Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine schnelle und genaue Genotypisierung von toxischen Kugelfischen durch die Analyse kleiner PCR-Amplikons durchzuführen. Der essbare Teil des Kugelfisches, der für die Zubereitung des Kugelfischgerichts verwendet wird, variiert je nach Art und einige der Arten enthalten Giftstoffe im ganzen Körper. Dieser Muskel, die Datenbank und masu und die Flossen- und Geburtshaut von Kugelfischen können bei der Genotypisierung von Kugelfischen vom Standpunkt der vollen Sicherheit des Futters für alle und für die Untersuchung helfen.

Um eine DNA-Extraktion mit einem Kit durchzuführen, geben Sie zunächst 30 bis 50 Milligramm Fischgewebe in ein 0,5- oder 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zerdrücken Sie das Gewebe ohne Flosse und Haut mit einem Mikrospatel. 180 Mikroliter des tierischen Gewebelysepuffers und 40 Mikroliter Proteinase k zugeben und kurz vortexen.

Inkubieren Sie bei 56 Grad Celsius auf einer Blockheizung für zwei Stunden oder über Nacht. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 13000 xg. Nach dem Transfer des Überstands in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen fügen Sie 200 Mikroliter des chaotropen Puffers hinzu, der Guanidinhydrochlorid aus dem Kit enthält.

Fügen Sie dann 200 Mikroliter 99,5%iges Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Vortexen. Übertragen Sie die Mischung einschließlich des Niederschlags in die Schleudersäule und geben Sie sie in ein Auffangröhrchen von zwei Millilitern. Nach einer Minute Zentrifugieren bei 13000 xg ist der Durchfluss zu verwerfen.

Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer eins hinzu, der Guanidinhydrochlorid aus dem Kit enthält, und zentrifugieren Sie wie zuvor. Entsorgen Sie den Durchfluss und das Auffangrohr. Setzen Sie die Schleudersäule in ein neues, mit dem Kit geliefertes Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen ein.

Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 20.000 xg. Nach dem Entleeren des Durchflusses und des Auffangröhrchens wird die Spinsäule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt. Pipettieren Sie 200 Mikroliter des Elutionspuffers in die Mitte der Spinsäulenmembran

Nach einer Minute eine Minute lang bei 6000xg zentrifugieren. Pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der Aluette in eine UV-Einwegküvette. Messen Sie das ultraviolette Spektrum der Aluette bei 220 bis 300 Nanometern und die Extinktion bei 260 Nanometern mit einem Spektralphotometer.

Die Verwendung von detergenzienfreien Reagenzien ist entscheidend für den Erfolg der Flüssigchromatographie, da Reagenzien in der Tat mögliche Schäden an der analytischen Säule verursachen können. Um eine Kontamination zu vermeiden, arbeiten Sie auf einer Reinbank und richten Sie für jede extrahierte DNA-Probe eine 25-Mikroliter-PCR ein, eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle, auf Eis, wie im Textprotokoll beschrieben. Für eine einfache Bedienung stellen Sie eine ausreichende Menge Cocktail her, der alle Reagenzien ohne Template-DNA enthält, und geben Sie ihn ab.

Verwenden Sie DNA-Polymerase mit Korrekturleseaktivität, um die Zugabe von drei Hauptadeninüberhängen zum PCR-Produkt zu vermeiden. Führen Sie die PCR-Amplifikation auf einem Thermocycler mit dem im Textprotokoll gezeigten Zyklusprogramm durch. Um den enzymatischen Aufschluss durchzuführen, geben Sie zwei Mikroliter des enzymatischen Aufschlusspuffers in die PCR-Lösung.

Von jedem Restriktionsenzym einen Mikroliter zugeben und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Thermocycler, gefolgt von fünf Minuten bei 72 Grad Celsius. Filtrieren Sie die Reaktionslösung mit einer Zentrifugalfiltervorrichtung von 0,2 bis 0,5 Mikrometern, um Verstopfungen zu vermeiden und eine Beschädigung der Analysesäule zu vermeiden.

Übertragen Sie das Filtrat in ein konisches Polypropylen-Fläschchen und lagern Sie es bis zur Analyse bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Lösung aus Hexafluorisopropanol und Triethylamin in einer Ein-Liter-Flasche vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schließen Sie die Flasche an Leitung A des Flüssigkeitschromatographie-Instruments an und kühlen Sie die Flasche mit einem tragbaren Kühlschrank mit Direktkühlung, um eine Verdampfung zu verhindern.

