Name: Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Lernen Sie die RNA-Immunpräzipitation zur selektiven Isolierung endogener RNA-Protein-Komplexe in eukaryotischen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung spezifischer RNPs und liefert Einblicke in die post-transkriptionale Kontrolle viraler Genexpression.

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Die Autoren danken Unterstützung durch die NIH P50GM103297, P30CA100730 und Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Pufferzusammensetzungen </td></tr><tr><td> Waschpuffer: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> Niedrigsalzpuffer: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 10 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 1x Protease-Inhibitor-Cocktail EDTA-frei </td></tr><tr><td> RNase Out 5 ul / ml (RNase-Inhibitor) </td></tr><tr><td> Zytoplasmatischen Lysepuffer: </td></tr><tr><td> 0,2 M Sucrose </td></tr><tr><td> 1,2% Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 Waschpuffer: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% NP-40 </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10% Glycerol </td></tr><tr><td> Binding Buffer: </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES pH 7,6 </td></tr><tr><td> 40 mM KCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 5% Glycerol </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Pufferzusammensetzungen. 1. Herstellung der Zellen und die Affinitätsmatrix <ol><li> Kultur eine Zelllinie von Interesse Subkonfluenz (80%) in einem 10-cm-Schale. Verwenden Sie 10 cm-Platten für unabhängige Immunpräzipitationen (IP) eines FLAG-markierten NLS-MS2-Hüllprotein. Führen Sie die IP-Antiseren an das FLAG-Epitop-Tag. MS2 - Hüllprotein Plasmid Wenn die FLAG-markierten exprimieren, transfizieren Zellen 24-48 h vor der Ernte 20. HINWEIS: Eine besondere RNP kann aus Kern- oder Zytoplasma anreichernic Lysaten oder ein biochemisch-fraktionierte Zubereitung, wie beispielsweise Bruchteilen eines Sucrosegradienten. Es wird empfohlen, das Lysat von nicht-transfizierten Zellen parallel zur Ernte eine zusätzliche negative Kontrolle zu stehen. </li><li> Transfer 60 ul pro IP von Protein G magnetischen Kügelchenaufschlämmung zu einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem Magnetträger für Mikrozentrifugenröhrchen, die Perlen aus der Speicherlösung zu trennen. </li><li> Entfernen Sie die Speicherlösung durch vorsichtiges Ziehen mit einer Mikropipette auf. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch vom Magnethalter. </li><li> Waschen und die Perlen mit 600 &amp; mgr; l (10 - fache der verwendeten Volumen der Kügelchen) der 1x - Waschpuffer äquilibriert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl 2 und 150 mM NaCl) und End-over-End - Rotation für 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer. </li><li> In 10 Volumen (600 ul) 1x Waschpuffer und Immunopräzipitieren FLAG-Antikörper auf die äquilibrierte protein G magnetische Kügelchen (entsprechend der Menge der vom Hersteller für eine Immunpräzipitation empfohlen) und rotate end-over-end bei Raumtemperatur für mindestens 30 min die Immunpräzipitation Antikörper zu konjugieren. Verwenden Sie die entsprechenden Isotyp IgG als geeigneter Antikörper negative Kontrolle. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell um die Perlen zu sammeln und den Überstand zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch vom Magnetstange und waschen Sie die antikörperkonjugierten Perlen mit 10 Volumen (600 ul) 1x Waschpuffer und Rotation für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer. </li></ol> 2. Ernten der RNPs HINWEIS: Bereiten Sie die RNPs während der Inkubationszeit nach dem Schritt 1.8. <ol><li> Entfernen Kulturmedium aus den Zellen durch Absaugen und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1-5 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwenden Sie einen Zellschaber zu entfernen nass,adhärenten Zellen vor der Entnahme durch Zentrifugation bei 226 × g für 4 min bei 4 ° C. </li><li> In 375 ul eiskaltem, salzarme Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x Protease-Inhibitor - Cocktail, EDTA-frei; und 5 &amp; mgr; l / ml RNase Inhibitor) auf die Zellpellet und erlauben durch Quellen auf Eis für 5 min platzieren. HINWEIS: Tailor das Volumen des Niedrigsalzpuffers um die Größe des Zellpellets nach. 1,2 x 10 6 Zellen aus einer 10 cm - Platte, 375 &amp; mgr; l Puffer ausreichend. </li><li> Um die Cytoplasma-Zelllysat sammeln, fügen 125 ul eiskaltem Lysepuffer (0,2 M Saccharose / 1,2% Triton X-100), und führen Sie dann 10 Schläge mit einem Dounce-Homogenisator, der in einem Eiskübel vorgekühlte war. HINWEIS: Zum sammeln, um den gesamten Zellextrakt, Standard RIPA Lysepuffer für die Solubilisierung des Nukleoplasma / Chromatin empfohlen. </li><li> Spin in einer Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit (16.000 × g) für 1 min; Dies wird der Überstand von Schutt eine klarend Kerne. </li><li> Den Überstand in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis gewesen ist. Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration von einem Standard-Labor bevorzugte Verfahren, wie beispielsweise dem Bradford - Assay 23. Reservieren eines Aliquots von mindestens 10% für eine Western-Blot-Analyse als Eingangssteuerung verwendet werden. Verwenden Sie das geerntete Zelllysat sofort für die Immunpräzipitation oder lagern Sie es bei -80 ° C für eine spätere Analyse. HINWEIS: In unserer Erfahrung können diese Proben gespeichert und ohne einen Kompromiß an Integrität einige Monate später für die Immunpräzipitation Analyse verwendet werden. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Füge das gewünschte Volumen des geernteten Zelllysat, bezogen auf die Proteinkonzentration in bestimmt Schritt 2.5, in die Ziel antikörperkonjugierten Perlen. end-over-end für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 1x Waschpuffer, das Gesamtvolumen von bis zu 600 &amp; mgr; l und drehen. HINWEIS: Diese Zeit reicht aus, um zu erzeugen,RNP-Komplexe eine robuste Isolierung von hochaffinen bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Bindung. Verdünnte alternative RNP Quellen, wie beispielsweise Bruchteilen eines Saccharosegradienten, mindestens 1: 1 mit 1x-Waschpuffer und dann inkubieren sie mit zuvor vorbereiteten bead-Antikörper-Komplexe, wie oben erwähnt. </li><li> Nach 90 Minuten Inkubation, legen Sie die IP-Rohr auf dem Magnetgestell, das die Perlen zu sammeln. Reservieren Sie den Überstand als Flow-Through. HINWEIS: Dieser erste Durchfluss ist ein wichtiger Kontrollprobe IP Effizienz zu messen. Ein Immunoblot-Assay wird einen Hinweis auf IP Effizienz sowie die Spezifität der untersuchten Interaktionen bereitzustellen. Es wird empfohlen, diesen Überstand für die nachfolgende Analyse zu halten. </li><li> Waschen Sie die RNP-gebundenen Antikörper-konjugierten Perlen mit 10 Volumina (600 ul) eiskaltem NETN-150 Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM MgCl 2; 0,5% NP40; und 10% Glycerol) unter Rotation für 3 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Schritt 3 mal. HINWEIS: Dieser Puffer unterscheidet sich von dem Lysepuffer und reduziert effektiv schwach oder nicht-spezifischen Assoziationen. </li><li> Nach der letzten Waschung resuspendieren immobilisiertem RNP - Komplexe in 60 ul eiskaltem 1x Bindungspuffer (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl 2; 5% Glycerin und 2 mM DTT) und Reserve 10% der immobilisierten Komplex Perlen für Western-Blot und 20% für die RNA-Isolierung. </li></ol> 4. Elution <ol><li> Stellen Sie die verbleibende Volumen auf 100 ul mit eiskaltem Bindungspuffer 1x und erhitze das Rohr bei 70 ° C für 3 min. </li><li> Um verwandtes RNA-Protein-Komplexe zu isolieren, fügen Sie ein ~ 30-nt DNA-Oligonukleotid, das für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (100 nM Oligonukleotid ist ausreichend) komplementär zu der 3&#39;-Sequenz Grenze der RNA von Interesse und brüten. HINWEIS: Das Oligonukleotid ist Antisense zu den Nukleotidreste neben dem Translationsstart-Seite des PCE-Konstrukt als exampl verwendete in diesem Protokoll. Entsprechende Sequenz Komplementarität wird durch die ~ 40% GC-Gehalt zur Verfügung gestellt. Entwerfen das Antisense-Oligonukleotid für eine effiziente Hybridisierung an die minimale komplementäre Region der Ziel-RNA. </li><li> Hinzufügen 5-10 Einheiten von RNase H auf das Rohr und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur die RNA der RNA zu spalten: DNA-Hybrid. Den Überstand in ein steriles 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen; Dieses Beispiel enthält die erfassten RNP-Komplexe von Interesse. