Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen nativen makromolekularen Komplex in geeigneter Qualität für biophysikalische Untersuchungen zu reinigen. Dieses Protokoll dient nicht nur als Methode zur Reinigung eines Komplexes, sondern auch als detaillierte Anleitung zur Beurteilung der strukturellen Qualität der Probe während der Reinigung. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es möglich ist, eine native Assemblierung unter nahezu physiologischen Pufferbedingungen einfach und schnell zu reinigen, um so eine homogene Zusammensetzung sicherzustellen.

Nach der Zentrifugation von S.cerevisiae-Zellen und dem Absaugen des Überstands gemäß dem Textprotokoll zwei Milliliter gekühlten Lysepuffer hinzufügen und den Pellet durch Schwenken und/oder unter Verwendung einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette suspendieren. Die Zellsuspension in ein leeres 50-Milliliter-Kegel-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen, das auf Eis steht, überführen. Anschließend jedes Zentrifugenglas mit weiteren zwei Millilitern gekühltem Lysepuffer ausspülen und die Lösung dem 50-Milliliter-Röhrchen hinzufügen.

Nach der Bestimmung der Feuchtemasse des Zellpellets ein Flüssigstickstoffbad in und um einen 50-Milliliter-Kegel-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen anlegen. Anschließend die suspendierten Zellen in eine 5-Milliliter-Spritze aufziehen und eine Kanüle mit 16 Gauge an die Spritze anschließen. Danach die Zellsuspension einfrieren, indem sie mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Minute durch die Spritze und die Kanüle in das Bad gegeben wird, um Tröpfchen zu erzeugen.

Um die Hefe-Zellen zu lysieren, kühlen Sie zunächst eine Kaffeemühle mit flüssigem Stickstoff vor. Geben Sie anschließend bis zu 40 Gramm Hefe-Zellen hinzu und mahlen Sie 25 Sekunden lang, wobei der Vorgang acht bis neun Mal wiederholt wird. Es wird empfohlen, nicht mehr als 10 Liter Zellkultur gleichzeitig aufzubereiten.

Dies verkürzt die Reinigungszeit und gewährleistet, dass die strukturelle Integrität des Komplexes erhalten bleibt. Nach jeweils zwei Zerkleinerungszyklen eine dünne Schicht flüssigen Stickstoffs zum Zerkleinerer hinzufügen und verdunsten lassen. Um Zellagglomeration zu vermeiden, verhindern Sie das Auftauen der Zellen, indem Sie die Zellen mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Spatel umrühren.

Nach der Lyse sollten die Zellen wie ein feines weißes Pulver erscheinen. Nach Überprüfung der Zelllyse und Vorbereitung des Pufferlösungsansatzes mit PMSF, DTT und Proteaseinhibitoren gemäß dem schriftlichen Protokoll, verwenden Sie einen mit flüssigem Stickstoff gekühlten Spatel, um das gefrorene, lysierte Zellpulver schrittweise in die vorbereiteten 50-Milliliter-Röhrchen mit Puffer zu überführen. Bei jeder Zugabe drehen Sie die 50-Milliliter-Röhrchen vorsichtig bei Raumtemperatur, um das Zellmaterial langsam aufzutauen und aufzulösen sowie die Bildung von Blasen zu vermeiden.

Während die Zellen auflösen, weiteres Zellpulver hinzufügen. Nachdem alle Zellen zugegeben wurden, das Auftauen und Auflösen der Zellen fortführen, bis keine gefrorenen Zellklumpen mehr in den Röhrchen sichtbar sind. Dies sollte ungefähr 50 Minuten dauern.

Zentrifugieren Sie anschließend das Zelllysat bei 25.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nach dem Lysevorgang der Zellen und der Zentrifugation können Sie eine kleine dunkle Schicht im unlöslichen Pellet beobachten. Überführen Sie den Überstand in Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen und geben Sie 10 µL 200 mM PMSF zu jedem vollen Röhrchen hinzu.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 × g und vier Grad Celsius für eine Stunde. Am Ende des Zentrifugierens sollten vier Schichten sichtbar sein: Ein hartes, klares Pellet, das hauptsächlich ribosomale Komplexe enthält; ein weiches, lipidreiches Pellet; eine große, klare, gelblich gefärbte Schicht, die den Großteil der löslichen Proteine und Komplexe der Zelle enthält; sowie eine schuppige oberste Schicht, die aus Lipiden besteht.

Entfernen Sie in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius mit einer Ein-Milliliter-Pipette so viel wie möglich von der oberen, schuppigen Lipidschicht und entsorgen Sie diese. Mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette heben Sie den größten Teil der klaren, gelben Schicht ab. Anschließend heben Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die unteren beiden Schichten nicht zu stören, die letzten Milliliter dieser Schicht ab.

Aus 40 Gramm feuchtem Zellpellet werden typischerweise etwa 48 Milliliter der mittleren Schicht gewonnen. Nach der Herstellung von IgG-Sepharose gemäß dem Textprotokoll wird das IgG-Harz mit dem mittleren Phasenüberstand und zwei Mini-Proteaseinhibitor-Tabletten pro 40 Gramm Zellen vermischt. Anschließend wird die Mischung zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Rotator inkubiert.

Dies ist die IgG-Batch-Lösung. Bereiten Sie zwei 10-Milliliter-Polyprep-Säulen vor, indem Sie die Enden der Säulen abschneiden, um eine ebene Öffnung zu erzeugen. Gießen Sie 24 Milliliter der suspendierten IgG-Harzschlämme oder Batch-Lösung in jede Säule und lassen Sie diese durch Schwerkraft sedimentieren.

