Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Das übergeordnete Ziel dieser RNA-Immunpräzipitationstechnik ist die selektive Isolierung und Charakterisierung endogener RNA-Proteinkomplexe, die in eukaryotischen Zellen durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung gebildet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der posttranskriptionellen Kontrolle zu beantworten, wie z. B. die Zusammensetzung der RNA-Bindungsproteine, die die fünf Haupt-UTR eines retroviralen Transkripts definieren, um seine Genexpression zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es einem Forscher ermöglicht, einen spezifischen RNA-Proteinkomplex von Interesse selektiv zu isolieren und zu charakterisieren, während gleichzeitig die Möglichkeit erhalten bleibt, eine globalere Analyse des RNP stromabwärts durchzuführen.

Nun, die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein grundlegendes Verständnis von Virusinfektionen und zahlreichen zellulären Krankheiten. Und bietet einen wichtigen Einblick in die Mechanismen der posttranskriptionellen Kontrolle der Genexpression. Das könnte neue tragfähige Angriffspunkte für Medikamente bedeuten.

Nach der Kultivierung von Zellen und der Durchführung der Immunpräzipitation eines FLAG-markierten Proteins gemäß dem Textprotokoll werden 60 Mikroliter pro IP der pro-TG magnetischen Bead-Aufschlämmung in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Stellen Sie das Röhrchen auf ein Magnetgestell und entfernen Sie die Aufbewahrungslösung durch vorsichtiges Pipettieren. Nehmen Sie dann das Rohr aus dem Gestell.

Fügen Sie 600 Mikroliter 1x Waschpuffer hinzu. Und legen Sie das Rohr drei Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Ende-über-Ende-Rotator, um die Kügelchen zu waschen und auszugleichen. Legen Sie die Tube auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer.

Fügen Sie dann 10 Volumen frischen 1x Waschpuffer hinzu. Geben Sie immunpräzipitierenden FLAG-Antikörper zu den äquilibrierten pro-TG-Magnetbeads. Drehen Sie dann das Röhrchen mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den immunpräzipitierenden Antikörper zu konjugieren.

Setzen Sie das Rohr auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand. Nehmen Sie dann die Tube vom Magneten und geben Sie 1x Waschpuffer zu den Kügelchen und drehen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal und entfernen Sie den letzten Puffer.

Entfernen Sie das Nährmedium durch Aspiration von den Zellen und verwenden Sie 1,5 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Mit einem Zellschaber lösen Sie die nassen, anhaftenden Zellen. Pipettieren Sie die Zellsuspension in frische Röhrchen und zentrifugieren Sie die Kultur dann vier Minuten lang bei 226 mal G bei vier Grad Celsius.

Geben Sie 375 Mikroliter eiskalten Puffer mit niedrigem Salzgehalt in das Zellpellet und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang auf Eis, damit sie aufquellen kann. Es ist wichtig, beim Hinzufügen und erneuten Suspendieren des Zellpellets in dem salzarmen Lysepuffer vorsichtig zu sein, um ein vollständiges Eintauchen und Quellen ohne vorzeitige mechanische Unterbrechung zu gewährleisten. Um das zytoplasmatische Zelllysat zu sammeln, fügen Sie 125 Mikroliter eiskalten Lysepuffer hinzu und verwenden Sie dann einen vorgekühlten Dounce-Homogenisator, um zehn Hübe durchzuführen.

Homogenisieren Sie mit genügend Kraft, um die Plasmamembranlyse und die Verunreinigungen des freigesetzten zytoplasmatischen Lysats zu ermöglichen. Achten Sie jedoch darauf, die mechanische Unterbrechung nicht zu überdehnen und eine nukleare Kontamination, eine Störung des RNA-Proteinkomplexes oder einen Verlust der freigesetzten Homogenität zu riskieren. Drehen Sie das Homogenat in einer Mikrofuge eine Minute lang mit Höchstgeschwindigkeit. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis lag.

Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration. Reservieren Sie 10 % für die Western-Blot-Analyse, die als Eingangskontrolle verwendet wird. Um eine Immunpräzipitation durchzuführen, fügen Sie das gewünschte Volumen des geernteten Zelllysats zu den konjugierten Antikörperkügelchen des Zielantikörpers hinzu.

Mit 1x Waschpuffer das Gesamtvolumen auf 600 Mikroliter bringen und die Probe bei Raumtemperatur drehen. Legen Sie nach 90 Minuten Inkubation das IP-Röhrchen auf das Magnetgestell, um die Kügelchen zu sammeln. Sammeln Sie dann den Überstand und reservieren Sie ihn als Durchfluss.