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Zugänglichkeit der kognaten RNA, zwei oder mehr Runden der RNase H-Behandlung nützlich sein kann, um die Probe Überfluß für die Downstream-Analysen zu erhöhen. </li><li> Verwenden von 20% des Eluats in einem Western-Blot für bekannte assoziierte Proteine ​​und 20% des Eluats zur RNA-Isolierung, gefolgt von RT qPCR. Die restlichen 60% können für die Massenspektrometrie verwendet werden, oder Proteinkomponenten zu identifizieren. </li><li> Parallel wurde eine Aliquote des reservierten Zelllysat zu RNA-Isolierung und RT-PCR Analyse unterziehen. Diese assessment liefert einen Hinweis auf die Anreicherung von RNA in einem RNP-Komplex. HINWEIS: Verwenden Sie das isolierte Proteinpräparat in einer Kontroll Western-Blot, um festzustellen, dass die RNase H-Spaltung bei der Freigabe der RNP vom immunuoprecipitated Komplex wirksam war. </li></ol> 5. Protein-Elektrophorese und Western-Blot-Analyse <ol><li> Vorbehaltlich etwa 10-20% der Gesamtprobe auf SDS-PAGE und Immunoblot-Analyse nach Standardlaborprotokoll. HINWEIS: Dieser Schritt dient IP Effizienz und Spezifität vor der nachgelagerten RNA-Analyse zu validieren. Es kann auch die Protein-Zusammensetzung des isolierten RNP-Komplex zu bewerten, verwendet werden. </li></ol> 6. Sammlung der immunpräzipitierten RNA HINWEIS: RNA-Isolierung kann durch Trizol-Verfahren oder nach dem beschriebenen Protokoll durchgeführt werden. <ol><li> Resuspendieren die Hälfte der gesamten Probe in 750 &amp; mgr; l Säure Guanidiniumthiocyanat Reagens und bei Raum temperatur für 5 min vor der RNA aus den erfassten PCE-RNP-Komplexe zu extrahieren. </li><li> In 200 ul Chloroform zu dem Rohr, kräftig schütteln für 10 Sekunden, und bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> Nach Zentrifugation bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C, Sammeln der wässrigen Phase in neuem Rohr und ein gleiches Volumen Isopropanol. Gut mischen und bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. 1 &amp; mgr; l Glykol blau auf die Probe und lagern Sie es bei -20 ° C im Gefrierschrank für eine effiziente Fällung oder Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen, um nicht das RNA-Pellet zu stören; die Verwendung eines p-Mikropipettenspitze 200 wird empfohlen, diesen Prozess zu erleichtern. </li><li> Hinzufügen, 500 &amp; mgr; l 75% Ethanol zu jedem Röhrchen, Wirbel- und zentrifugieren die Röhrchen bei 16.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig sammeln und den Überstand, wie in Schritt 6.4 zu verwerfen. Luft-Trocknen Sie das Pellet für 2-3 min und resuspendieren in 100 ul RNase-freies Wasser. Hinweis: Die Zeit, um die Pellets an Luft getrocknet, um nicht zu verlängern ein Problem mit Aufwirbelung zu vermeiden. </li><li> Bewerben 100 ul RNA-Probe zu einer RNA-Clean-up-Säule. Verarbeiten Protokoll des Herstellers verwendet wird. Eluieren der RNA in 30 ul RNase-freies Wasser und bei -80 ° C für bis zu 3 Monate. HINWEIS: Diese isolierte RNA ist geeignet für Downstream-Analyse mittels RT-Real-Time PCR (qPCR), Microarray, und RNA-Sequenzierung. In Abhängigkeit von der Fülle der RNP und die Effizienz, mit der das RNP von Interesse isoliert ist, kann das gleiche Lysat auf zwei oder mehr Runden der IP unterzogen werden, um eine ausreichende RNA anwendbar für die nachfolgenden Analysen erzeugen. </li></ol> 7. RNA reverse Transkription und Amplifikation der cDNA durch PCR <ol><li> Gegenstand Die isolierte RNA-Transkription durch eine zufällige Primer an Rückseite mit einem hochwertigen Reverse Transkriptase (RT), nach dem manufacturer Anweisungen. </li><li> Um die RNA von Interesse zu verstärken, die Gestaltung eines Gen-spezifischen Antisense-Primer in der RNase H-Spaltung-Sequenz. Verwenden Sie ähnliche Mengen des Antisense - Oligonukleotid, ein Random - Primer oder eine Oligo-dT - Primer (siehe Werkstoff - Tabelle). HINWEIS: Die Oligo-dT-Primer und poly-adenylierte mRNA liefern positive Kontrollreaktionen für die RT-PCR-Reaktionen. </li><li> Reserve 5% der RT-Reaktion (1 ul) für eine präparative qPCR im Tandem durchgeführt mit Negativ-Kontrolle Lysat IP und positive Kontroll-DNA-Proben, um die Cutoff zu definieren und eine Standardkurve herzustellen. Wenn der CT-Wert der präparativen qPCR über den Bereich der Standardkurve ist, verdünnen Sie die RT-Reaktion in aufeinander folgenden 1: 5 Verdünnungen und wiederholen Sie Schritt 7.2. HINWEIS: Für eine RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie-Technik finden Sie in der Zusatz Methode Datei. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier t</a>o sehen diese ergänzende Methode Datei. (Rechtsklick zum Download bereit.) </li></ol>

<ol><li>Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+as+developmental+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins as developmental regulators.</a> Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).</li>
<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).</li>
<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Mol.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrovirus+RNA+trafficking+granule%3A+from+birth+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity.</a> Retrovirology. 3, 18(2006).</li>
