Name: Die Untersuchung Räuberische Fütterung Behaviors in Pristionchus Und andere Nematoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Analyse räuberischer Fütterungsverhaltensweisen bei Nematoden mit Fokus auf Pristionchus pacificus. Diese Techniken ermöglichen die Quantifizierung von Fütterungsanpassungen und die Visualisierung von Mundstrukturen für die Verhaltensneurobiologie.

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Wir danken Dr. Daniel Bumbarger für das Bild des Raubtierverhaltens. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft gefördert.

1. Mundform Phänotypisierung <ol><li> Mouth Formularidentifizierung auf Agarose - Pads Hinweis: Um die Nematoden Mund Morphs zu visualisieren, zu immobilisieren, die Würmer mit einer milden Betäubung Behandlung auf Agarose-Pads und beobachten Sie wie folgt vor. <ol><li> Wachsen und Nematodenkulturen wie P. aufrechtzuerhalten pacificus auf 6 cm Standard Nematoden Nährmedien (NGM) Platten und ernähren sich von einem Bakterienrasen von E. coli OP50 19. </li><li> Machen Agarose pads , indem zuerst 0,06 g Agarose zu 3 ml H 2 O in einem 15 - ml - Röhrchen Zugabe von 3 ml 2% igen Lösung herzustellen. Dies kann bis zu einem Jahr bei 4 ° C gelagert werden , </li><li> Mischen und Schmelzen der Agarose gründlich in einer Mikrowelle oder alternativ einen Wärmeblock verwenden auf&gt; 88 ° C </li><li> Sobald sie vollständig geschmolzen ist, fügen 10 ul einer 10% Natriumazid Lösung der Agarose und gründlich mischen. ACHTUNG: Trockene Natriumazid reaktiv ist und alle Formen sind giftig. </li><li> Unter Verwendung einer 1 mlMikropipette einen Tropfen von nicht weniger als 300 &amp; mgr; l des flüssigen Agarose-Azid-Mix auf der Mitte eines Standard-Objektträger aus Glas. </li><li> Vor dem Agar abkühlt, stellen schnell ein zweites Mikroskop-Objektträger auf der Oberseite des Tropfens, um die Agarose zu glätten, die sich beim Abkühlen ein Polster bildet. Wiederholen Sie dies für so viele Pads wie erforderlich ist. </li><li> Kurz vor schälen zu verwenden auseinander, die Glasobjektträger, indem sie aufeinander ab gleitet. Hinweis: Wenn Agarose-Pads zu weit im Voraus vorbereitet werden, können sie zu trocken sein und die Nematoden beschädigen können. </li><li> Zur Übertragung von Würmern auf die Betäubung Agarose-Pads, einen Tropfen von M9-Puffer (2 - 3 ul) auf die Mitte des Pads. Wählen Sie 2 - 3 junge P. pacificus Erwachsene in den Tropfen M9 vor einem Deckglas vorsichtig über das Pad platzieren. Die P. pacificus Nematoden werden in der Agarose und bereit immobilisiert werden sichtbar zu machen. </li><li> Übertragen Sie die Objektträger der narkotisierten Wurm auf ein geeignetes Mikroskop ein enthält,nd beobachten unter 63X Nomarski-Optik. Kategorisieren Morph-Identitäten auf der Grundlage der folgenden Merkmale: das Vorhandensein einer zusätzlichen Unter ventralen Zahn, vergrößerte Dorsalzahn und breite Mundöffnung ist ein Hinweis auf einen eurystomatous Mund Morph Tier, während die Anwesenheit eines einzelnen Dorsalzahn und schmaler Mundöffnung eine stenostomatous zeigt Tier (Abbildung 1). Hinweis: Um die Gesundheit des Tieres zu halten, Würmer sollte nicht länger als 5 Minuten auf dem Agar-Pad gehalten werden. </li><li> Nach dem Mund Morph-Identifikation, erholen entweder eurystomatous oder stenostomatous Nematoden, wie sie durch leichtes Verschieben des Agarose-Pad aus, indem das Deckglas erforderlich. Auf frische NGM - Platten sorgfältig wählen Sie die ausgewählten Tiere aus dem Agarose - Pad (es klebriger machen kann E. coli OP50 auf dem Pick verwendet werden , um). Lassen Sie Erholung von der Narkose, bis die normale motile Verhalten wieder aufgenommen hat, auf denen Tiere für weitere Raub Assays bereit sind. </li></ol></li> &lt;li&gt; Rapid - Mouth Phänotypisierung Hinweis: Alternativ mit mehr Erfahrung, Mund Formulartyp kann über eine Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung (150X) ohne die Notwendigkeit einer Narkose Behandlung getestet werden. <ol><li> Platz Nematoden auf Standard - NGM - Platten mit einem Bakterienrasen von E. coli OP50 auf das Mikroskop - Sichtbereich. </li><li> Erkennen Unterschiede in den Mund Größe und Breite. Hinweis: Bei dieser Vergrößerung kein Zahn artige Strukturen beobachtbar sind daher Identifizierung Mund Morph basiert ausschließlich auf breiten Mund im Vergleich zu schmalen Mund. </li></ol></li></ol> 2. Biss Assay Hinweis: Biting-Assays eine detaillierte räuberische Verhaltensanalyse ermöglichen. <ol><li> Wachsen und Nematodenkulturen auf Standard - NGM - Platten (6 cm) und ernähren sich von einem Bakterienrasen von E. halten coli OP50 19. </li><li> Machen Testplatten durch eine große Menge an ausgewählten Beute Nematodenlarven wie C. wachsenden elegans oder alternativ eine entsprechende ökologisch relevante Beute. Hinweis: Erwachsene C. elegans sind zu groß , geeignet zum Opfer zu sein , so dass es wichtig ist , die Larvenstadium zu verwenden. <ol><li> Pflegen