Name: Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Erfahren Sie ein effizientes Protokoll zur genetischen Transformation und gezielten Gendeletion in Yarrowia lipolytica Po1g. Die KU70-Deletion erhöht die homologe Rekombination für Biokraftstoff- und Biochemieproduktion.

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Nationalen Umweltagentur von Singapur (ETRP 1.201.102), die Competitive Research Program der National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur ( 1324004108), globale F &amp; E-Projekt Programm, das Ministerium für Wissensökonomie, der Republik Korea (N0000677), die Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) und der synthetischen Biologie Initiative der National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

1. Erzeugung des Y. lipolytica KU70 Deletionsstamms <ol><li> Der Bau der Disruptionskassette Anmerkung: Siehe Tabelle 1 für alle Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationen verwendet. <ol><li> Design Primer 20 der PCR die LEU2 Expressionskassette amplifizieren (siehe Tabelle 1) von einer Y. lipolytica Expressionsvektor und LoxP - Stellen in den 5&#39;- und 3&#39; - Enden der LEU2 Kassette mit einem langen Vorwärtsprimer (# 1; Tabelle 1) einzuführen , und einem langen Rückwärtsprimer (# 2; Tabelle 1), respectively. Um eine zusätzliche Restriktionsstelle für nachfolgende Schritte des Klonprozess einzuführen, fügen Sie eine Einschränkung Bam HALLO Website in Primer # 1. </li><li> Führen PCR unter Verwendung eines High-fidelity DNA - Polymerase , wie in Tabelle 2 aufgeführt. </li><li> Reinige das PCR-Produkt LoxP--Promotor-LEU2-Terminator-loxP Kassette ein PCR-purificatio mitn-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Hinzufügen , 3&#39;-A - Überhänge an den gereinigten PCR - Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers 21. Verwendung von T4 - DNA - Ligase die A-tailed PCR - Produkt in einen TA - Klonierungsvektor abzubinden das Plasmid T-LEU2 gemäß Tabelle 3 zu ergeben. </li><li> PCR das 1 kb 5&#39; - stromaufwärts - Sequenz der Primer # 3 / # 4 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA 22 gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2 - Plasmid mit Sac II und Bam HALLO Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Sac II / Bam HALLO - Stellen von T-LEU2 abzubinden die zu ergebenPlasmid T-LEU2-5E gemäß Tabelle 3. </li></ol></li><li> PCR das 1 kb 3 &#39;Downstream - Sequenz der Primer # 5 / # 6 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA 22 gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2-5E Plasmid mit Not I und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4. <ol><li> Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Dann abzubinden das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Not I / Nde I - Stellen von T-LEU2-5E 3 das Plasmid T-KO unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle zu erhalten. </li></ol></li><li> Digest das Plasmid T-KO mit Sac II und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4 die Disruptionskassette zu erzeugen (Abbildung 1 </strong&gt;). Reinige die verdauten DNA-Fragmente unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Kompetente Zellpräparation und Transformation von Y. lipolytica Po1g Stamm <ol><li> Kompetente Zellpräparation <ol><li> Impfen eine Kolonie von Y. lipolytica Po1g Stamm aus einem frischen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Platte in 10 ml YPD - Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose und 50 mM Citrat - Puffer pH 4,0) in einem 100 ml Kolben. Inkubieren in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 UpM für 20 Stunden bis zur Sättigung (eine OD 600 von etwa 15, unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen). </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch 5 min bei 5000 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Waschen der Zellen mit 20 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) und pelletieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.1.2 beschrieben. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 0,1 M Lithiumacetat (pH 6,0, eingestellt mit Essigsäure) und Inkubation bei Raum tempe für 10 minrature. </li><li> Aliquot der kompetenten Zellen (100 ul) in sterile 1,5 ml-Röhrchen. Fahren Sie mit den Transformationsschritte unten sofort, oder fügen Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 25% (v / v) und bei -80 ° C für die Langzeitlagerung. </li></ol></li><li> Transformation <ol><li> vorsichtig mischen 10 ul denaturiertes Lachssperma-DNA (10 mg / ml) und 1-5 ug der gereinigten Unterbrechungskassette zusammen mit 100 ul kompetenter Zellen und Inkubieren bei 30 ° C für 15 min. </li><li> In 700 ul 40% Polyethylenglykol (PEG) -4000 (gelöst in 0,1 M Lithiumacetat pH 6,0), gut mischen und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm für 60 min. Hinweis: Es ist wichtig, zu verwenden PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000, anstelle von PEG-3350 (typischerweise bei der Transformation von herkömmlichen Hefe verwendet). </li><li> Hitzeschock Das Transformationsgemisch durch das Rohr in einem 39 ° C Wasserbad für 60 min platziert. </li><li> 1 ml YPD-Medium undbei 30 ° C und 225 Upm für 2 Stunden erholen. Zentrifuge bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml TE-Puffer. </li><li> Repellet die Zellen durch Zentrifugation bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur und der Überstand verworfen. Resuspendieren des Pellets in 100 ul Puffer TE und Platte auf selektiven Platten (zB Leucin-defizienten Platten), und Inkubation für 2-3 Tage bei 30 ° C. </li><li> Pick 4 bis 10 Einzelkolonien und inokulieren getrennt in 2 ml YPD-Medium. Inkubieren über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute. Identifizierung positiver Kolonien durch PCR - Analyse der genomischen DNA aus den Trans 22 gemäß Tabelle 5 unter Verwendung von zwei Sätzen von Primern # 55 / # 56 und # 56 / # 57, respectively. Hinweis: Die nicht linearisiert ich pYLEX1 Vektor in Y. umgewandelt wird lipolytica Po1g kompetente Zellen , um die Transformationseffizienz zu bestimmen , indem die Zahl Zählenkoloniebildenden Einheiten (cfu) pro &amp; mgr; g Plasmid - DNA verwendet 23. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Marker-Rettung <ol><li> Der Bau des Cre-Expressionsplasmid <ol><li> Der Bau der pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH <ol><li> Design - Primer 20 der PCR , die offene Leserahmen von cre und hph verstärken. Fügen Sie ein zusätzliches Adeninnukleotid vor den Start - Codons in den Forward - Primer # 82 und 84 #, und fügen Sie KpnI Restriktionsstellen stromabwärts der Stop - Codons in den Reverse - Primern # 83 und # 85 PCR die offene Leserahmen von cre verstärken und hph von pSH69 (Zugangsnummer HQ412578) 24 gemäß Tabelle 2. </li><li> Reinige sowohl cre und hph - Fragmente eine PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Digest sowohl die gereinigten cre und hph Fragmente mit KpnI wie pro Tabl Enzyme 4. Verdoppeln Sie die pYLEX1 Plasmid mit Pml I und Kpn I Enzyme verdauen gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . </li><li> Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 die gereinigten und verdaut cre und hph Fragmente PML I / KpnI - Stellen des Y. abzubinden lipolytica Expressionsvektor, wodurch man pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH sind. </li></ol></li><li> Der Bau der pSL16-CRE-HPH <ol><li> PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette des cre von pYLEX1-CRE Primern 86 # / # 87 flankieren die Sal I / Pst I - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit Reinige Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers . <ol><li> Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CEN1-1 (227) Plasmid 25 mit Sal I undPst I - Enzyme gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR - Produkts in pSL16-CEN1-1 (227) an den entsprechenden Stellen