<li>Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+is+necessary+for+translation+of+selected+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Struct.Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs.</a> Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).</li>
<li>Pullmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+turnover+and+translation+regulatory+RNA-binding+protein+expression+through+binding+to+cognate+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs.</a> Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).</li>
<li>Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+birth+to+death%3A+the+complex+lives+of+eukaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs.</a> Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).</li>
<li>Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+immunoprecipitation+%28RNP-IP%29%3A+a+direct+in+vivo+analysis+of+microRNA-targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Biochem%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets.</a> J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).</li>
<li>Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+RNA-protein+interactions+in+vivo+by+RNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation.</a> Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).</li>
<li>Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Cognate+Cellular+and+Viral+Ribonucleoprotein+Complexes+of+HIV-1+RNA+Applicable+to+Proteomic+Discovery+and+Molecular+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations.</a> Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).</li>
<li>Stake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+two+avian+retroviral+5%27+untranslated+regions+bind+orthologous+human+and+chicken+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins.</a> Virology. 486, 307-320 (2015).</li>
<li>Sung, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+using+microarray+identified+complex+signaling+pathways+modulated+by+hypoxia+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma.</a> Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Michlewski, G., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-assisted+RNA+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNase-assisted RNA chromatography.</a> RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).</li>
<li>Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+of+proteins+interacting+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids.</a> J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).</li>
<li>Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+RNA-mediated+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.Genet.Genomics%22%5BJournal%5D)">Towards understanding RNA-mediated neurological disorders.</a> J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).</li>
<li>Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+RNA+terminus+of+spleen+necrosis+virus+contains+a+novel+posttranscriptional+control+element+that+facilitates+human+immunodeficiency+virus+Rev%2FRRE-independent+Gag+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production.</a> J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).</li>
<li>Bolinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+interacts+with+divergent+lymphotropic+retroviruses+and+promotes+translation+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1.</a> Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).</li>
<li>Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+modulates+translation+of+HIV-1+and+infectivity+of+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions.</a> Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).</li>
<li>Lee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+DHX9+helicase+induces+premature+senescence+in+human+diploid+fibroblasts+in+a+p53-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner.</a> J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Glenn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+mass+spectrometry+and+N-terminal+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing.</a> Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li>
<li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die RNP Isolierung und artverwandten RNA Identifizierung hier beschriebene Strategie ist ein selektiver mittels eines spezifischen RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen und Kandidatenproteine ​​Co-Regulierung in den Zellen einen bestimmten RNP zu entdecken. Der Vorteil der Verwendung von Oligonucleotid-gerichtete RNase H-Spaltung RNPs zu isolieren, ist die Fähigkeit, die RNP cis-wirkende RNA-Element über heterogene RNPs stromabwärts des cis-wirkende RNA-Element von Interesse gebunden zu ...