C. elegans oder andere potenzielle Beutetiere auf Standard - NGM - Platten und Futter auf einem Bakterienrasen von E. coli OP50 , bis die Bevölkerung frisch verhungert, in einer Fülle von jungen L1 - Larven zur Folge hat . Anmerkung: Zeit für Hungern auf zahlreiche Umwelt und experimentelle Faktoren abhängig ist, einschließlich der Anzahl von Nematoden verwendet , um die Kultur zu starten, wird die Menge an E. coli OP50 gegeben, und die Umgebungstemperatur. </li></ol></li><li> Waschen Sie vier oder mehr frisch verhungert Beute Platten mit M9 und der Wurm-Lösung durch zwei 20 &amp; mgr; m-Filter passieren alle großen Tiere und alle verbleibenden Eier in einem 15-ml-Röhrchen vor dem Sammeln zu entfernen. Nur kleine Larven sollten in der Lösung verbleiben. </li><li> Zentrifugieren des gefilterten Beute bei 377 × g für 1 min, um ein Larven Pellet bilden. </li><li&gt; Pipette 3 ul reinen Schnecken Pellet auf eine 6 cm NGM Platte ohne E. coli OP50 vorhanden und warten Sie mindestens 30 Minuten für Larven ausreichend , um sich auszubreiten eine Testplatte zu erzeugen. Hinweis: 3 ul reinen Schnecken Pellet auf den Standard-Testplatten enthalten&gt; 3.000 Beute Larven. Dies ist ausreichend häufigen Kontakt zwischen Räuber und Beute zu erzeugen. </li><li> Bildschirm räuberische Nematoden für die erforderliche Mund Morph (Protokoll 1). </li><li> Unter Verwendung von Standard Wurm Picking und eine leichte Stereo 19, übertragen korrekt klassifizierten Räuber auf die Assayplatte. Achten Sie darauf, so wenig OP50 Bakterien wie möglich an der Testplatte zu übertragen, wenn Räuber, um die Übertragung bakterielle Kontamination zu minimieren. Warten Sie 15 min die Schnecke zu ermöglichen, von dem Stress wird übertragen und prüfen für Wildtyp-motile Verhalten zu erholen Würmer, um sicherzustellen, nicht bei der Übertragung beschädigt wurde. Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit , zu verhungern P. pacificus, da sie hocheffiziente Räuber von anderen Nematodenlarven sind auch während der gut auf Bakterien gefüttert. </li><li> Nach der Wiederherstellung beachten Sie die Räuber für 10 Minuten ein leichtes Stereomikroskop. Mit dieser Ausrüstung beobachten und verschiedene Fütterungs Ereignisse charakterisieren wie Beißen, durch die Räuber gekennzeichnet , die Bewegung der Beute zu beschränken, zu töten, wo durch eine Öffnung der Beute Kutikula erfasst wird ; und Fütterung, kategorisiert durch einen beobachtbaren Verbrauch der Beute Innereien (2A, B und Film 1). </li><li> Wiederhole den Test durch Absuchen und ein Minimum von 10 einzelnen räuberische Nematoden Beobachtungsgenauigkeit sicherzustellen. </li></ol> 3. Corpse Assay Hinweis: Corpse-Assays eine schnellere Quantifizierung von räuberischen Verhalten erleichtern. <ol><li> Wachsen und Nematodenkulturen auf Standard-NGM-Platten und ernähren sich von einem bakteriellen l haltenawn von E. coli OP50 19. Erzeugen Triplikaten der Testplatten zuvor erwähnten (protocol 2,1-2,5). </li><li> Bildschirm räuberische Nematoden für die erforderliche Mund Morph wie in Protokoll 1 beschrieben Unter Verwendung von Standard Wurm Picking und eine leichte Stereoübertragung 5 räuberische Nematoden mit der erforderlichen Mund Morph zu jeder Testplatte. Lassen Sie die Räuber zusammen mit der Beute für 2 Std. </li><li> Nach 2 Stunden der Testplatte auf das Vorhandensein von entleerten Leichen (2B und C) auf dem Bildschirm. Identifizieren Leichen durch das Fehlen der Beweglichkeit zusammen mit offensichtlichen morphologischen Defekte einschließlich undichten Innereien oder fehlende Wurm Fragmente. </li></ol> 4. Analyse der Pharyngeal und Zahnbewegung <ol><li> Wachsen und Nematodenkulturen auf Standard - NGM - Platten und ernähren sich von einem Bakterienrasen von E. halten coli OP50 19. Erzeugen Assayplatten wie zuvor erwähnt (protocol 2,1-2,5). Wenn Standard 6 cmNGM-Platten passen nicht zwischen dem Objektiv und dem Mikroskoptisch, verwenden Sie den Deckel der kleinen 35-mm-Petrischalen mit 2 ml NGM als eine geeignete Alternative. </li><li> Bildschirm räuberische Nematoden für die erforderliche Mund Morph wie in Protokoll 1 beschrieben Standard Wurm Mit Picking und eine leichte Stereo, übertragen eine einzige richtig klassifiziert Räuber auf die Assayplatte. Warten Sie 15 min die Schnecke zu ermöglichen, von dem Stress wird übertragen zu erholen. </li><li> Beobachten Raubtiere auf einem Mikroskop bei 40 - 63X Normaski, mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (Filme 2 und 3). Record pharyngealen Pump- und Zahnbewegung über 15 sec, bei 50 Hz in mindestens 20 Tiere genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Replay aufgenommenen Filme mit der gewünschten Geschwindigkeit, um einzelnen Pumpen und Zahn Ereignisse zu zählen. Anmerkung: Pumping ist im corpus beobachtet, in der Mitte des Pharynx angeordnet, während der Zahnbewegung in der Mündungsöffnung nachweisbar ist und nur obvom Dorsalzahn serviert. </li></ol>

