Flow-Sortierung und Exome Sequenzierung der Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebensfähige Hodgkin-, Reed-Sternberg- oder HRS-Zellen von inflammatorischen, lymphozytären klassischen Hodgkin-Lymphom- oder CHL-Tumoren zu trennen und zu konzentrieren, um qualitativ hochwertige Whole-Exom-Next-Generation-Sequencing-Daten zu generieren und zu analysieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen der CHR-Biologie beantworten, einschließlich der Identifizierung von Schlüsseltreibermutationen, Immun-Escape-Mutationen und auch der Betrachtung der genetischen Vielfalt innerhalb der Klassifikation. Diese Technik liefert aus Tumoren gewonnene DNA, die sehr hochwertig und reinen ist.

Erleichterung der Generierung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken, ohne dass ein Vorverstärkerschritt erforderlich ist. Diese Technik kann wichtige Auswirkungen auf die Diagnose des Hodgkin-Lymphoms haben, da sie bei einer Unterklassifizierung und Prognose hilfreich sein kann. Sie kann auch die Wahl der Therapie beeinflussen, da einige Veränderungen auf eine Anfälligkeit oder Resistenz gegenüber bestimmten Arzneimitteln hinweisen können.

Jonathan From kam auf diese Idee, als er entdeckte, wie man HRS-Zellen mittels Durchflusszytometrie sichtbar machen und die ersten Sortierexperimente mit diesen Zellen durchführen konnte. Mischen Sie vor der Vorbereitung der Zellen die vortitrierten Antikörper in einem dunklen Glasfläschchen. Fügen Sie dann PBS und BSA hinzu, um den Antikörpercocktail auf ein Volumen von 100 Mikrolitern zu bringen.

Und geben Sie das Fläschchen von flüssigem Stickstoff in einen Eiskübel oder Trockeneis. Tauen Sie anschließend die gewünschten Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell auf. Wenn nur noch eine kleine gefrorene Portion übrig ist, gießen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Millilitern 37 Grad Celsius Auftaumedium und spülen Sie das Kryofläschchen zweimal mit einem Milliliter frischem Auftaumedium aus.

Lassen Sie die Zellen nach dem Poolen beider Spülungen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur verdauen. Wenn die Zellen wieder im Gleichgewicht sind, werden sie durch Zentrifugation gesammelt. Saugen Sie alle bis auf die letzten 200 Mikroliter des Überstands an.

Suspendieren Sie die Zellen erneut im restlichen Auftaumedium und lassen Sie die Zellen weitere zwei bis drei Minuten ruhen. Dann inkubieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern des Antikörpercocktails 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in drei Millilitern Sortiermedium und suspendieren das Pellet in einem Milliliter frischem Sortiermedium.

Filtrieren Sie dann die Zellen durch ein Fünf-Milliliter-Sieb mit Durchflussrohr. Spülen Sie das Röhrchen und das Sieb mit einem zusätzlichen Milliliter Sortiermedium und halten Sie die Zellen auf Eis. Bevor Sie mit der Zellsortierung beginnen, wählen Sie in der Durchflusszytometer-Software unter dem Experimentmenü Neues Experiment aus und öffnen Sie das Statusfenster des Geräts.

Löschen Sie auf der Registerkarte "Parameter" alle nicht verwendeten Parameter. Öffnen Sie dann die Registerkarte "Experiment" erneut, und wählen Sie die Kompensationseinrichtung aus, um die Kompensationssteuerelemente zu erstellen. Klicken Sie im Browserfenster auf das Pluszeichen, um das Kompensationskontrollmuster zu erweitern, und führen Sie die Kompensationskontrollrohre aus, ohne die Daten aufzuzeichnen.

Passen Sie die Detektorspannungen nach Bedarf so an, dass die positiv gefärbten Perlenpopulationen für jedes Flora-Chrom zwischen dem Kanal 10.000 und 100.000 liegen. Und zwar von den hellsten in ihrem primären Detektionskanal. Notieren Sie die Spannungen, die für jeden Parameter für jede Röhre benötigt werden.