Dies entspricht 200 Mikroliter gepacktem IgG-Harz. Wenn die Sedimentation länger als 30 Minuten dauert, könnte die mittlere Phase durch Lipide kontaminiert worden sein. Sobald die Sedimentation abgeschlossen ist, spülen Sie die gepackte Säule mit vier aufeinanderfolgenden 10-Milliliter-Mengen IgG-D150-Puffer.

Um die Spaltung durch das Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease auf der Säule durchzuführen, verschließen Sie das untere Ende der Säule und geben ein Milliliter IgG-D150-Puffer und 100 Mikroliter TEV-Protease hinzu. Verschließen Sie das obere Ende der Säule und mischen Sie 20 Minuten lang in einem Thermomischer bei 750 U/min und 18 Grad Celsius. Lösen Sie das Harz erneut auf und mischen Sie weitere 20 Minuten lang.

Anschießend erneut aufnehmen und die 20-minütige Mischung ein drittes Mal wiederholen. Die Säule anschließend bei vier Grad Celsius platzieren und den Proteinkomplex durch Schwerkraft eluieren. Danach 200 Mikroliter IgG D150 hinzufügen, um das Totvolumen zu eluieren.

Nach der Herstellung des Calmodulin-Affinitätsharzes gemäß dem Textprotokoll das Calmodulin-Bindungspuffer und die Probe zum Harz geben und mit einem Röhrchenrotator bei vier Grad Celsius eine Stunde lang inkubieren. Pro 100 Mikroliter Calmodulin-Suspension eine zweimilliliter-Polyprep-Säule vorbereiten, indem das Ende der Säule abgeschnitten wird, um eine ebene Öffnung zu erzeugen. Das Protokoll beschreibt spezifische Puffer- und Säulenvolumina, die so gewählt sind, dass der Komplex konzentriert bleibt und seine Verweilzeit auf dem Harz minimiert wird.

Wenn das Kulturvolumen geändert wird, empfiehlt es sich, die Harz- und Puffermengen der Schwerkraftsäulen entsprechend anzupassen. Packen Sie die Säule mit nicht mehr als 100 Mikrolitern Calmodulin-Suspension und waschen Sie das Harz dreimal mit jeweils 5 Millilitern Calmodulin-Bindungspuffer durch Schwerkraft. Eluieren Sie das Protein dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern Calmodulin-Elutionspuffer.

Danach verschließen Sie das untere Ende der Säule, geben 20 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren für 2,5 Minuten, bevor Sie den Verschluss öffnen und das Protein durch Schwerkraft eluieren lassen. Verschließen Sie das untere Ende der Säule erneut und geben 200 Mikroliter Elutionspuffer hinzu, bevor Sie fünf Minuten lang inkubieren. Anschließend öffnen Sie das untere Ende der Säule und eluieren die Lösung.

Bei der sechsten und letzten Elution wird das untere Ende der Säule verschlossen und 10 Minuten mit Elutionspuffer inkubiert. Anschließend wird die Säule geöffnet und eluiert. Führen Sie die Analyse nach der Reinigung durch und lagern Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll.

Wie hier gezeigt, ergab eine anfängliche TAP-Reinigung des Komplexes nach einem veröffentlichten Protokoll ein Komplex, der als drei Banden in einem silbergefärbten Gel wanderte. Mehrere Optimierungsrunden der TAP-Methode liefern uns einen Komplex, der als einzelne Bande in einem nativen Gel wanderte, was auf eine homogenere Zusammensetzung hinweist. In Übereinstimmung mit dem Ergebnis des nativen Gels detektierte die Westernblot-Analyse unter Verwendung eines TAP-Antikörpers gegen den Komplex, der gemäß dem veröffentlichten Protokoll gereinigt wurde, eine Proteolyse des TAP-markierten Proteins SNU-71.

Modifikationen der TAP-Methode reduzierten die Menge an Proteolyse deutlich, da nahezu alle 17 Proteine im U1-snRNP-Komplex mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Multimassenspektrometrie eindeutig identifiziert wurden. Die Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung zeigt monodisperse Partikel nach einer erfolgreichen Aufreinigung nach dem ersten und zweiten Schritt der TAP-Methode. Im Gegensatz dazu werden keine Partikel der korrekten Größe beobachtet, wenn die Aufreinigung nicht erfolgreich ist.

Die endgültige Qualität des Komplexes wurde anhand eines Rasens gereinigter Partikel beurteilt, der hier dargestellt ist und im rohen Negativkontrast-EM-Bild monodispers erscheint. Zusätzlich zeigen Klassenmittelwerte der Partikel deutliche Merkmale, was darauf hindeutet, dass die Probe möglicherweise für eine strukturelle Untersuchung geeignet ist. Nach Beherrschung der Methode kann dieses Protokoll innerhalb von 10 bis 12 Stunden nach dem Auftauen des gefrorenen lysierten Zellpulvers abgeschlossen werden.

Während der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Lösungen frei von Proteasen und Nukleasen sind, und zudem schnell zu arbeiten, um eine Aggregation oder Dissoziation des Komplexes zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man einen nativen Komplex in geeigneter Qualität für strukturelle Untersuchungen reinigt, sowie wie man überprüft, ob dies erfolgreich erreicht wurde.