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Die Autoren erklären keine finanziellen oder konkurrierenden Interessen.

Nematoden bieten ein leistungsfähiges System für das Verständnis der Neurobiologie und Verhalten mit C. elegans ist bisher das wichtigste Werkzeug. Doch zahlreiche Nematodenarten einschließlich P. pacificus Anzeigeverhalten, die nicht vorhanden sind oder variieren in Komplexitäten aus dem Modellorganismus C. elegans und deshalb erhöhen faszinierende Fragen in Bezug auf die Entwicklung und die Regulierung dieser Verhaltensweisen. Ein solches zusätzliches Verhalten in vielen anderen Nematodenarten einschließlich P. gefunden pacificus ist die Fähigkeit , ihre bakterielle Ernährung zu ergänzen durch 1 in räuberische Fütterung Eingriff, 20. Daher haben wir entwickelt und beschrieben ein detailliertes Protokoll für eine einfache und schnelle Charakterisierung dieser bisher nicht analysierte räuberische Verhalten in Nematoden. Erstens haben wir Methoden zur Verfügung gestellt in der Fütterung Apparat innerhalb der Nematoden Mund für Variationen zu screenen. Die Identifizierung der richtigen Mund Typ ist ein erster wichtiger step für eine erfolgreiche predation Assays wie, zumindest innerhalb der Pristionchus Gattung nur eurystomatous Tiere fähig ist räuberischen Fütterung sind. Es ist am besten zu identifizieren Mund mit dem &quot;schnellen Mund Phänotypisierung&quot; Protokoll in Protokoll 1.2, da dieses Verfahren beschrieben Morphs ist viel weniger invasiv und daher ist es weniger wahrscheinlich, dass räuberische Verhalten gestört werden kann. Es wird jedoch empfohlen, zuerst mit den verschiedenen Mundstrukturen durch Identifikation mit anästhesierten Tieren auf Agar pads (Protokoll 1.1) vertraut. Nach der Identifizierung der gewünschten Mund morph, haben wir zwei Assays beschriebenen Verdrängungsfütterungs zur Quantifizierung. Es handelt sich um ein schnelles, mit hohem Durchsatz &quot;Leiche Assay&quot; (Protokoll 3) und einer mehr zeitaufwendig, sondern mehr in die Tiefe Verhaltensanalyse durch den &quot;Biss-Test&quot; (Protokoll 2). Beide Protokolle sind sehr flexibel, so dass mehrere Modifikationen, um die Tests in Abhängigkeit von den experimen zu optimierental Anforderungen. Für Biss Assays P. mit pacificus Räuber auf C. elegans Beute, Beobachtungen von räuberischen Verhaltens - Interaktionen für ein Zeitfenster von 10 Minuten war ausreichend , um eine erhebliche Menge an Bissen zusammen mit anderen Fütterung Ereignisse zu quantifizieren. Für &quot;Leiche Assays&quot; wieder P. Verwendung pacificus Räuber auf C. elegans Beute, 5 Räuber für 2 Stunden produziert leicht zu quantifizieren und konsistente Zahlen Leiche für eine schnelle Verhaltensanalyse ermöglicht. Es sollte jedoch verschiedene Arten von räuberischen Nematoden bewegen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu beachten, essen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und in der Regel eine große Vielfalt in andere Verhaltensweisen 1 zeigen. Zusätzlich können verschiedene Beutearten auch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus ähnlichen Gründen gegessen werden. Es wird deshalb empfohlen, die Tests empfohlen, auf die Nematodenarten getestet sowohl als Räuber und Beute, und auch für alle Unterschiede in den Umweltbedingungen auf Basis zu optimieren. Während beide &quot;Biss&quot; und &quot;Corpse &quot;Assays ist es entscheidend, dass sowohl Beute und Räuber gesund sind, werden wie gestresst oder verletzt Räuber nicht effizient töten. Außerdem sind frische Testplatten wesentlich ältere Platten ausgetrocknet werden kann, was sich negativ auf die Gesundheit der Nematoden wirkt sich auf fehlerhafte führende Assays. Es ist zu hoffen , dass auch künftige Iterationen dieser räuberischen Assays Lage , die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Technologie , um viel von der Analyse zu automatisieren wie ausgeführt wurde in C zu nehmen sein wird elegans 21, 22 beobachtet viele Verhaltensweisen für die Untersuchung. zur Zeit Probleme in Nematoden entstehen dürften, wie P. pacificus , da sie viel empfindlicher zu kontaktieren, so dass die Isolierung und Immobilisierung in mikrofluidischen Kammern wahrscheinlich räuberischen Fütterung abschaffen erscheinen. Die Überwindung dieser Herausforderung erweisen können würde , aber einzelne Nematoden erleichtern , um für subtilere räuberische gescreent werden Verhaltensweisen. Schließlich haben wir auch vorgesehen Verfahren for Prüfung der Nematode Zuführungsvorrichtung selbst Vergleiche zwischen den räuberischen und bakteriellen Zufuhrmodi zu erleichtern, indem die Zahn und Rachenpump Kinetik Quantifizierung einer Hochgeschwindigkeitskamera mit (Protokoll 4). Die Quantifizierung der Schlundpumpraten in C. elegans wurde Fütterung seit vielen Jahren zur Überwachung genutzt 23, jedoch C. elegans fehlt jede Form von Mund denticle und es fehlt auch räuberische Verhalten. Durch die Quantifizierung der Rachen mit der Zahn Aktivität, jede Innervation der Zähne spezifisch predation Pumpen kombinieren kann ebenfalls beobachtet. Aufgrund der Vergrößerung der Zahnbewegung zu beobachten erforderlich die Tiere oft aus der Fokusebene zu bewegen, so ist es in der Regel nur möglich, den Zahn für kurze Zeitfenster zu beobachten. Außerdem, im Gegensatz zu C. elegans, des Rachens von P. pacificus nicht kontinuierlich pumpen, sondern greift es in Phasen der Pump und Fütterung. Daher ist für eine genaue pharyngealen PUMwährend der Fütterung Ping-Raten bestimmt werden, ist es wichtig, 15 Sekunden kontinuierlicher Zuführung aufzuzeichnen. Diese hier vorgestellten Methoden bieten daher den ersten Rahmen für die räuberische Verhalten in Nematoden Systeme zu untersuchen. Darüber hinaus können sie auch anpassungsfähig sein , für den Einsatz bei der Untersuchung anderer Wechselwirkungen innerhalb des Nematoden - Ökosystem einschließlich des Einflusses von zusätzlich ökologisch relevanten Organismen auf predation einschließlich Mikroorganismen, Pilzen und Milben . So bieten sie ein Mittel zu sezieren, wie diese räuberische Verhalten geregelt werden, wie sie sich entwickelt haben und auch ihre ökologische Bedeutung.