Posttranskriptionale Genexpression ist genau geregelt, mit DNA-Transkription im Zellkern beginnt. Gesteuert durch RNA - Proteine (RBPs) Bindung, mRNA Biogenese und Stoffwechsel auftreten in hochdynamischen Ribonukleoproteinpartikel (RNPs), die Gesellschafter und distanziere mit einem Substrat - Vorläufer - mRNA während der Progression von RNA - Metabolismus 1-3. Dynamische Veränderungen in RNP-Komponenten beeinflussen die posttranskriptionales Schicksal einer mRNA und bieten Qualitätssicherung bei der Verarbeitung von primären Transkripte, deren Kernhandel und Lokalisierung, ihre Tätigkeit als mRNA-Vorlagen für die Übersetzung und die eventuelle Umsatz von reifen mRNAs. Zahlreiche Proteine werden als RBPs aufgrund ihrer konservierten Aminosäuredomänen bezeichnet, einschließlich des RNA - Erkennungsmotiv (RRM), das doppelsträngige RNA - Bindungsdomäne (RBD), und erstreckt sich von basischen Resten (beispielsweise Arginin, Lysin und Glycin) 4. RBPs sind routinemßigisoliert durch Immunpräzipitation Strategien und gesiebt, um ihre spezifischen RNAs identifizieren. Einige RBPs co regulieren pre-mRNAs , die funktionell verwandt sind, bezeichnet als RNA Regulons 5-8. Diese RBPs, ihre zugehörigen mRNAs, und manchmal nicht-kodierenden RNA bilden katalytische RNPs, die in ihrer Zusammensetzung variieren; ihre Einzigartigkeit ist auf verschiedene Kombinationen von zugeordneten Faktoren sowie der zeitlichen Abfolge, die Lage und Dauer ihrer Wechselwirkungen 9. RNA Immunpräzipitation (RIP) ist ein leistungsfähiges Verfahren RNPs aus Zellen zu isolieren und zu 10-13 assoziierten Transkripte unter Verwendung von Sequenzanalyse identifiziert werden . Der Umzug von Kandidaten zu genomweite Screening möglich durch RIP ist mit einem Microarray - Analyse 14 oder Hochdurchsatz - Sequenzierung (RNA-Seq) 15 kombiniert. Ebenso Mitfällung Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden können, wenn sie ausreichend reichlich vorhanden und trennbar von dem Co-Ausfällen Antikörper 16 sind,17. Hier sprechen wir die Methodik für RNP Komponenten einer spezifischen kognaten RNA aus kultivierten menschlichen Zellen zu isolieren, obwohl der Ansatz für lösliche Lysate von Pflanzenzellen änderbaren ist, Pilze, Viren und Bakterien. Downstream - Analysen des Materials umfassen Kandidaten Identifizierung und Validierung durch Immunoblot, Massenspektrometrie, biochemische enzymatische Assays RT-qPCR, Microarray, und RNA-Seq, wie in Abbildung 1 zusammengefasst. In Anbetracht der grundlegenden Rolle der RNPs bei der Kontrolle der Genexpression in der post-transkriptioneller Ebene, Veränderungen in der Expression der Komponente RBPs oder deren Zugänglichkeit zu stammverwandt RNAs für die Zelle schädlich sein können und mit verschiedenen Arten von Störungen in Verbindung gebracht, darunter neurologische Krankheit 18. DHX9 / RNA - Helikase A (RHA) ist , die für die Übersetzung der ausgewählten mRNAs von zellulären und retroviralen Ursprungs 6. Diese verwandtes RNAs zeigen strukturell verwandten cis-wirkende Elemente innerhalb ihrer5 &#39;UTR, die als posttranskriptionelles Steuerungselement (PCE) 19 bezeichnet wird. RHA-PCE - Aktivität ist für die effiziente cap-abhängige Translation von vielen Retroviren, einschließlich HIV-1 und von wachstumsregulierenden Genen, einschließlich JUND 6,20,21. Codierte durch ein essentielles Gen (dhx9), ist RHA wesentlich für die Zellproliferation und die Herunterregulierung beseitigt die Lebensfähigkeit der Zellen 22. Die molekulare Analyse von RHA-PCE RNPs ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis, warum RHA-PCE-Aktivität ist notwendig, die Zellproliferation zu steuern. Die genaue Charakterisierung der RHA-PCE RNP Komponenten im stationären Zustand oder auf physiologische Störung der Zelle erfordert die selektive Anreicherung und Erfassung der RHA-PCE RNPs in ausreichender Menge für Downstream-Analyse. Hier retroviralen PCEgag RNA wurde mit 6 Kopien des cis-aktiven RNA-Bindungsstelle für das MS2-Hüllprotein (CP) innerhalb des offenen Leserahmens markiert. Der MS2-Hüllprotein wurde exogenously coexprimiert mit PCEgag RNA durch Plasmid-Transfektion die RNP Anordnung in wachsenden Zellen zu erleichtern. RNPs das MS2 - Hüllprotein mit kognaten MS2-tagged PCEgag RNA enthielten , wurden aus dem Zellextrakt und erfasst auf Magnetkügelchen (Figur 2a) immunpräzipitiert. Um selektiv die RNP-Komponenten erfassen zu dem PCE gebunden wurde das immobilisierte RNP mit einem Oligonucleotid distal der PCE komplementär zu Sequenzen inkubiert, ein RNA-DNA-Hybrid