Klicken Sie dann unter der Kompensationskontrollprobe mit der linken Maustaste, um das ungefärbte Kontrollrohr zu markieren und das ungefärbte Kontrollrohr auf den Probentisch zu laden. Klicken Sie im Fenster zur Erfassungssteuerung auf Laden, und führen Sie die einzelnen Kompensationsregler in die Detektorspannungsfelder für alle Parameter aus, um die ermittelten Spannungen manuell einzugeben. Klicken Sie auf Aufzeichnen, um die nicht gefärbten Kontrolldaten zu erhalten.

Führen Sie dann alle verbleibenden Kompensationsregler aus und zeichnen Sie die Daten auf, ohne die Detektoreinstellungen zu ändern. Wenn alle Kontrollen analysiert wurden, lassen Sie ein Röhrchen mit sterilem deionisiertem Wasser fünf Minuten lang laufen, um das Instrument von Reststoffen zu befreien, bevor Sie fortfahren. Um die Zellen für die HRS-Sortierung zu gaten, laden Sie das Versuchsrohr und zeichnen Sie mindestens 100.000 Ereignisse auf, während Sie die Durchflussrate so anpassen, dass 3.000 bis 4.000 Ereignisse pro Sekunde erfasst werden.

Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Ereignisse aufzeichnen, um eine Grundgesamtheit zu visualisieren, die nur eine von 1.000 Zellen umfassen kann. Um die somatischen B- und T-Zell-Kontrollen zu identifizieren, gaten Sie auf die CD20- bzw. CD5-positiven Zellen. Wenn alle Gates eingestellt sind, sortieren Sie die Zellen in vorgekühlte konische 15-Milliliter-Röhrchen mit sieben bis acht Millilitern Sammelmedium.

Am Ende der Sortierung werden die isolierten Zellpopulationen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie dann die Zellen in einem Milliliter frischem PBS und entfernen Sie die Überstände von jedem Röhrchen, wobei Sie darauf achten, die winzigen Kügelchen nicht zu stören.

Nach der Bibliotheksamplifikation und der Reinigung der Beads an Punkt 8X sollte eine normale Lichtverteilung der Fragmentgrößen im gewünschten Bereich beobachtet werden. Bibliotheken, die Abweichungen von dieser Form aufweisen, weisen auf das Vorhandensein eines Artefakts mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht hin und sollten idealerweise nicht sequenziert werden. Zum Beispiel kann ein Adapterdimer manchmal durch die erste spitze X-Perlenreinigung übertragen werden und als scharfer Peak erscheinen, der um 125 bis 130 Basenpaare zentriert ist.

In diesem Fall sollte eine zusätzliche Reinigung der spitzen X-Raupe durchgeführt werden, gefolgt von einer wiederholten Visualisierung der Größenverteilung, um die erfolgreiche Entfernung des Dimers sicherzustellen. Nach der Multiplex-Sequenzierung von vier Proben pro Spur ist eine mediane Abdeckungstiefe von 50 bis 100x über das Ziel erreichbar. Obwohl Kopienzahldiagramme, die aus einer Ein-Nanogramm-Bibliothek generiert werden, zu unechten Kopienzahlgewinnen und -verlusten führen können.

Etwa 70 % der Fälle von klassischem Hodgkin-Lymphom tragen B2M- und 820-Mutationen und/oder Deletionen, die klonal zu sein scheinen und zur Abschätzung des relativen Tumorgehalts verwendet werden können. Wenn T-Zellen als somatische Kontrollen verwendet werden, zeigt die HRS-Sequenzierung signifikante Kopienzahlzuwächse in den Positionen, die den Alpha-, Delta- und Beta-Positionen des T-Zell-Rezeptors entsprechen. Sowie signifikante Verluste in den B-Zell-Rezeptor-, Schwer- und Kappa-Leichtkettenpositionen mit einer Gesamtmutationslast von 100 bis 400 somatischen Mutationen pro Exomfall.

Einmal gemeistert, kann diese Technik, einschließlich der Zellsortierung und des Aufbaus der Sequenzierungsbibliothek, in drei bis vier Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können wir größere prospektive Studien und andere Methoden wie Epigenetik, Proteomik und Metabalomik durchführen, um mehr Wissen über das Hodgkin-Lymphom zu gewinnen und zu spezifischeren personalisierten Therapien voranzukommen. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte uns die Methode, HRS-Zellen mit hoher Reinheit in relativ großer Zahl zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HRS-Zellen isoliert und ihre Genomanalyse einleitet.