrifugation <ol><li> Nach dem Schritt 3.7, nehmen Sie die Schläuche aus und vorsichtig den Überstand in einer fließenden Bewegung dekantieren und auch den nächsten Tropfen Flüssigkeit abgießen, die das Rohr bildet, während der Oberseite nach unten gehalten wird. Hinweis: Dieser Schritt seit dem Verlassen hinter überschüssige Flüssigkeit wichtig ist, kann genug, um die Dichte Gradienten ändern Variation der Renditen zu schaffen. Wenn das Rohr zurückversetzt ist aufrecht, ~ 200-300 ul Flüssigkeit bleibt mit dem Zellpellet. </li><li> Pipette 1 ml 0,25 M Saccharose auf die Pellet-Zelle und vorsichtig, aber kräftig pipettieren nach oben und unten zu bring die Zellen zu einer einheitlichen Suspension. Als Nächstes fügen Sie 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz (3.7.4) und erneut kräftig pipettieren um die Zellen zu mischen, um eine 36% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung der Zellsuspension. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der 72% Dichtegradienten Reagenz in einem Polypropylen-Pasteur (Transfer) Pipette. Mit gleichmäßigen Druck auf die Lampe (hält die Flüssigkeitssäule in der Spitze und verhindert Blasenbildung), legen Sie die Pasteur-Pipette auf den Boden der Zellsuspension (36% Dichtegradienten Reagenz) sanft und Entladen der 72% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung eines deutliche schwerere Schicht. </li><li> Wählen Sie die Probenröhrchen vorsichtig aufnehmen und in die Zentrifuge, die bei Raumtemperatur für diesen Schritt ist. Spin für 20-30 Minuten bei 500 x g. </li><li> Inzwischen bereiten zwei weitere Sätze von Polypropylen Rundboden-Zentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Probenkennungen. </li><li> Nach dem Schritt 4.4 abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe vorsichtig Polypropylen-Röhrchen, die mit minimalem Schütteln und setzte es abauf dem Rohrgestell. </li><li> Pick-up die erste Probenröhrchen und der entsprechenden Leerrohr. Mit einer Polypropylen-Pasteur-Pipette vorsichtig, aber gründlich mit gemessenen Sog, entfernen Sie die obere &quot;Junk-Schicht&quot; oder &quot;klebriges Material&quot; und legte sie in den leeren Rundbodenzentrifugenröhrchen. <ol><li> Gehen Sie den oberen Teil des Gradienten, bis die &quot;Leukozytenmanschette&quot; Entfernen erreicht ist (mit einem Rotstich [roten Blutkörperchen] off-weiß erscheinen). Stop Absaugen wenn eine Höhe von ca. 3 mm aus der &quot;buffy coat&quot; erreicht ist. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass dieses Zeug vollständig aus dem oberen Teil des Gradienten, bevor Sie fortfahren Sog weg ist. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine frische Pasteur-Pipette und eine neue Rundboden-Zentrifugenröhrchen und sanft die Leukozytenmanschette entfernen. Weiterhin abzusaugen 3 bis 5 mm unterhalb der buffy coat, um sicherzustellen , dass die meisten Zellen werden gesammelt und zu der 2 nd neue Rundbodenröhrchen mit geeigneten Abtastidentifizierer. </li><li> In 1-2 ml of Flow Cytometry Färbepuffers Lösung der 2. Röhre und gründlich durch Auf- und Abpipettieren mischen. </li><li> Drehen, um die Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C. A 2. Waschschritt mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung ist optional. Resuspendieren in 500 ul Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und gehen Zellen zu zählen eine Zählkammer. </li></ol> 5. Optional (Cell Labeling) <ol><li> Aliquot jeder Probe für die gleiche Anzahl von Zellen. Fügen Sie den blockierenden Antikörper bei einer Verdünnung von 0,5 g pro 10 6 Zellen (Anti - CD16 / CD32 FcR) und Inkubation auf Eis für 15 min. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Cocktail von primären Antikörpern (konjugiert an die entsprechenden Fluorophore), die bestimmt sind gut durch den Prüfer miteinander zu arbeiten, vor den eigentlichen Experimenten. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen mit PBS. Hinweis: Für die Demonstration der Niere Immunzellmarkierung für dieses Manuskript verwendeten wir ein T-lymphocyte und Makrophagen / dendritischen Zellen-Panel. Die T-Lymphozyten-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. Die Makrophagen-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Klon: BM8) APC, Anti-CD11c (Klon: N418) BV785. </li><li> Fügen Sie den Fixable Viability Fleck und lassen auf Benchtop-5 min. Waschen Sie die Zellen mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung Überschuss der fixierbaren Viability Fleck zu entfernen. </li><li> In Fixierung / Permeabilisierung Reagenz und Inkubation über Nacht bei 4 ºC. Waschen Sie in Permeabilisierung Lösung. </li><li> Für die intrazelluläre Fleck, Block wieder mit anti-CD16 / 32 FcR 10min. Fügen Sie die intrazellulären Flecken und Inkubation für 20-30 min. Wash 2x in permeabilization Lösung. </li><li> Resuspendieren in Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Laufproben durch FACS - Maschine 3,9. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßig 2 x 10 <...

Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen 6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 + Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) 5 aufrechterhalten wird, 12. Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur 5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status 3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 niedrig CD11b hoch Ly6b hohe CD206 niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer 3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen. Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen 1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 + Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 6 Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 + Zellen 1 , 5,12. Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) 1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht. Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation 4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren 16 wird die Kollagenase - Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren 2 ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn 16 angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster Laborsystem</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic Beutel</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytisches Durchflusszytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Tuben, ohne Kappe</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfleck</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Klon: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Klon: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 (Klon: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 (Klon: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Klon: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Klon: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Klon: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Klon: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Klon: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Filter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tuben 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tuben 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette feine Spitze</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Färbepufferlösung für Durchflusszytometer</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Oder gleichwertige Geräte&nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysepuffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr></tbody></table>

zuverlässig und high efficiency extraktion von nieren-immunzellen



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Die Aktivierung des Immunsystems tritt bei mehreren Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen auf. Das Immunsystem besteht sowohl aus adaptiven als auch aus angeborenen Komponenten und mehreren Zelltypen. Manchmal ist der interessierende Zelltyp in sehr geringer Anzahl unter der großen Anzahl von Gesamtzellen, die aus der Niere isoliert wurden, vorhanden. Daher ist die zuverlässige und effiziente Isolierung von mononukleären Zellpopulationen der Niere wichtig, um die immunologischen Probleme im Zusammenhang mit Nierenerkrankungen zu untersuchen. Traditionell wurde die Gewebeisolierung von mononukleären Nierenzellen durch enzymatische Verdauung unter Verwendung verschiedener Sorten und Stärken von Kollagenasen/DNAsen durchgeführt, was zu einer unterschiedlichen Anzahl lebensfähiger Immunzellen führte. Mit der Entwicklung der mechanischen Gewebedisruptoren für die Einzelzellisolierung wird in jüngster Zeit der Kollagenase-Verdauungsschritt vermieden und durch einen einfachen mechanischen Aufschluss der Nieren nach der Extraktion aus der Maus ersetzt. In dieser Arbeit demonstrieren wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von mononukleären Zellen der Niere für die tägliche Immunzellextraktion. Des Weiteren zeigen wir ein Beispiel für die Analyse von Immunzellen in der Niere. Wichtig ist, dass diese Technik an andere weiche und nichtfaserige Gewebe wie Leber und Gehirn angepasst werden kann.

Die Anzahl der Platten, die von der Anzahl der Immunzellen kann ausgeführt abhängt, die aus den Nieren zuverlässig extrahiert werden kann. Hier zeigen wir die Möglichkeit, zwei Platten zu laufen, eine für T-Lymphozyten und eine für Makrophagen / dendritischen Zellen. Auf der T-Lymphozyten - Panel, wir in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Muster und beschreiben die Bevölkerung von Interesse schauen zuerst , wie in Abbildung 1 (oben links Punkt - Diagramm...