pSL16-CRE unter Verwendung von T4 DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu schaffen. </li></ol></li><li> PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette von hph von pYLEX1-HPH Primern # 88 / # 89 flankieren die Xho I / Bgl II - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR - Purification - Kit nach den Anweisungen des Herstellers . <ol><li> Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CRE Plasmids mit Xho I und Bgl II - Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR-Produkts in pSL16-CRE an dem entsprechendenWebsites pSL16-CRE-HPH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu erzeugen. Anmerkung: Die resultierende Cre Expressionsplasmids pSL16-CRE-HPH, einen selektierbaren Hygromycin B Marker trägt und eine Zentromer und episomal replizierender Vektor (Abbildung 2). </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher , alle Konstrukte durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen (zB Sal I / Pst I, den Einsatz aus dem Vektor auszuschneiden) gemäß Tabelle 4. </li></ol></li></ol></li><li> Cre-Rekombinase-vermittelte Markerrettung <ol><li> Verwandeln pSL16-CRE-HPH in kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm nach dem Transformationsprotokoll in Punkt 1.2 beschriebenen. Platte transformierten Zellen auf YPD und Hygromycin B (YPDH) -Platten (enthaltend 400 ug / ml Hygromycin B), und Inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li><li> Führen Kolonie - PCR gemäß Tabelle 5 unter Verwendung der Primer # 84 / # 85 zu identifizieren positiveKolonien pSL16-CRE-HPH-Plasmid nach der Transformation enthält. Anmerkung: Der Vorwärts - Primer # 84 und der Rückwärts - Primer # 85 sind innerhalb der kodierenden Region des hph - Gens befindet (Tabelle 1). Nur positive Klone, die ein spezifisches PCR-Produkt in der PCR-Reaktion zu erzeugen. </li><li> Wählen Sie einen positiven Klon und impfen in 2 ml YPDH Medium und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm über Nacht bis zur Sättigung. Messen Sie die Zelle OD 600 mit einem Spektralphotometer. Ernte der Zellen bei einer OD 600 von ~ 15. Zentrifuge bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur und wäscht einmal mit 2 ml sterilem Wasser. </li><li> Re-inokulieren Zellen in 2 ml YPD - Medium mit einer anfänglichen OD 600 von 0,1 und lassen die Zellen über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Upm wachsen. Streak die über Nacht Zellkultur auf YPD - Platten einzelne Kolonien 23 zu isolieren. Replica Platte Kolonien auf YPD, YPDH und Leucin-defizienten Platten 23 </sup&gt;. Hinweis: Die Kolonien , die sowohl LEU2 - Marker und pSL16-CRE-HPH Plasmid , das nur auf YPD - Platten (Abbildung 3) verloren haben , wachsen können. </li></ol></li></ol> 3. Löschen von Alkoholdehydrogenase und Alkohol-Oxidase-Gene <ol><li> Führen Sie eine Suche auf dem Y. lipolytica Genomdatenbank des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) mit Hilfe der Gen - Kandidaten für die 26 Löschung zu identifizieren. Geben Sie die Proteinsequenz von S. cerevisiae Alkoholdehydrogenase I in BLAST - Suchwerkzeug (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). Hinweis: Die BLAST - Suchwerkzeug die ähnlichsten Proteinsequenzen in der Y. zurück lipolytica Genomdatenbank. </li><li> Konstruiere die Löschkassetten durch PCR mit den Primern # 7 und # 56 (Tabelle 1), und führen Restriktionsenzym - Verdau und Ligationsreaktionen unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben in 1.1 beschrieben. </li><li> PrepNach dem Protokoll in Punkt 1.2 beschriebenen positiven Kolonien # 55, # 58 bis 81 # mit Primern zu identifizieren (Tabelle 1) sind kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm, Umwandlungen durchführen und PCR durchführen. Anmerkung: Als Beispiel wird das Verfahren für die YALI0E17787g Gendeletion ist in den 4 und 5 beschrieben. Die Wirkungen von 1 kb und 2 kb lange homologe Region auf homologe Rekombination Rate berichtet. </li></ol>