Nematoden mit ihren kleinen, aber komplexen Nervensysteme haben für das Verständnis vieler Aspekte der Neurobiologie einschließlich des Verhaltens leistungsfähige Werkzeuge bewährt. Ein großer Teil dieser Forschung hat sich auf dem Modellorganismus Caenorhabditis elegans konzentriert , in denen eine Fülle von unterschiedlichen Verhaltensweisen erfolgreich seziert und analysiert. Dazu gehören mechanosensorischen 3, chemotaktische 4, thermotactic 5,6 und magnetotactic 7 Beeinflussung der Paarung 8,9, das Lernen 10 und Fütterung Verhaltensweisen 11. Aber auch andere mehr weitläufig verwandt Nematodenarten zeigen Verhaltensweisen , die nicht in der rhabditid C beobachtet elegans oder zeigen alternativ zusätzliche Ebenen der Komplexität, die in Bezug auf ihre Entwicklung und Regulierung relevanten Fragen aufwirft. Eine solche Instanz kann dies in der entfernt verwandten diplogastrid Nematoden Pristionchus pacificus, beobachtet werden , die Fütterung viel komplexer zeigt seinhaviors und Rhythmen als in C beobachtet werden elegans 1. Dies ist trotz der beiden Arten homologe Rachen Neuronen 12 zu teilen. Zeitgleich mit dieser zusätzlichen Fütterungsverhalten, P. pacificus zeigt auch ein Ernährungsprogramm erweitert, da sie eifriger Räuber sind, der fähig ist , ihre bakterielle Ernährung zu ergänzen , indem auch auf die Larven anderer Nematoden ernähren. Zum Glück, P. pacificus wurde für vergleichende und integrative Evolutionsbiologie und deshalb viele molekulare und genetische Werkzeuge sind jetzt als Modell entwickelt. Dazu gehören ein vollständig sequenzierten und kommentierte Genom 13, molekularen und genetischen Werkzeuge einschließlich Transgene 14 und CRISPR / Cas9 15,16 sowie eine detaillierte und gut kommentierten Phylogenie 17 mit über 25 eng verwandten Arten einschließlich der neu entdeckten Schwesterarten. Darüber hinaus, auch die Ökologie der zahlreichen Pristionchus Arten P. pacificus ist , dass wirll mit vielen Arten definiert haben nun beschrieben eine necromenic Verbindung mit Skarabäen teilen, einen Wirt sie häufig mit anderen Nematodenarten 18 teilen. P. pacificus bietet daher ein ausgezeichnetes Modellsystem , mit dem die Entwicklung neuer Verhaltensweisen und ihre ökologische Bedeutung zu sezieren. Um Raub Fütterung Verhalten in Nematodenarten wie P. zu analysieren pacificus wir mehrere neue Verhaltenstests für die einfache Beobachtung und Quantifizierung von räuberischen Aktionen entwickelt. Als P. pacificus zeigt eine dimorphic Mund - Struktur, die stark räuberische Verhalten beeinflusst, die Identifizierung des korrekten Morphotyp wesentliche 1,2 ist. Der schmale Mund stenostomatous Morph enthält einen einzigen stumpfen Dorsalzahn und beteiligt sich nicht an Verdrängungs Fütterung. Alternativ umfasst die breiten Mund eurystomatous morph eine viel größere claw förmigen dorsal Zahn und einen zusätzlichen entgegenUnter ventralen Zahn, die zusammen arbeiten effizient die Kutikula ihrer Beute zu öffnen. Das Verhältnis des räuberischen eurystomatous auf die nicht räuberischen stenostomatous Form variiert unter Pristionchus Arten und auch innerhalb P. pacificus jedoch morphen der Anteil der eurystomatous Mund im P. pacificus Wildtyp - Stamm (PS312) ist in der Regel 70 bis 90% 2. Zusätzlich können die Mundform Verhältnisse auf unterschiedliche Umwelteinflüsse schwanken kann (beide bekannt sind, einschließlich Hunger und einige kleine Molekül sowie unbekannte Faktoren signalisieren), so dass eine korrekte Identifizierung und Isolierung des räuberischen eurystomatous Mund Form ist entscheidend für die erfolgreiche räuberische Assays. Neben der Beschreibung der räuberischen Mund Form haben wir einen &quot;Biss-Test&quot; für die direkte Beobachtung und Quantifizierung von räuberischen Verhalten einschließlich Beißen entwickelt, die Tötung und Fütterung Ereignisse. Hier Beute Nematoden sind getrennt durch Filtering neu ausgehungert Kulturen und zu räuberischen Erwachsenen P. ausgesetzt pacificus, die zusammen über eine kurze Zeitspanne eingehalten werden. Darüber hinaus haben wir auch einen hohen Durchsatz &quot;Leiche Test&quot; entwickelt, um ein schnelles Screening von räuberischen Verhalten durch indirekte Beobachtung der räuberischen Ereignisse erleichtern. Dies nutzt die Anwesenheit von larvalen Leichen als Werkzeug für predation zu screenen. Beide Assays bieten eine einfache und hoch reproduzierbare Methoden zur Beobachtung und räuberische Verhalten in Nematodenarten wie P. Mess pacificus.

<table><tbody><tr><td>Netzfilter aus Nylon (20 &#181; m)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>Wird verwendet, um Würmer zu filtern, die nur Larven als Beute übrig lassen.</td></tr><tr><td>PP Trichter für Filter (54 mm)</td><td>Duran</td><td>292215003</td><td>Wird verwendet, um Würmer zu filtern, die nur Larven als Beute übrig lassen.</td></tr><tr><td>Kleine Petrischale (35/10 mm)</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>627102</td><td>Für die Bildgebung auf Hochgeschwindigkeitskameras</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>Für die Mundformbestimmung</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>Für die Mundformbestimmung</td></tr><tr><td>Glasdias</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>Motion Scope M3 Highspeed Kamera</td><td>IDT</td><td></td><td>Hochgeschwindigkeitskamera</td></tr><tr><td>Videozoom 44 ENG 1/2" 0,5X bis 2,4X Zeis</td><td></td><td>452984-0000-000</td><td>Hochgeschwindigkeitskamerazoom</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM) Inhaltsstoffe:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>Bacto Trypton</td><td>BD</td><td>211699</td><td>Los 4316614</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Cholesterin aus Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm Petrischale</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 Zutaten:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>ACROS</td><td>organics 271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>Natriumhydrogenphosphat-Heptahydrat (NaHPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-NR. 7782-85-6</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

die untersuchung räuberische fütterung behaviors in<em&gt; pristionchus</em&gt; und andere nematoden

