Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen nativen makromolekularen Komplex von geeigneter Qualität für biophysikalische Studien zu reinigen. Dieses Protokoll dient nicht nur als Möglichkeit zur Aufreinigung eines Komplexes, sondern auch als detaillierter Leitfaden zur Beurteilung der strukturellen Qualität der Probe während der Aufreinigung. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ermöglicht, eine native Anordnung unter nahezu physiologischen Pufferbedingungen einfach und schnell zu reinigen, um die Homogenität der Zusammensetzung zu gewährleisten.

Nach der Zentrifugation der S.cerevisiae-Zellen und dem Dekantieren des Überstands gemäß dem Textprotokoll werden zwei Milliliter gekühlter Lysepuffer hinzugefügt und das Pellet mit einer serologischen 10-Liter-Pipette verwirbelt und/oder mit einer 10-Milliliter-Pipette suspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein leeres, konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, das auf Eis gehalten wird. Verwenden Sie dann weitere zwei Milliliter gekühlten Lysepuffer, um jede Zentrifugenflasche zu waschen, und geben Sie die Lösung in das 50-Milliliter-Röhrchen.

Nach der Bestimmung des Nassgewichts des Zellpellets wird ein Flüssigstickstoffbad in und um ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen hergestellt. Ziehen Sie als Nächstes suspendierte Zellen in eine Fünf-Milliliter-Spritze und verbinden Sie eine 16-Gauge-Nadel mit der Spritze. Frieren Sie dann die Zellsuspension ein, indem Sie sie mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Minute durch die Spritze und die Nadel in das Bad geben, um Tröpfchen zu erzeugen.

Um die Hefezellen zu lysieren, verwenden Sie zunächst flüssigen Stickstoff, um eine Kaffeemühle vorzukühlen. Fügen Sie dann bis zu 40 Gramm Hefezellen hinzu und mahlen Sie sie 25 Sekunden lang, wobei Sie das Mahlen acht- oder neunmal wiederholen. Es wird empfohlen, nicht mehr als 10 Liter Zellkultur auf einmal zu reinigen.

Dies minimiert die Reinigungszeit und stellt sicher, dass die strukturelle Integrität des Komplexes erhalten bleibt. Geben Sie nach jeweils zwei Mahlrunden eine flache Schicht flüssigen Stickstoff in die Mühle und lassen Sie ihn verdampfen. Um zu verhindern, dass die Zellen verklumpen, verhindern Sie, dass die Zellen auftauen, indem Sie die Zellen mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Spatel umrühren.

Nach der Lyse sollten die Zellen als feines weißes Pulver erscheinen. Nach der Überprüfung der Zelllyse und der Vorbereitung des Lysepuffers mit PMSF-, DTT- und Proteaseinhibitoren gemäß dem Textprotokoll wird das gefrorene lysierte Zellpulver mit einem gekühlten Flüssigstickstoffspatel schrittweise in die vorbereiteten 50-Milliliter-Röhrchen des Puffers geschöpft. Drehen Sie die 50-Milliliter-Röhrchen mit jedem hinzugefügten Schritt vorsichtig bei Raumtemperatur, um die Zellen aufzutauen und aufzulösen und die Bildung von Blasen zu verhindern.

Wenn sich die Zellen auflösen, füge mehr Zellpulver hinzu. Nachdem alle Zellen hinzugefügt wurden, tauen Sie die Zellen weiter auf und lösen Sie sie auf, bis keine gefrorenen Zellklumpen mehr in den Röhrchen zu sehen sind. Dies sollte ca. 50 Minuten dauern.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 25.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sobald die Zellen lysiert sind und nach der Zentrifugation, können Sie eine kleine dunkle Schicht in dem unlöslichen Pellet beobachten. Übertragen Sie den Überstand in Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen und geben Sie 10 Mikroliter 200 Millimolar PMSF in jedes volle Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 g und vier Grad Celsius für eine Stunde. Am Ende der Drehung sollten vier Schichten sichtbar sein. Ein hartes, klares Pellet, das hauptsächlich ribosomale Komplexe enthält; ein weiches, lipidreiches Pellet; eine große, klare, gelblich gefärbte Schicht, die die meisten löslichen Proteine und Komplexe der Zelle enthält; und eine schuppige Deckschicht, die aus Lipiden besteht.

Verwenden Sie in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius eine Ein-Milliliter-Pipette, um so viel wie möglich von der obersten schuppigen Lipidschicht zu entfernen und zu entsorgen. Verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um den größten Teil der klaren gelben Schicht wiederherzustellen. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette, um die unteren beiden Schichten nicht zu stören, und gewinnen Sie die letzten Milliliter dieser Schicht.

Aus 40 Gramm Nasszellenpellet werden typischerweise etwa 48 Milliliter der mittleren Schicht zurückgewonnen. Nach der Herstellung von IgG-Sepharose gemäß dem Textprotokoll kombinieren Sie das IGG-Harz mit dem Mittelphasenüberstand und zwei Mini-Proteasehemmer-Tabletten pro 40 Gramm Zellen. Dann zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator stellen.

Dies ist die IgG-Batch-Lösung. Bereiten Sie zwei 10-Milliliter-Polyprep-Säulen vor, indem Sie die Enden der Säulen so abschneiden, dass eine flache Öffnung entsteht. Gießen Sie die 24 Milliliter der suspendierten IgG-Harzaufschlämmung oder der Chargenlösung in jede Säule und lassen Sie sie durch die Schwerkraft sedimentieren.