Techniken, die zuverlässig und effizient für die Isolierung von Nierenimmunzellen sind, werden für nachgelagerte Anwendungen benötigt. Dies erfordert die Markierung einer kleinen Anzahl von Nierenimmunzellen mit Oberflächenantikörpern. Im Folgenden beschreiben wir eine prägnante Methode zur Isolierung von Immunzellen der Niere, mit der dieses Ziel scheinbar erreicht wird.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Isolierung von Nieren-Immunzellen besteht darin, lebensfähige Einzelzell-Suspensionen von Nieren-Immunzellen in ausreichender Menge für die anschließende Analyse mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur Kollagenase-Digestion ist die zuverlässige und kostengünstige Isolierung einer großen Anzahl von Nieren-Immunzellen für die experimentelle Analyse in nachfolgenden Versuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunbiologie der Niere zu beantworten. Zum Beispiel, welche Teilmenge der Immunzellen der Niere die Sekretion von Zytokinen oder Chemokinen bei einer bestimmten Nierenerkrankung reguliert. Diese Methode wird anhand der Isolierung der Immunzellen aus der Niere veranschaulicht. Sie kann jedoch leicht angepasst werden, um Zellen aus anderen Systemen wie Leber oder Gehirn zu isolieren.Heute werden wir eine Methode zur Gewinnung von Nieren-Immunzellen demonstrieren. Die Prozedur wird von Alex Meuth, einem wissenschaftlichen Spezialisten aus meinem Labor, vorgeführt. Nachdem das Fehlen einer Reaktion auf eine Zehenquetschung überprüft wurde, desinfizieren Sie den ventralen Bauchbereich einer anästhesierten Maus mit 70 % Ethanol.Danach mit einer Schere die Bauchhöhle öffnen und die Bauchorgane zur linken Seite des Tieres umklappen. Mit einer Ein-Kubikzentimeter-Spritze, die mit einer gebogenen 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, das Blut aus der unteren Hohlvene in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln, das 10 Mikroliter Kalium-EDTA enthält. Anschließend einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof setzen und mit einer Pinzette vorsichtig das Herz fassen.Danach eine Nadel mit einer Größe von 21 bis 25 Gauge, die an eine mit 20 bis 30 Milliliter eiskaltem PBS gefüllte 50-cc-Spritze angeschlossen ist, an der Spitze des linken Ventrikels einführen und den Ventrikel langsam ein bis zwei Minuten lang perfundieren. Nach den ersten Millilitern PBS wird sich das Herz entfärben. Eine Entfärbung der Leber zeigt an, dass das Blut über den venösen Rückfluss durch die Vena cava über die Leber ausgespült wird.Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die rechte Niere von den anhängenden Blutgefäßen, dem Fettgewebe und den Nebennieren zu dissezieren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Nierenkapsel mit der Pinzette und wiegen Sie die Niere entsprechend den experimentellen Anforderungen. Überführen Sie danach die Niere in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das ein Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer auf Eis enthält.Beschriften Sie einen Homogenisierbeutel mit einem Fassungsvermögen von fünf bis 80 Milliliter mit den entsprechenden Probenkennzeichnungsangaben und entsorgen Sie den inneren Sieb. Füllen Sie den Beutel mit fünf Milliliter eiskaltem Färbepuffer für die Durchflusszytometrie und geben Sie die Niere in den Beutel. Falten Sie den Homogenisierbeutel zur Hälfte, sodass sich die Niere in der einen Hälfte untergetaucht im Puffer befindet und die andere Hälfte darübergefaltet ist.Platzieren Sie den gefalteten Homogenisierbeutel mit der Niere zur Paddelseite hin nahe der unteren Kante, wobei darauf zu achten ist, dass das untere Ende des Beutels nicht unter den unteren Rand der Paddel rutscht. Überprüfen Sie anschließend visuell, ob die Nieren ausreichend homogenisiert sind und keine größeren Stücke sichtbar sind. Falls die Nieren durch das Gerät nicht ausreichend zerkleinert wurden, bringen Sie die Paddel näher an die Wand des Homogenisiergeräts heran.Danach eine 100-Mikrometer-Zellsieb in ein einzelnes 50-Milliliter-Konischgefäß pro Probe auf Eis geben und die Homogenate vollständig durch die Siebe filtrieren. Wenn alle Proben dissoziiert wurden, die Röhrchen mit den Sieben zentrifugieren, um sicherzustellen, dass