bildet, die das Substrat für RNase-H-Aktivität ist. Da PCE in der &quot;Klemme des 5&#39;5 positioniert ist untranslatierten Region, war das Oligonukleotid komplementär zu den RNA-Sequenzen benachbart zu dem retroviralen Translationsstartstelle (gag-Startcodons). RNase H-Spaltung in der Nähe des gag-Startcodons freigegeben die 5&#39;-UTR-Komplexes aus dem immobilisierten RNP, die als Eluent gesammelt. Danach wurde die Probe mittels RT-PCR ausgewertet, um die Erfassung von PCEgag und durch SDS-PAGE und Immunoblot zur Bestätigung der captu zu bestätigenre des Ziel MS2-Hüllprotein. Eine Validierung der PCE-assoziierten RNA-Bindungsprotein, DHX9 / RNA-Helikase A, wurde dann durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RHA Antikörper</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS Reagenz</td><td>Life Technologie</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy Aufreinigungssäule</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript reverse Transkriptase</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamer Primer</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>PCR-Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>Genspezifische Primer für&nbsp; PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>Oligonukleotid für RNase H-vermittelte Spaltung</td><td>IDT</td><td></td><td>Anti-Sense-Primer für Ziel-RNA</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>Life-Technologie 25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Gewebekulturmedium</td><td>Gibco</td><td>Life-Technologie 11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>Life-Technologie 10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisches Stativ</td><td></td><td></td><td>1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen für</td></tr><tr><td>Laminarhaube</td><td></td><td></td><td>Für tierische Gewebekulturen</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td>Für tierische Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Protein-Gel-Apparatur</td><td></td><td></td><td>Proteinprobentrennung</td></tr><tr><td>Proteinproben-Trennvorrichtung Protein-Probentransfer</td><td></td><td></td><td>Protein-Probentransfer</td></tr><tr><td>Gebrauchsfertig Proteingele (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Trennung von Proteinproben</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td>Pellet nach unten in die Probe</td></tr><tr><td>Tischrotator</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie die Probe von Ende zu Ende</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie die Proben</td></tr></tbody></table>

isolierung von cognate rna-protein-komplexe von zellen unter verwendung von oligonukleotid-gerichtete elution

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonukleoproteinpartikel steuern die Biogenese und posttranskriptionelle Regulation aller mRNAs durch unterschiedliche Kombinationen von RNA-bindenden Proteinen. Sie bestehen aus positionsabhängigen, cis-wirkenden RNA-Elementen und einzigartigen Kombinationen von RNA-bindenden Proteinen. Die Definition der Zusammensetzung eines spezifischen RNP ist essentiell, um ein grundlegendes Verständnis der Genregulation zu erlangen. Die Isolierung eines ausgewählten RNP ist vergleichbar mit der Suche nach der Nadel im Heuhaufen. Hier demonstrieren wir einen Ansatz zur Isolierung von RNPs, die an der 5'-untranslatierten Region einer ausgewählten mRNA in asynchronen, transfizierten Zellen assoziiert sind. Es wurde gezeigt, dass dieses verwandte RNP für die Translation ausgewählter Viren und zellulärer Stressreaktionsgene notwendig ist.
Das demonstrierte RNA-Protein-Co-Präzipitationsprotokoll eignet sich für die nachgelagerte Analyse von Proteinkomponenten durch Proteomanalysen, Immunblots oder geeignete biochemische Identifizierungsassays. Dieses experimentelle Protokoll zeigt, dass die DHX9/RNA-Helikase A am 5'-Ende verwandter retroviraler RNA angereichert ist und liefert vorläufige Informationen für die Identifizierung ihrer Assoziation mit zellstressassoziierten huR- und junD-verwandten mRNAs.

Vor RIP Ergebnisse retroviralen gag - RNAs und ausgewählten zellulären RNAs identifiziert , die Co-Ausfällung mit DHX9 / RHA, einschließlich HIV-1 6, Jund 6 und Hur (Fritz und Boris-Lawrie, nicht veröffentlicht). Die retroviralen 5 'UTR ist gezeigt worden, mit DHX9 / RHA im Kern zusammen auszufällen und im Zytoplasma auf Polyribosomen zusammen isolieren. Es ist eindeutig als das cis - wirkende posttranskriptionales Steuerelement (PCE) 6 definiert...