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Dieses Protokoll bietet mehrere Methoden zur Analyse und Quantifizierung des räuberischen Fressverhaltens bei Nematoden. Viele Nematodenarten, einschließlich Pristionchus pacificus, zeigen komplexe Verhaltensweisen, von denen das auffälligste die Prädation anderer Nematodenlarven ist. Da diese Verhaltensweisen im Modellorganismus Caenorhabditis elegans jedoch nicht vorkommen, wurden sie zusammen mit der Entwicklung zuverlässiger Verhaltensassays bisher erst in jüngster Zeit detailliert beschrieben 1. Diese räuberischen Verhaltensweisen sind abhängig von phänotypisch plastischen, aber festen Maulmorphen, was die korrekte Identifizierung und Kategorisierung dieser Tiere unerlässlich macht. Bei P. pacificus gibt es zwei Mundtypen, die stenostomatöse und die eurystomatöse Morphe 2, wobei nur der breitmaulige Eurystomatus einen zusätzlichen Zahn enthält und in der Lage ist, andere Nematodenlarven zu töten. Durch die Isolierung einer Fülle von größenangepassten Beutelarven und die anschließende Exposition gegenüber räuberischen Nematoden sind Assays möglich, die sowohl "Leichen-Assays" als auch "Biss-Assays" an korrekt identifizierten Mundmorph-Nematoden umfassen. Diese Assays bieten ein Mittel zur schnellen Quantifizierung der Erfolgsraten von Raubtieren und bieten eine detaillierte Verhaltensanalyse einzelner Nematoden, die an räuberischen Fressaktivitäten beteiligt sind. Darüber hinaus ist mit dem Einsatz einer Hochgeschwindigkeitskamera auch die Visualisierung von Veränderungen der Rachenaktivität einschließlich der Zahn- und Pumpdynamik möglich.

<html> Nach erfolgreicher Identifizierung des entsprechenden Mund Morph in P. pacificus, deutliche Unterschiede zwischen eurystomatous und stenostomatous Tiere können (Abbildung 3) nur mit den eurystomatous Tiere zu töten Eingriff Verhalten nachgewiesen werden. In stenostomatous Tiere scheint dieses Verhalten völlig unterdrückt werden. Ferner können Unterschiede in der Zahn Aktivität und Rachen Pumpen von eurystomatous Tiere auf Bakterien und Beute (Abbildung 4 und Filme 2 und 3) sind ebenfalls evident. Während Verdrängungs Fütterung wird die Pumprate unter dass während bakterieller Zuführ- und Zahnbewegung in einer 12.59-Verhältnis mit der pharyngealen Pump detektiert beobachtet reduziert. Dies ist möglicherweise bezeichnend für wichtige regulatorische Mechanismen, um die Verhaltensreaktion auf unterschiedliche Ernährung zu modulieren. s / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. P. pacificus hat einen Mund Dimorphismus , die Verhalten beeinflusst Fütterung. (A) Die eurystomatous Mund Form ist in der Lage predation und verfügt über eine breite Mundöffnung mit einer großen Kralle förmigen Dorsalzahn (false farbig rot) und (B) einen großen , einander gegenüberliegenden hakenförmigen Unter ventralen Zahn (falsch-blau gefärbt). (C) Das stenostomatous Mund Form nur in der Lage ist , auf Bakterien zu ernähren und eine schmalere Mundöffnung mit einem Feuerstein förmigen Dorsalzahn (false farbig rot) und (D) kein Unter ventralen Zahn (*). Normaski Bilder sind 63X und Maßstabsbalken entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <strOng&gt; Abbildung 2. Predation Assays. (A) P. pacificus beißt und tötet die Larven anderer Nematoden, wie C. elegans. (B) für das Beißen Assays, die Zahl der bitesby Räuber (*) kann mit einem Licht - Stereomikroskop und erfolgreiche Tötung und Fütterung Ereignisse aufgezeichnet ebenfalls zu beachten. Corpses sind auch deutlich sichtbar (Kreise). (C) Für Leiche Assays Larven Kadaver (Pfeile) leicht zu lebenden Larven im Vergleich identifiziert werden. Maßstabsbalken entspricht 1 mm in B und 150 &amp; mgr; m in C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Ergebnisse der Biss und Corpse Assays auf C. elegans Prey. (A) Beißverhalten ist nur offensichtlich ,<html> im eurystomatous Mund Form mit diesem Verhalten nicht in stenostomatous Tiere angezeigt. Fehlerbalken eine Standardabweichung von 10 Wiederholungen. (B) Zeitgleich ohne Beißverhalten sich aus stenostomatous Tiere, Leiche Assays zeigen auch Kadaver nur auf Testplatten von eurystomatous Tiere. Fehlerbalken stellt Standardabweichung von 5 Replikaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> Abbildung 4. Eurystomatous Pumprate und Zahnbewegung während Räuberische Fütterung. Zahnbewegung wird nur beobachtet , während eurystomatous Tiere in räuberische Fütterung beschäftigt sind. Dies deckt sich auch mit einer Verringerung der pharyngealen Pumpen. Fehlerbalken eine Standardabweichung von 10 Wiederholungen.<html> href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">Film 1. Beobachtung des Tötens Verhalten für Biss Assay a Light Stereo verwenden. (Rechts Download anklicken).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">Film 2. High-Speed</a> ​​- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">Kamera Film von P. pacificus Tötung C. elegans Larvae. (Rechtsklick zum Download).</a> ad / 54404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">Film 3. Vergrößerte in Hochgeschwindigkeitskamera der Zahnbewegung Während Predation. (Rechts Download anklicken).</a>