Das entspricht 200 Mikrolitern gepacktem IgG-Harz. Wenn die Sedimentation länger als 30 Minuten dauert, kann die mittlere Phase durch Lipide verunreinigt worden sein. Wenn die Sedimentation abgeschlossen ist, verwenden Sie vier aufeinanderfolgende 10-Milliliter-Volumina IgG D150-Puffer, um die gepackte Säule zu waschen.

Um eine Spaltung der Tabakätzviren oder TEV-Protease an der Säule durchzuführen, verschließen Sie den Boden der Säule und fügen Sie einen Milliliter IgG D150-Puffer und 100 Mikroliter TEV-Protease hinzu. Versiegeln Sie die Oberseite der Säule und mischen Sie mit einem Thermomischer bei 750 U/min und 18 Grad Celsius 20 Minuten lang. Suspendieren Sie das Harz erneut und mischen Sie erneut 20 Minuten lang.

Unterbrechen Sie dann erneut und wiederholen Sie das 20-minütige Mischen ein drittes Mal. Bringen Sie die Säule wieder auf vier Grad Celsius und nutzen Sie die Schwerkraft, um den Proteinkomplex zu eluieren. Fügen Sie dann 200 Mikroliter IgG D150 hinzu, um das Totvolumen zu eluieren.

Nach der Herstellung des Calmodulin-Affinitätsharzes gemäß dem Textprotokoll fügen Sie den Calmodulin-Bindungspuffer und die Probe zum Harz hinzu und inkubieren Sie mit einem Röhrchenrotator eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie eine zwei Milliliter Polyprep-Säule pro 100 Mikroliter Calmodulin-Aufschlämmung vor, indem Sie das Ende der Säule abschneiden, um eine flache Öffnung zu schaffen. Das Protokoll beschreibt die spezifischen Puffer- und Verweilvolumina, die ausgewählt wurden, um die Konzentration des Komplexes zu halten und seine Verweilzeit im Harz zu minimieren.

Wenn das Kulturvolumen geändert wird, wird empfohlen, das Harz- und das Puffervolumen der Schwerkraftsäulen zu ändern, um der Änderung Rechnung zu tragen. Packen Sie die Säule mit nicht mehr als 100 Mikrolitern Calmodulin-Aufschlämmung und verwenden Sie durch die Schwerkraft 5 Milliliter Calmodulin-Bindungspuffer, um das Harz dreimal zu waschen. Mit 200 Mikrolitern Calmodulin-Elutionspuffer eluieren Sie das Protein dreimal.

Verschließen Sie dann den Boden der Säule und fügen Sie 20 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie 2,5 Minuten lang, bevor Sie die Versiegelung lösen und das Protein durch die Schwerkraft eluieren lassen. Verschließen Sie den Boden der Säule wieder und fügen Sie 200 Mikroliter Elutionspuffer hinzu, bevor Sie fünf Minuten lang inkubieren. Entsiegeln Sie dann den Boden der Säule und eluieren Sie die Lösung.

Für die sechste und letzte Elution verschließen Sie den Boden der Säule und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang mit Elutionspuffer. Dann entsiegeln und eluieren. Führen Sie eine Nachreinigung durch und lagern Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll.

Wie hier gezeigt, ergab eine erste TAP-Aufreinigung des Komplexes nach einem veröffentlichten Protokoll einen Komplex, der in Form von drei Banden auf ein silbergefärbtes Gel migrierte. Mehrere Optimierungsrunden der TAP-Methode ergeben einen Komplex, der als einzelne Bande auf ein natives Gel migriert ist, was auf eine homogenere Assemblierung hinweist. In Übereinstimmung mit dem nativen Gelergebnis wurde durch Western Blot mit einem TAP-Antikörper gegen den Komplex, der gemäß dem veröffentlichten Protokoll gereinigt wurde, eine Proteolyse des TAP-markierten Proteins SNU-71 nachgewiesen.

Modifikationen der TAP-Methode reduzierten den Proteolyseaufwand signifikant, da fast alle 17 Proteine des U1 snRNP-Komplexes mittels SDS-PAGE aufgelöst und durch Multimassenspektrometrie positiv identifiziert wurden. Die Negativ-Färbeelektronenmikroskopie zeigt monodisperse Partikel aus einer erfolgreichen Aufreinigung nach dem ersten und zweiten Schritt der TAP. Im Gegensatz dazu werden keine Partikel in der richtigen Größe beobachtet, wenn die Reinigung nicht erfolgreich ist.

Die endgültige komplexe Qualität wurde auf einem Rasen aus gereinigten Partikeln bewertet, die im negativen Flecken-EM-Rohbild monodispergiert erscheinen. Darüber hinaus zeigen die Klassendurchschnitte der Partikel deutliche Merkmale, die darauf hindeuten, dass die Probe möglicherweise für eine Strukturuntersuchung geeignet ist. Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es innerhalb von 10 bis 12 Stunden nach dem Auftauen des gefrorenen lysierten Zellpulvers abgeschlossen werden.

Bei der Befolgung dieses Protokolls ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Lösungen frei von Proteasen und Nukleasen sind, und schnell zu arbeiten, um eine Aggregation oder Dissoziation des Komplexes zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man einen nativen Komplex von geeigneter Qualität für die Strukturuntersuchung reinigt und wie man beurteilt, dass dies erreicht wurde.