<ol><li>Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJim%C3%A9nez-Bremont%2C+JF+%22Development+and+dimorphism+of+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.+Dimorphic+fungi%3A+Their+importance+as+models+for+differentiation+and+fungal+pathogenesis%22">Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis</a>. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).</li>
<li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoelho%2C+M+%22Yarrowia+lipolytica%3A+an+industrial+workhorse.+Current+research%2C+technology+and+education+topics+in+applied+microbiology+and+microbial+biotechnology%22">Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology</a>. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).</li>
<li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p%2C+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790(2013).</li>
<li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li>
<li>Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase%3A+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Domìnguez, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li>
<li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li>
<li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%3A+a+review+of+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Micro%2B%22%5BJournal%5D)">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li>
<li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+the+%CE%B2-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Energ%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li>
<li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li>
<li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li>
<li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li>
<li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f%2C+a+commonly+used+metabolic+engineering+host%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li>
<li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li>
<li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbial.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li>
<li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li>
<li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li>
<li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Notes%22%5BJournal%5D)">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast">http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast</a> (2016).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
<li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delete+and+repeat%3A+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li>
<li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li>
<li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li>
<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die erfolg...

Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen 1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie 3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel 6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine bekannte ölige Hefe fähig ist natürlich Lipide bei hohen Mengen, dh bis zu 70% des Zelltrockengewicht 10 ansammeln. Es kann auch ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen für das Wachstum, einschließlich verschiedener Arten von Rückständen in Abfallressourcen als Nährstoffe 11,12,13 nutzen. All diese einzigartigen Eigenschaften machen Y. lipolytica sehr attraktiv fürverschiedene biotechnologische Anwendungen. Obwohl die gesamte Genomsequenz des Y. lipolytica hat 14,15, genetische Manipulation dieser unkonventionellen Hefe veröffentlicht worden ist komplexer als andere Hefearten. Erstens Transformation dieser Hefearten ist viel weniger effizient aufgrund des Fehlens eines stabilen und effizienten genetischen Transformationssystem 16,17. Zweitens mühselige genomische Integration von linearen Expressionskassetten für die Expression von Genen von Interesse allgemein verwendet , da kein natürlicher episomal Plasmid System in dieser Hefe 18 gefunden. Drittens Generation von genetischen Knock-Outs und Knock-Ins begrenzt, da das Gen Effizienz durch genaue homologe Rekombination in dieser Hefe - Targeting ist gering , und die meisten Integrationsereignisse auftreten , durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) 19. In dieser Studie berichten wir einen optimierten Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica </em&gt; Po1g Stamm, der einfach, schnell, effizient und reproduzierbar ist. Um die Frequenz von präzisen homologe Rekombination steigern, wir löschte das KU70 - Gen, das ein Schlüsselenzym in dem NHEJ Stoffwechselweg kodiert. Durch die optimierte Transformationsprotokoll verwendet und eine lineare Knockout - Kassette transformiert enthält flankierenden Homologiebereiche von 1 kb, das KU70 Gen des Y. lipolytica Po1g wurde erfolgreich gelöscht. Die Robustheit dieser Gen - Deletion Methodik wurde dann durch gezielte Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase - Gene in der Po1g KU70 Δ Stamm demonstriert. Es wurde beobachtet , dass die KU70 Deletionsstamms eine wesentlich höhere Effizienz der homologen Rekombination vermittelten Gen zeigten Targeting als die des Wildtyp - Po1g Stamm. Zusätzlich wurde eine replikative Cre Expressionsplasmid den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt, konstruiert marker rescue auszuführen. Die Markerrettung erleichtert mehrere Runden von Gen in th Targetinge Gen-Deletionsmutanten erhalten. Neben Gen - Deletion, unser Protokoll für die genetische Transformation und Gen - Deletion hier beschrieben sind, können auf Gene auf bestimmte Loci einfügen angewendet werden, und die ortsspezifische Mutationen in den Y. einführen lipolytica - Genoms.

<table><tbody><tr><td>Reagenz/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotid-Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmol DNA-Oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica Stamm Po1g</td><td>Hefe Biotech</td><td></td><td>Leucin auxotrophes Derivat des Wildtyp-Stammes W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vector pYLEX1</td><td>Yeast Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica Expressionsvektor</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Für die Klonierung und Vermehrung von Plasmiden</td></tr><tr><td>pGEM-T-Vektor&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA Klonierungsvektor</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Für die Plasmidisolierung</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extrahieren Sie DNA-Fragmente aus Agarosegelen und reinigen Sie PCR-Produkte aus einer Amplifikationsreaktion</td></tr><tr><td>Die iProof High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase& nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA-Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA-Leiter</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Lachs Sperma DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen (425-600 &micro; m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA Loading Farbstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Hefeextrakt</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1. Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB ohne Aminosäuren</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Bouillon</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Stationär-/Schüttel-Inkubator</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Thermoschüttler</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Imager</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

genetic engineering eines unconventional hefe für erneuerbare biokraftstoff- und biochemie produktion

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe - Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 - Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen - Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 - Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen - Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 - Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 - Knockout - Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 - Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen - Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.

Die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in das Genom von Y. in die pBR Andockplattform eingefügt lipolytica Po1g Stamm von 27 eine einzige Crossover - Rekombination durchführen. Durch die schnelle chemische Transformationsverfahren unter Verwendung der in dieser Studie festgestellt, die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in den Wildtyp - Po1g Stamm bei einer Transformationseffizienz von&gt; 100 KBE / ug D...

Wir berichten hier über Methoden zur molekulargenetischen Manipulation des Yarrowia lipolytica Po1g-Stammes zur Verbesserung der Gendeletionseffizienz. Die daraus resultierenden gentechnisch veränderten Y. lipolytica-Stämme haben potenzielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und biochemischen Produktion.