Verhaltensassays bieten leistungsstarke Werkzeuge zum Verständnis der neuronalen Funktion. Hier stellen wir mehrere Protokolle zur Quantifizierung des räuberischen Fressverhaltens vor, die beim Modellnematoden Pristionchus pacificus und seinen Verwandten gefunden wurden. Darüber hinaus stellen wir Methoden zur Analyse von räuberischen Fressanpassungen einschließlich Mundstrukturen und Zähnen zur Verfügung.

Die Untersuchung Räuberische Fütterung Behaviors in<em&gt; Pristionchus</em&gt; Und andere Nematoden

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, komplexe Fressverhalten bei räuberischen Nematoden mithilfe mehrerer neuartiger Tests zuverlässig zu analysieren. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Verhaltensneurobiologie zu beantworten, beispielsweise die Regulation neuartiger komplexer Verhaltensweisen sowie deren Evolution. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie schnelle und leicht wiederholbare Methoden bereitstellen, um räuberische Fressverhalten bei Nematoden zu beobachten und zu quantifizieren, einschließlich des satellitenartigen Modellorganismus Pristionchus pacificus.Um die Mundmorphismen der Nematoden sichtbar zu machen, immobilisieren Sie die Würmer zunächst mit einer leichten Anästhesiebehandlung auf einem frisch hergestellten 2 % Agarose-Polster. Um einen Polster herzustellen, geben Sie vorsichtig 10 Mikroliter einer 10 %igen Natriumazid-Lösung zu drei Milliliter geschmolzener Agarose hinzu und mischen gründlich. Natriumazid ist reaktiv und toxisch, daher sind angemessene Vorsichtsmaßnahmen erforderlich.Danach mindestens 300 Mikroliter der Mischung in die Mitte eines standardmäßigen Glasobjektträgers geben und einen weiteren Objektträger verwenden, um das Agarose auszuwerten. Den oberen Objektträger an Ort und Stelle belassen, bis das Polster verwendet wird. Zum Vorbereiten des Pads den oberen Objektträger entfernen und einen Tropfen M9 hinzufügen. Anschließend zwei oder drei Würmer entnehmen, in den Tropfen legen und vorsichtig ein Deckglas aufsetzen.Beobachten Sie die Würmer mit 63x-Nomarski-Optik, um ihre morphologischen Identitäten zu kategorisieren. Ein vergrößerter dorsaler Zahn, ein zusätzlicher subventraler Zahn oder eine vergrößerte, breite Mundöffnung sind Merkmale eines eurystomatösen Tieres. Hingegen weist ein einzelner dorsaler Zahn und eine schmalere Mundöffnung auf ein stenostomatöses Tier hin.Entfernen Sie die Nematoden innerhalb von fünf Minuten vom Betäubungspad. Schieben Sie vorsichtig die Deckglasabdeckung beiseite und überführen Sie sie auf eine frische MGM-Platte. Warten Sie, bis sie bewegliches Verhalten zeigen, bevor Sie weitere Analysen durchführen.Bei mehr Erfahrung kann der Morph ohne Anästhesiebehandlung analysiert werden. Übertragen Sie 10 bis 20 Nematoden von einer Standardkulturplatte auf eine frische Platte, die mit einem bakteriellen Rasen aus OP50 beimpft ist, um die Mundform-Phänotypisierung mithilfe eines Stereomikroskops mit hoher Vergrößerung schnell durchzuführen. Anschließend werden Unterschiede in der Mundgröße und -breite ermittelt.Bei dieser Vergrößerung sind keine zahnähnlichen Strukturen erkennbar, daher die Mundformen anhand ihrer Breite identifizieren. So unterscheiden