Geben Sie anschließend 10 Volumen eiskalten NETN 150 Waschpuffer zu den RNP-gebundenen, antikörperkonjugierten Kügelchen und drehen Sie die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach dem erneuten Aufhängen der immobilisierten RNP-Komplexe in 1x Bindungspuffer gemäß dem Textprotokoll wird das verbleibende Volumen in 100 Mikrolitern eiskaltem 1x Bindungspuffer angepasst. Und erhitzen Sie die Röhre drei Minuten lang bei 70 Grad Celsius.

Um verwandte RNA-Proteinkomplexe zu isolieren, fügen Sie ein DNA-Oligo mit etwa 30 Nukleotiden hinzu, das komplementär zu den drei Hauptsequenzgrenzen der interessierenden RNA ist. Und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren. Geben Sie fünf bis zehn Einheiten oder RNase H in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die RNA vom RNA-DNA-Hybrid abzuspalten.

Übertragen Sie dann den Überstand mit den eingefangenen RNP-Komplexen von Interesse in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die immunpräzipitierte RNA zu sammeln, wird die Hälfte der Gesamtprobe der gefangenen RNA-Komplexe in 750 Mikrolitern saurem Guanidiniumthiocyanat-Reagenz resuspendiert. Geben Sie 200 Mikroliter Chloroform in das Röhrchen, schütteln Sie es 10 Sekunden lang kräftig und inkubieren Sie es drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach der Zentrifugation die wässrige Phase in einem frischen Röhrchen auffangen und ein gleiches Volumen Isopropanol hinzufügen. Gut mischen und die Probe mindestens zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie der Probe einen Mikroliter Glykolblau hinzu und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für eine effiziente Ausfällung oder Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 Mal G bei vier Grad Celsius für zehn Minuten. Verwenden Sie eine P200-Mikropipette, um den Überstand vorsichtig zu sammeln und zu entsorgen, um das RNA-Pellet nicht zu stören. Geben Sie 500 Mikroliter 75%iges Ethanol in jedes Röhrchen.

Wirbeln und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang. Sammeln und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, wie gerade gezeigt. Trocknen Sie das Pellet zwei bis drei Minuten lang an der Luft und verwenden Sie 100 Mikroliter RNase-freies Wasser, um es wieder zu suspendieren.

Geben Sie 100 Mikroliter der RNA-Probe auf eine RNA-Aufreinigungssäule. Und verarbeiten Sie es gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zum Schluss eluieren Sie die RNA in 30 Mikrolitern RNase-freiem Wasser und lagern sie bis zu drei Monate lang bei minus 80 Grad Celsius.

Zur Isolierung von posttranskriptionellen Kontrollelementen oder PCE-, GAG-, RNA- und RHA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in proliferierenden Zellen gebildet werden. Die FLAG-MS2 RNP-Immunpräzipitation wurde in transfizierten HECK293 Zelllysaten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine effiziente Ausfällung des FLAG-MS2-Proteins.

Da DHX9/RHA im RNP-Komplex und nicht in der IgG-Isotopenkontrolle oder in der Negativkontrolle vorkommt. Hier sind Western Blots aus RNase H-verdauten RNA-DNA-Komplexen zu sehen. RNase H spaltete PCE GAG RNA und setzte den RNP-Komplex frei, der spezifisch an die fünf Primzahlen UTR gebunden ist.

Die DHX9/RHA-assoziierten RNPs wurden in den Eluenten angereichert. Wichtig ist, dass die FLAG-MS2-gebundenen RNPs bei den Antikörper-konjugierten Kügelchen blieben. In diesem Experiment wurde die HO-Immunpräzipitation der MS2-Stammschleife, die retrovirale PCE GAG RNA in Zellen und in Eluenten enthält, mittels RT-PCR und QRT-PCR validiert.

Die Ergebnisse bestätigten eine selektive Assoziation zwischen DHX9/RHA und der retroviralen Fünf-Prime-UTR, die als einzigartiges RNP hervorgehoben wurde, das für eine gezielte Translationskontrolle wichtig ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte effizient und sorgfältig durchzuführen, um die Erhaltung intakter RNP-Komplexe und die Isolierung des spezifischen RNP-Komplexes von Interesse zu gewährleisten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Massenspektrometrie und RNA-Seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die globale Proteinassoziation mit der Ziel-RNA. Und Region oder vollständige Analyse aller Transkripte, die innerhalb eines bestimmten RNP beteiligt sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der posttranskriptionellen Genkontrolle, um die unterschiedlichen RNA-Proteinkomplexe zu erforschen, die die Exspiration pathogener viraler Gene und den allgemeinen Mechanismus der zellulären Genexpressionskontrolle steuern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intakte zelluläre RNP-Komplexe erntet und deren Zusammensetzung durch selektive Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung bestimmt. Vergessen Sie auch nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Viren und biologischen Proben sowie gefährlichen Chemikalien wie Säure oder Phenol äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer alle Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. geeignete persönliche Schutzausrüstung, getroffen werden.