Schließen Sie eine weitere mit Methanol gefüllte Flasche an Leitung B an.Verbinden Sie die Vorsäule und die Analysesäule mit dem Gerät. Beginnen Sie mit dem Ablauf der anfänglichen mobilen Phase, um die Säulen auszugleichen. Wenn Sie ein Massenspektrometer ohne Software zur Steuerung des C-Trap-Drucks verwenden, müssen Sie den Druck des C-Trap durch manuelle Steuerung des Balkens reduzieren.

Ziehen Sie dazu den Knopf zum Entriegeln und drehen Sie den Knopf sehr langsam gegen den Uhrzeigersinn, um den Hochvakuumdruck auf 1/3 zu reduzieren. Der angezeigte Druck sollte sich allmählich und verzögert ändern. Ignorieren Sie die Warnmeldung über den Niederdruck.

Drücken Sie den Knopf, um ihn zu verriegeln. Nach dem Einrichten für die Kalibrierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bewegen Sie die erhitzte Elektrospray-Ionisationssonde näher an die Grenzfläche des Massenspektrometers in Position B.Verbinden Sie sie mit der Sonde und einer Spritze mit einem Schlauch. Gießen Sie das Kalibrant konstant mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute mit der eingebetteten Spritzenpumpe.

Überprüfen Sie nur die sechs Ionen mit geringerer Masse in der benutzerdefinierten Kalibriertabelle. Fahren Sie mit der Kalibrierung fort, nachdem sich die Intensität der Signale stabilisiert hat. Überprüfen Sie nach der Kalibrierung nur die sechs Ionen mit höherer Masse und fahren Sie mit der Kalibrierung fort.

Vermeiden Sie die Kalibrierung mit allen Ionen auf einmal, um Ausfälle zu vermeiden. Bewegen Sie die Sonde für eine Durchflussrate von 0,4 Millilitern pro Minute in Position D und verbinden Sie sie mit einem inerten Metallschlauch mit dem Gerät. Nachdem Sie die Parameter wie im Textprotokoll beschrieben eingestellt haben, reinigen Sie die Blasen, indem Sie auf die Böden der Fläschchen klopfen.

Stellen Sie die Probenfläschchen auf das Probengestell und injizieren Sie einen Mikroliter einer Probe mit dem Autosampler, um die Analyse zu starten. Öffnen Sie die Rohdatendateien mit einer Browsersoftware und bestätigen Sie, dass alle Erfassungen, einschließlich der Positiv- und Negativkontrollen, erfolgreich abgeschlossen wurden. Richten Sie eine Methode ein, wie im Textprotokoll beschrieben, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen auf der Registerkarte Run Cue, um die Dekonvolutionssoftware zu starten.

Nachdem der Cue abgeschlossen ist, wählen Sie eine Zeile aus und klicken Sie in der oberen Beschriftung auf Ergebnis öffnen, um die Ergebnisse der Entfaltung zu erhalten. Hier ist ein typisches Gesamtionenstrom-Chromatogramm, das aus einer Negativkontrolle und einer Kugelfischprobe gewonnen wurde. Jeder Peak stellt einen DNA-Duplex dar, der anhand seiner Länge getrennt wird.

In diesem Beispiel werden drei Peaks aus der Kugelfischprobe beobachtet. Diese Peaks sind das Ergebnis des Amplikonverdaus mit zwei Endonukleasen. In der Negativkontrollprobe werden keine Peaks beobachtet.

Jeder Peak repräsentiert ein Massenspektrum, das aus mehrfach geladenen Ionen besteht. Durch die Vergrößerung des Massenspektrums können Dutzende von isotopenaufgelösten Peaks erkennbar werden. Diese Auflösung ist eine Voraussetzung für die Bestimmung der monoisotopischen Masse und nur mit einem hochauflösenden Massenspektrometer möglich.

In diesem Beispiel betragen die monoisotopischen Massen des dritten Peaks 16296,7656 und 16468,6616 Dalton. Unter Berücksichtigung einer Massentoleranz von drei ppm sind die Messwerte identisch mit den theoretischen Werten von Takifugu rubripes, wie hier gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Tag mit gängigen Instrumenten und Apparaturen durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kleine Amplikons mittels Flüssigchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie für die Genotypisierung analysiert. Die Technik kann bei der Analyse anderer DNA-Polymorphismen angewendet werden, vorausgesetzt, die Sequenzvariation spiegelt sich in den zu analysierenden kleinen Amplikons wider. Bei dieser Technik werden jedoch nur Basenzusammensetzungen identifiziert, eine Basensubstitution innerhalb desselben Mercures kann nicht unterschieden werden.