sich breite Münder von schmalen Mündern. Die Testplatten herstellen, indem man eine große Menge ausgewählter Räuber-Nematoden-Larven, wie zum Beispiel Larvenstadium C.elegans oder eine ökologisch relevante Beute, kultiviert.Verhungern Sie vier oder mehr Platten der Beuteart, um die L1-Larven zu sammeln. Spülen Sie die Platten anschließend mit M9 ab und lassen Sie die Sammlung durch zwei 20-Mikron-Filter laufen. Nur die kleinen Larven sollten in der Lösung verbleiben.Zentrifugieren Sie die Larven bei 377 g für eine Minute. Entfernen Sie das M9-Überstand in einen Abfallbecher und entnehmen Sie ein drei Mikroliter großes Aliquot des reinen Wurmpellets. Geben Sie die Würmer in die Mitte einer sechs Zentimeter großen MGM-Platte ohne E. coli und lassen Sie sie sich etwa eine halbe Stunde lang ausbreiten.Verwenden Sie später die Larven für den Biss-Test. Überführen Sie die Räuber mit so wenig wie möglich der OP50-Bakterien auf die Testplatte. Für P.pacificus fügen Sie fünf Räuber zur Platte hinzu.Warten Sie 15 Minuten, um den übertragenen Tieren Zeit zur Erholung von der Belastung zu geben. Nach 15 Minuten sollten sich die Würmer normal bewegen; andernfalls könnten sie beschädigt worden sein. Beobachten und dokumentieren Sie nun 10 Minuten lang charakteristische Ereignisse, die von einem der Räuber verursacht werden.Das Beißen zeichnet sich dadurch aus, dass der Räuber die Bewegung der Beute einschränkt. Der Tod der Beute tritt ein, wenn das Exoskelett der Beute geöffnet wird. Das Fressen zeichnet sich durch eine sichtbare Aufnahme des Beuteinneren aus.Beobachten Sie mindestens 10 einzelne räuberische Nematoden, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Das Pharynxsaugen und die Zahnbewegung können unter Nomarski-Optik bei 40- bis 63-facher Vergrößerung beobachtet und mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bei 50 Hertz aufgezeichnet werden. Nach der Aufnahme von 15-Sekunden-Videos von mindestens 20 Tieren können die Aufnahmen zuverlässig analysiert werden.Das Pumpen ist im Corpus sichtbar, der sich in der Mitte der Pharynx befindet. Zahnbewegungen sind in der Mundöffnung nachweisbar und nur am dorsalen Zahn zu beobachten. Nach zwei Stunden der Prädati on das Objektträgerpräparat auf leere Kadaver untersuchen.Identifizieren Sie die Kadaver anhand ihres Bewegungsmangels und offensichtlicher morphologischer Defekte, einschließlich austretender Innereien oder fehlender Wurmfetzen. Nach erfolgreicher Identifizierung der entsprechenden Mundmorphe bei P.pacificus wurden deutliche Unterschiede zwischen eurystomaten und stenostomaten Tieren beobachtet. Nur eurystomate Tiere zeigten tödliches Verhalten.Außerdem sind die Unterschiede in der Zahnaktivität und im pharyngealen Pumpen eurystomater Tiere auf Bakterien und Beute deutlich erkennbar. Während der räuberischen Nahrungsaufnahme ist die Pumpfrequenz niedriger als während der bakteriellen Nahrungsaufnahme, und die Zahnbewegung erfolgt synchron mit dem pharyngealen Pumpen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese verschiedenen Assays kombinieren kann, um komplexe räuberische Fressverhalten bei Nematoden – einschließlich beim Satelliten-Modellorganismus Pristionchus pacificus – zu charakterisieren.