alle Gewebe vollständig filtriert sind, und die Röhrchen danach wieder auf Eis stellen. Anschließend ein gleiches Volumen an RBC-Lysepuffer zu jeder Probe hinzufügen und mehrmals auf- und abpipettieren, um homogene Zellsuspensionen zu erzeugen.Nach fünf Minuten pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig das Überstand in einer einzigen, fließenden Bewegung aus jedem Röhrchen, wobei der letzte Tropfen Flüssigkeit abgegossen wird, während das Röhrchen noch kopfüber ist. Um die Nieren-Immunzellen zu isolieren, geben Sie je eine Milliliter 72%-Dichtegradient-Reagenz in ein rundbodiges Polypropylenröhrchen pro Probe. Als Nächstes pipettieren Sie vorsichtig, aber kräftig, ein Milliliter 0,25-molare Saccharose in jedes Pellet, um Einzelzell-Suspensionen zu erhalten, und geben Sie die Zellen zu den Dichtegradienten-Lösungen hinzu.Anschießend vorsichtig ein Milliliter 72%igen Dichtegradientenreagenz unter jede Zellsuspension schichten, um deutliche schwere Schichten zu bilden. Sicherstellen, dass die Nierenzellen in jedem Gefäß gleichmäßig in dem 36%igen Percoll-Gradienten suspendiert sind. Danach vorsichtig den 72%igen Percoll unter den 36%igen Percoll schichten, um klare 36%- und 72%-Schichten zu bilden.Stellen Sie die Röhrchen vorsichtig in die Zentrifuge zur Dichtegradiententrennung. Anschließend übertragen Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Polypropylen vorsichtig, aber vollständig alle Flüssigkeit bis auf die letzten drei Millimeter der oberen Junk-Schichten in einzelne leere Rundboden-Zentrifugenröhrchen. Danach übertragen Sie mit einer frischen Pasteur-Pipette die Buffy Coats vorsichtig in neue Rundboden-Zentrifugenröhrchen, bis drei bis fünf Millimeter unterhalb der Buffy Coat entfernt wurden, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen aus jeder Probe gesammelt wurden.Mischen Sie anschließend ein bis zwei Milliliter Flow-Zytometrie-Färbepuffer in die Buffy-Coats und zentrifugieren Sie die Zellen. Resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikroliter Flow-Zytometrie-Färbepuffer zur Zellzählung und verteilen Sie die Proben gleichmäßig auf eine dunkle, U-förmige 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit blockierendem Antikörper.Bereiten Sie anschließend einen Antikörper-Cocktail für jeden zu testenden Immunzelltyp vor. Zum Beispiel Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen, und inkubieren Sie die Zellen im entsprechenden Antikörper-Cocktail 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Wählen Sie nach der Auswahl der interessierenden Zellpopulation anhand von Forward- und Side-Scatter die nicht lebensfähigen Zellen aus.Typischerweise exprimieren zwei bis 18 % der gesamten Nieren-Immunzellen CD45. Um die Effektor- und zytotoxischen T-Zellen zu isolieren, können diese aus dem Knochenmark stammenden hämatopoetischen Zellen beispielsweise jeweils über CD4 und CD8 selektiert werden. Eine weitere Charakterisierung der CD4-positiven Zellen zeigt eine Population von etwa acht bis 14 % FoxP3-positiver regulatorischer T-Zellen, die sich in Populationen unterteilen lässt, die CD44 bzw. CD127 exprimieren.Zur Auswertung des myeloischen Zellpanels können die CD45-positiven Zellen anhand ihrer Ly6G-Expression selektiert werden, um zunächst die Neutrophilen auszuschließen. Anschließend können CD11b und F4/80 verwendet werden, um die Ly6C-positiven Zellen weiter in die Populationen infiltrierender Makrophagen und dendritischer Zellen aufzuteilen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können anschließende Experimente, wie die Isolierung von CD11b- oder CD4-positiven Zellen, durchgeführt werden, um Fragen zur Zytokinausschüttung durch diese spezifische Zellsubpopulation zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Nieren perfundiert, eine vitale Nierenzell-Suspension herstellt, Nieren-Immunzellen durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und die Nierenzellen für die Durchflusszytometrie markiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Nierenextraktion aus dem retroperitonealen Raum der Maus. Die entnommene Niere kann weiter mikropräpariert werden, um eine intakte Niere ohne Nierenkapsel und die umgebende Fettschicht zu erhalten.