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Das übergeordnete Ziel dieser RNA-Immunpräzipitationstechnik ist die selektive Isolierung und Charakterisierung endogener RNA-Proteinkomplexe, die in eukaryotischen Zellen durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung gebildet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der posttranskriptionellen Kontrolle zu beantworten, wie z. B. die Zusammensetzung der RNA-Bindungsproteine, die die fünf Haupt-UTR eines retroviralen Transkripts definieren, um seine Genexpression zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es einem Forscher ermöglicht, einen spezifischen RNA-Proteinkomplex von Interesse selektiv zu isolieren und zu charakterisieren, während gleichzeitig die Möglichkeit erhalten bleibt, eine globalere Analyse des RNP stromabwärts durchzuführen.Nun, die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein grundlegendes Verständnis von Virusinfektionen und zahlreichen zellulären Krankheiten. Und bietet einen wichtigen Einblick in die Mechanismen der posttranskriptionellen Kontrolle der Genexpression. Das könnte neue tragfähige Angriffspunkte für Medikamente bedeuten.Nach der Kultivierung von Zellen und der Durchführung der Immunpräzipitation eines FLAG-markierten Proteins gemäß dem Textprotokoll werden 60 Mikroliter pro IP der pro-TG magnetischen Bead-Aufschlämmung in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Stellen Sie das Röhrchen auf ein Magnetgestell und entfernen Sie die Aufbewahrungslösung durch vorsichtiges Pipettieren. Nehmen Sie dann das Rohr aus dem Gestell.Fügen Sie 600 Mikroliter 1x Waschpuffer hinzu. Und legen Sie das Rohr drei Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Ende-über-Ende-Rotator, um die Kügelchen zu waschen und auszugleichen. Legen Sie die Tube auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Waschpuffer.Fügen Sie dann 10 Volumen frischen 1x Waschpuffer hinzu. Geben Sie immunpräzipitierenden FLAG-Antikörper zu den äquilibrierten pro-TG-Magnetbeads. Drehen Sie dann das Röhrchen mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den immunpräzipitierenden Antikörper zu konjugieren.Setzen Sie das Rohr auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand. Nehmen Sie dann die Tube vom Magneten und geben Sie 1x Waschpuffer zu den Kügelchen und drehen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal und entfernen Sie den letzten Puffer.Entfernen Sie das Nährmedium durch Aspiration von den Zellen und verwenden Sie 1,5 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Mit einem Zellschaber lösen Sie die nassen, anhaftenden Zellen. Pipettieren Sie die Zellsuspension in frische Röhrchen und zentrifugieren Sie die Kultur dann vier Minuten lang bei 226 mal G bei vier Grad Celsius.Geben Sie 375 Mikroliter eiskalten Puffer mit niedrigem Salzgehalt in das Zellpellet und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang auf Eis, damit sie aufquellen kann. Es ist wichtig, beim Hinzufügen und erneuten Suspendieren des Zellpellets in dem salzarmen Lysepuffer vorsichtig zu sein, um ein vollständiges Eintauchen und Quellen ohne vorzeitige mechanische Unterbrechung zu gewährleisten. Um das zytoplasmatische Zelllysat zu sammeln, fügen Sie 125 Mikroliter eiskalten Lysepuffer hinzu und verwenden Sie dann einen vorgekühlten Dounce-Homogenisator, um zehn Hübe durchzuführen.Homogenisieren Sie mit genügend Kraft, um die Plasmamembranlyse und die Verunreinigungen des freigesetzten zytoplasmatischen Lysats zu ermöglichen. Achten Sie jedoch darauf, die mechanische Unterbrechung nicht zu überdehnen und eine nukleare Kontamination, eine Störung des RNA-Proteinkomplexes oder einen Verlust der freigesetzten Homogenität zu riskieren. Drehen Sie das Homogenat in einer Mikrofuge eine Minute lang mit Höchstgeschwindigkeit. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis lag.Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration. Reservieren Sie 10 % für die Western-Blot-Analyse, die als Eingangskontrolle verwendet wird. Um eine Immunpräzipitation durchzuführen, fügen Sie das gewünschte Volumen des geernteten Zelllysats zu den konjugierten Antikörperkügelchen des Zielantikörpers hinzu.Mit 1x Waschpuffer das Gesamtvolumen auf 600 Mikroliter bringen und die Probe bei Raumtemperatur drehen. Legen Sie nach 90 Minuten Inkubation das IP-Röhrchen auf das Magnetgestell, um die Kügelchen zu sammeln. Sammeln Sie dann den Überstand und reservieren Sie ihn als Durchfluss.Geben Sie anschließend 10 Volumen eiskalten NETN 150 Waschpuffer zu den RNP-gebundenen, antikörperkonjugierten Kügelchen und drehen Sie die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach dem erneuten Aufhängen der immobilisierten RNP-Komplexe in 1x Bindungspuffer gemäß dem Textprotokoll wird das verbleibende Volumen in 100 Mikrolitern eiskaltem 1x Bindungspuffer angepasst. Und erhitzen Sie die Röhre drei Minuten lang bei 70 Grad Celsius.Um verwandte RNA-Proteinkomplexe zu isolieren, fügen Sie ein DNA-Oligo mit etwa 30 Nukleotiden hinzu, das komplementär zu den drei Hauptsequenzgrenzen der interessierenden RNA ist. Und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren. Geben Sie fünf bis zehn Einheiten oder RNase H in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die RNA vom RNA-DNA-Hybrid abzuspalten.