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Forschung

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Umwelt

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Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.

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Ein hochgradig skalierbarer Ansatz zur Durchführung ökologischer Untersuchungen von selbstsüchtigen Caenorhabditis-Nematoden

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Hier wird über ein System zur Untersuchung des kollektiven Verhaltens von Nematoden berichtet, indem sie in großen Mengen mit Hundefutter-Agar-Medium kultiviert werden. Dieses System ermöglicht es Forschern, eine große Anzahl von Dauerwürmern zu vermehren und kann auf Caenorhabditis elegans und andere verwandte Arten angewendet werden.

Die großflächige Kultivierung von Nematoden, um ihr kollektives Verhalten zu untersuchen

In dieser Studie wurden die biologischen Aktivitäten von Tithonia diversifolia-Extrakten unter Verwendung radikalbasierter Methoden und eines in vitro Egg Hatching Assay (EHA) untersucht, um ihre Auswirkungen auf gastrointestinale Nematoden bei kleinen Wiederkäuern zu bewerten. Die Methodik und die wichtigsten Ergebnisse werden beschrieben und das Potenzial dieser Extrakte zur Bekämpfung von Parasiten hervorgehoben.

Bewertung der antioxidativen und anthelmintischen Eigenschaften von Tithonia diversifolia-Extrakten gegen gastrointestinale Nematodeneier mittels In-vitro-Assays

Erfahren Sie Methoden zur Analyse räuberischer Fütterungsverhaltensweisen bei Nematoden mit Fokus auf Pristionchus pacificus. Diese Techniken ermöglichen die Quantifizierung von Fütterungsanpassungen und die Visualisierung von Mundstrukturen für die Verhaltensneurobiologie.

Die Untersuchung Räuberische Fütterung Behaviors in

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