Extraktion einer intakten Niere aus einer Maus: Eine Technik zur Gewinnung einer Niere ohne Nierenkapsel aus Mausmodellen

DNabT Zellen sind selten unter peripheren T-Zellen; aber reichlich sind sie in bestimmten Nicht-lymphatischen Gewebe. Schwierigkeitsgrad der Isolierung DN T-Zellen von nicht-lymphatischen Gewebe behindert ihre Funktionsanalyse trotz steigender erkannt pathophysiologische Bedeutung. Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von hoch gereinigten DN T-Zellen aus murinen Niere.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

Dieses Protokoll beschreibt die Dezellularisierung von Sprague-Dawley-Rattennieren durch antegrade Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem, wodurch azelluläre extrazelluläre Nierenmatrizen entstehen, die als Vorlagen für die Wiederbestückung mit menschlichen Nierenepithelzellen dienen. Die Rezellularisierung und Verwendung des Resazurin-Perfusionsassays zur Überwachung des Wachstums wird in speziell entwickelten Perfusionsbioreaktoren durchgeführt.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

Hier präsentieren wir eine neue klinische Grade Isolation und Kultur Methode zur Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen (kPSCs) anhand der gesamten Organ Perfusion mit Verdauungsenzymen und NG2-Zelle Bereicherung. Mit dieser Methode ist es möglich, ausreichende Zellzahlen für Zelltherapie erwerben.

Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Das Hauptaugenmerk dieses Protokolls ist es, tragfähige primäre Glomeruli Kulturen mit minimalen Verunreinigungen für den Einsatz in einer Vielzahl von downstream-Anwendungen effizient zu isolieren. Die isolierten Glomeruli können strukturellen Beziehungen zwischen Komponente Zelltypen zu behalten und kultivierten ex Vivo für kurze Zeit.

Eine effiziente Methode der Absiebung, intakten Glomeruli von Erwachsenen Ratte Niere zu isolieren

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

microRNAs sind an der Pathogenese der IgA-Nephropathie beteiligt. Wir haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Diese neue Methode wird es erleichtern, die Beteiligung von miRNAs an der IgA-Nephropathie zu überprüfen.

Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Hier wird über ein Protokoll für die selektive Ablation von Nierenmakrophagen berichtet, um deren Regeneration mit dem humanen CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug zu untersuchen. Diese Methode ist auch anwendbar, um die Funktion und Regeneration der anderen Zellpopulationen in der Niere, der Leber und dem Fettgewebe zu untersuchen.

Schnelle Depletion von Nierenmakrophagen mit humanem CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug

In dieser Studie wurde ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von murinen Mesangialzellen (MCs) und deren ex vivo Zellkultur entwickelt. Diese Zellen können mehrfach passageiert, eingefroren, wiederbelebt und kultiviert werden, ohne das Zellwachstum oder die Proteinexpression zu beeinträchtigen.

Optimierung der Isolierung und Reinigung von murinen glomerulären Mesangialzellen

Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Nieren-Immunzellen für die mehrfarbige Durchflusszytometrie. Diese kostengünstige Technik liefert lebensfähige Einzelzellsuspensionen in ausreichender Menge.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

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