Übertragen Sie dann den Überstand mit den eingefangenen RNP-Komplexen von Interesse in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die immunpräzipitierte RNA zu sammeln, wird die Hälfte der Gesamtprobe der gefangenen RNA-Komplexe in 750 Mikrolitern saurem Guanidiniumthiocyanat-Reagenz resuspendiert. Geben Sie 200 Mikroliter Chloroform in das Röhrchen, schütteln Sie es 10 Sekunden lang kräftig und inkubieren Sie es drei Minuten lang bei Raumtemperatur.Nach der Zentrifugation die wässrige Phase in einem frischen Röhrchen auffangen und ein gleiches Volumen Isopropanol hinzufügen. Gut mischen und die Probe mindestens zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie der Probe einen Mikroliter Glykolblau hinzu und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für eine effiziente Ausfällung oder Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 Mal G bei vier Grad Celsius für zehn Minuten. Verwenden Sie eine P200-Mikropipette, um den Überstand vorsichtig zu sammeln und zu entsorgen, um das RNA-Pellet nicht zu stören. Geben Sie 500 Mikroliter 75%iges Ethanol in jedes Röhrchen.Wirbeln und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang. Sammeln und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, wie gerade gezeigt. Trocknen Sie das Pellet zwei bis drei Minuten lang an der Luft und verwenden Sie 100 Mikroliter RNase-freies Wasser, um es wieder zu suspendieren.Geben Sie 100 Mikroliter der RNA-Probe auf eine RNA-Aufreinigungssäule. Und verarbeiten Sie es gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zum Schluss eluieren Sie die RNA in 30 Mikrolitern RNase-freiem Wasser und lagern sie bis zu drei Monate lang bei minus 80 Grad Celsius.Zur Isolierung von posttranskriptionellen Kontrollelementen oder PCE-, GAG-, RNA- und RHA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in proliferierenden Zellen gebildet werden. Die FLAG-MS2 RNP-Immunpräzipitation wurde in transfizierten HECK293 Zelllysaten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine effiziente Ausfällung des FLAG-MS2-Proteins.Da DHX9/RHA im RNP-Komplex und nicht in der IgG-Isotopenkontrolle oder in der Negativkontrolle vorkommt. Hier sind Western Blots aus RNase H-verdauten RNA-DNA-Komplexen zu sehen. RNase H spaltete PCE GAG RNA und setzte den RNP-Komplex frei, der spezifisch an die fünf Primzahlen UTR gebunden ist.Die DHX9/RHA-assoziierten RNPs wurden in den Eluenten angereichert. Wichtig ist, dass die FLAG-MS2-gebundenen RNPs bei den Antikörper-konjugierten Kügelchen blieben. In diesem Experiment wurde die HO-Immunpräzipitation der MS2-Stammschleife, die retrovirale PCE GAG RNA in Zellen und in Eluenten enthält, mittels RT-PCR und QRT-PCR validiert.Die Ergebnisse bestätigten eine selektive Assoziation zwischen DHX9/RHA und der retroviralen Fünf-Prime-UTR, die als einzigartiges RNP hervorgehoben wurde, das für eine gezielte Translationskontrolle wichtig ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte effizient und sorgfältig durchzuführen, um die Erhaltung intakter RNP-Komplexe und die Isolierung des spezifischen RNP-Komplexes von Interesse zu gewährleisten.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Massenspektrometrie und RNA-Seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die globale Proteinassoziation mit der Ziel-RNA. Und Region oder vollständige Analyse aller Transkripte, die innerhalb eines bestimmten RNP beteiligt sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der posttranskriptionellen Genkontrolle, um die unterschiedlichen RNA-Proteinkomplexe zu erforschen, die die Exspiration pathogener viraler Gene und den allgemeinen Mechanismus der zellulären Genexpressionskontrolle steuern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intakte zelluläre RNP-Komplexe erntet und deren Zusammensetzung durch selektive Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung bestimmt. Vergessen Sie auch nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Viren und biologischen Proben sowie gefährlichen Chemikalien wie Säure oder Phenol äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer alle Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. geeignete persönliche Schutzausrüstung, getroffen werden.

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Biochemie

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RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

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