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, effektive Methoden der Gentechnik für eine unkonventionelle Hefeart zu entwickeln, einschließlich der Konstruktion von transformierender DNA, der DNA-Transformation, der Selektion von Transformanten und der gezielten Genlöschung mittels homologer Rekombination. Wir haben eine hochentwickelte Methode zur Genlöschung in dem Stamm Yarrowia lipolytica PO1G etabliert, die potenzielle Anwendungen in der Biofuel- und Biotreibstoffproduktion sowie der chemischen Bio-Produktion hat. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der PCR-vermittelten Genstörung liegt darin, dass große Mengen an Genlöschungs-Kassetten sowie eine breite Palette auswählbarer Marker zur Verfügung stehen.In dieser Studie berichten wir über ein genetisches Transformationsprotokoll für den Yarrowia lipolytica-PO1G-Stamm, das effizient, einfach, etabliert und reproduzierbar ist. Der in dieser Studie konstruierte Yarrowia lipolytica-PO1G-KU70-Deletionsstamm weist eine sehr hohe Frequenz homologer Rekombination auf, wodurch schnellere und einfachere Screenings gezielter Gen-Deletionen ermöglicht werden. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, mittels PCR die LEU2-Expressionskassette von einem Y. lipolytica-Expressionsvektor zu amplifizieren und LoxP-Sequenzen in die 5'- und 3'-Enden der LEU2-Kassette einzuführen.Eine BamHI-Restriktionsstelle wird ebenfalls im ersten Primer für nachfolgende Schritte des Klonierungsprozesses eingefügt. Nach der Reinigung der LoxP-Promotor-LEU2-Terminator-LoxP-Kassette werden drei 3'-A-Überhänge an das gereinigte PCR-Produkt angehängt. Das mit A überhangs versehene PCR-Produkt wird anschließend in einen TA-Klonierungsvektor ligiert, um das Plasmid T-LEU2 zu erhalten.Der zweite PCR-Schritt dient dazu, die eine Kilobase lange 5'-aufwärts gerichtete Sequenz des KU70-Gens unter Verwendung der Primer drei und vier aus der genomischen DNA von Y.lipolytica PO1G zu amplifizieren. Danach erfolgt ein Doppelverdau sowohl des gereinigten PCR-Produkts als auch des T-LEU2-Plasmids mit den Enzymen SacII und BamHI, gefolgt von einer Ligierung des gereinigten und verdauten PCR-Produkts in die SacII-BamHI-Stellen von T-LEU2, um das Plasmid T-LEU2-5E zu erhalten. Der dritte PCR-Schritt dient dazu, die eine Kilobase lange 3'-abwärts gerichtete Sequenz des KU70-Gens unter Verwendung der Primer fünf und sechs aus der genomischen DNA von Y.lipolytica PO1G zu amplifizieren.Dann verdauen Sie sowohl das gereinigte PCR-Produkt als auch das T-LEU2-53-Plasmid mit den NotI- und NdeI-Enzymen und ligieren das gereinigte und verdauene PCR-Produkt in die NotI-NdeI-Stellen von T-LEU2-5E, um das T-KO-Plasmid zu erhalten. Verdauen Sie abschließend das T-KO-Plasmid mit den SacII- und NdeI-Enzymen, um die Insertionskassette zu erzeugen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie kompetente Y.lipolytica-PO1G-Zellen herstellen.Inokulieren Sie eine Kolonie des Y.lipolytica-PO1g-Stamms von einer frischen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose- oder YPD-Platte in 10 Milliliter YPD-Medium in einer 100-Milliliter-Flasche. Inkubieren Sie im Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 225 U/min für 20 Stunden bis zur Sättigung. Am folgenden Tag pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 5000 × g bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Zellen mit 20 Milliliter TE-Puffer und pelletieren Sie die Zellen erneut. Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter 0,1 molarer Lithiumacetatlösung und inkubieren sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Teilen Sie die kompetenten Zellen in 100-Mikroliter-Aliquote in sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchen auf.Fahren Sie unverzüglich mit dem Transformationsverfahren fort, indem Sie vorsichtig 10 Mikroliter denaturierter Lachssperma-DNA und ein bis fünf Mikrogramm der gereinigten Disruptionskassette mit 100 Mikrolitern kompetenter Zellen vermischen. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für 15 Minuten. Geben Sie 700 Mikroliter 40 %igen Polyethylenglykol 1000 hinzu.Gut mischen und 60 Minuten lang im schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 225 U/min inkubieren. Anschließend wird das Transformationsgemisch durch Platzieren des Reaktionsgefäßes in ein Wasserbad bei 39 Grad Celsius für 60 Minuten erhitzt. Nach 60 Minuten ein Milliliter YPD-Medium zum Reaktionsgefäß hinzufügen und die Zellen zwei Stunden bei 30 Grad Celsius und 225 U/min regenerieren lassen.Zentrifugieren Sie bei 9000 × g für eine Minute bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter TE-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand.Suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern TE-Puffer und platzieren Sie es auf eine leucindefiziente Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage. Vor der Durchführung der CRE-Rekombinase-vermittelten Markerrückgewinnung wird das CRE-Expressionsplasmid wie im Textprotokoll beschrieben konstruiert.Zu den Merkmalen dieses episomal replizierenden Plasmids gehören ein CRE-Rekombinase-Gen, ein Hygromycin-B-Resistenzmarker und ein Ampicillin-Resistenzgen. Um dieses Verfahren zu beginnen, transformieren Sie das CRE-Expressionsplasmid gemäß dem zuvor gezeigten Transformationsprotokoll in kompetente Zellen des KU70-Knockout-Stamms. Impfen Sie die transformierten Zellen auf YPD-Platten mit Hygromycin B aus und inkubieren Sie sie bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage.Nach Durchführung der Kolonie-PCR gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren zur Identifizierung positiver Kolonien, wählen Sie einen positiven Klon aus, um zwei Milliliter YPDH-Medium anzusetzen, und inkubieren Sie diesen über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 225 U/min bis zur Sättigung. Am folgenden Tag bestimmen Sie die OD 600 der Kultur mithilfe eines Spektrophotometers. Wenn die Zellen eine OD 600 von etwa 15 erreicht haben, werden sie durch Zentrifugation bei 5000 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur gewonnen.Entfernen Sie den Überstand, geben Sie zwei Milliliter sterilem Wasser hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in YPD-Medium. Inokulieren Sie die Zellen erneut in zwei Milliliter YPD-Medium mit einem initialen OD 600 von 0,1 und lassen Sie die Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 30 Grad Celsius und 225 U/min wachsen.Am folgenden Tag die Übernachtkultur auf YPD-Platten ausstreichen, um Einzelkolonien zu isolieren. Bei 30 °C inkubieren, bis Kolonien sichtbar werden. Kolonien mittels Abdruckverfahren auf YPD-, YPDH- und leucindefiziente Platten übertragen.Die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Ein Schema des KU70-Knockout-Plasmids ist dargestellt. Der Verdau des Plasmids mit den Enzymen SacII und NdeI erzeugt die Disruptions-Kassette.Die Gelelektrophorese bestätigt das Vorhandensein eines 4,3 Kilobasen großen Bands, welches der erwarteten Größe der Insertionskassette entspricht. Die Deletion des KU70-Gens in Y. lipolytica PO1G wird mittels PCR bestätigt. Die Gelen in den Spuren eins bis 10 enthalten PCR-Produkte, die aus der genomischen DNA von Transformanten amplifiziert wurden, während Spur 11 PCR-Produkte des Wildtyp-Stamms enthält.Die Bahn sieben zeigt einen positiven Knockout, während die Bahn eins ein falsch-positives Ergebnis darstellt. Das Selektionsmarkergen im KU70-Knockout-Stamm wurde schließlich durch die Expression der CRE-Rekombinase entfernt. Positiv getestete Transformanten ohne Markergen wurden anhand ihres Wachstums auf einer YPD-Platte verifiziert.Um die Erhöhung der Genlöschungsrate zu überprüfen, wurden nach der Deletion des KU70-Gens 11 Zielgene einzeln mit demselben Verfahren im KU70-Knockout-Stamm gelöscht. Jede Genstörung wurde mittels PCR bestätigt, und hier wird ein repräsentatives Ergebnis gezeigt, wobei die Kanäle eins, zwei und vier als positive Knockouts identifiziert wurden. Der Yarrowia lipolytica PO1G KU70-Deletions-Platin-Stamm bietet ein effizienteres System und eine bessere Wahl für Anwendungen in der Pathway-Engineering und Stammoptimierung bei der Konstruktion weiterer chromosomaler Deletionsmutanten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein umfassendes Verständnis der gezielten Strategie zur Deletion eines einzelnen Gens mittels homologer Rekombination in den Yarrowia lipolytica-PO1G-Zellen besitzen.

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Research

Forschung

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Genetics

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