Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Wachstumsfaktor-Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen zu detektieren, indem die Selektivität und Sensitivität der Affinitätsmarkierung des ausgewählten Rezeptors durch seinen radioaktiven Liganden kombiniert wird. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Expression von Rezeptoren und ihre biochemischen Eigenschaften. Diese Methode, die wir AFLIP genannt haben, erweitert die leistungsstarken beschreibenden Qualitäten der Affinitätsmarkierung, einer etablierten zellbiologischen Technik, auf Entwicklungsstudien von Zebrafischen.

Um diese Prozedur zu beginnen, entnehmen Sie 100 bis 200 Embryonen für jede Erkrankung und legen Sie sie in Petrischalen mit Fischwasser. Dechorionieren Sie dann die Embryonen manuell mit einer Pinzette mit feiner Spitze und vermeiden Sie die Verwendung von Pronase oder anderen Protease während des gesamten Protokolls, da diese die Zielrezeptoren verdauen kann. Legen Sie anschließend die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und waschen Sie sie zweimal mit 1X PBS.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter Dotterpuffer hinzu. Geben Sie den größten Teil des Eigelbs ab, indem Sie die Embryonen in der Lösung etwa 30 bis 40 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Für 72 HPF- und 48 HPF-Embryonen verwenden Sie blaue bzw. gelbe Pipettenspitzen.

Gelbe Spitzen müssen möglicherweise leicht abgeschnitten werden, um eine Zerstörung der Embryonen zu vermeiden. Eine erfolgreiche Dotterfreisetzung kann durch die Beobachtung der Embryonen unter dem Mikroskop überprüft werden. Die Entfernung von Eigelb muss so vollständig wie möglich sein, da Dotterlipide und -proteine nachfolgende Liganden- oder Antikörperbindungsschritte beeinträchtigen können.

Danach werden die Embryonen durch Zentrifugation bei 600 x g für 15 Sekunden gesammelt. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Waschen Sie die Embryonen anschließend zweimal mit 500 Mikrolitern Waschpuffer, indem Sie sie bei niedrigster Geschwindigkeit vorsichtig vortexen.

Sammeln Sie dann die Embryonen durch Zentrifugation bei 600 x g für 15 Sekunden. Von hier aus setzen Sie die Prozedur bei vier Grad Celsius fort. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.

Anschließend suspendieren wir die Embryonen in 350 Mikrolitern Lysepuffer und homogenisieren sie mit einem Kunststoffstößel. Dann inkubieren Sie die lysierten Embryonen 30 Minuten lang unter Rühren auf einer Reagenzglaswippe bei vier Grad Celsius. Als nächstes zentrifugieren Sie die lysierten Embryonen bei 11.000 x g für 15 Minuten, um die unlöslichen Rückstände zu entfernen.

Übertragen Sie anschließend den gereinigten Überstand in ein frisches Röhrchen. Bestimmen Sie das Gesamtprotein mit dem Bradford-Protein-Assay und der plotty-Kalibrierungskurve. In diesem Schritt geben Sie 400 bis 500 Mikrogramm des gesamten Embryoproteins in ein 1,5-Milliliter-Mikrofluorröhrchen und verdünnen es mit Puffer 1 auf ein Mikrogramm pro Mikroliter.

Als nächstes wird Jod-125-Etikett TGF-beta II-Stamm hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 150 Picomolare zu erreichen, und unter Rühren auf einer Reagenzglaswippe zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Danach fügen Sie unverdünnten Antikörper gegen den gewünschten Rezeptor hinzu, um eine Verdünnung von 1:100 zu erreichen. Dann setzen Sie die Inkubation bei vier Grad Celsius für weitere zwei Stunden oder über Nacht fort.

Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter geeigneter Immunglobulin-Bindekügelchen zugegeben und 50 Minuten lang unter Rühren auf einer Reagenzglaswippe bei vier Grad Celsius inkubiert. Anschließend werden die Kügelchen durch Mikrozentrifugation bei 11.000 x g für 20 Sekunden zurückgewonnen und der Überstand in einem geeigneten radioaktiven Müllbehälter entsorgt. Anschließend werden die IP-Kügelchen dreimal mit einem Milliliter IP-Waschpuffer gewaschen, indem sie bei Mikrozentrifugation bei 11.000 x g jeweils 20 Sekunden lang vortexen.

Anschließend werden die IP-Kügelchen in 250 Mikrolitern IP-Waschpuffer resuspendiert. Bereiten Sie frische DSS-Lösung vor und geben Sie 1,5 Mikroliter davon in die Probe. Anschließend wird die Probe 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubiert.

Um die Vernetzungsreaktion zu löschen, fügen Sie 500 Mikroliter IP-Waschpuffer hinzu, der mit genügend Trystchlorid bei einem pH-Wert von 7,4 ergänzt wird, um 25 millimolares Trystchlorid zu erreichen. Zentrifugieren Sie anschließend 20 Sekunden lang bei 11.00 x g, um IP-Kügelchen zu sammeln. Anschließend wird der Überstand verworfen und die IP-Kügelchen in 30 Mikrolitern reduzierendem Laemmli-Puffer resuspendiert.

Anschließend wird die Probe vor der SDS-PAGE-Gelelektrophorese fünf Minuten lang bei 94 Grad Celsius gekocht und anschließend die getrockneten Gele in einem Phosphorimeter oder durch konventionelle Autoradiographie analysiert. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Ergebnisse, die mit AFLIP erzielt wurden. Das Gesamtprotein, das aus den Embryonen bei 72 hpf und 48 hpf extrahiert wurde, wurde einer Jod-125 TGF-beta II-Affinitätsmarkierung unterzogen, gefolgt von IP mit Kaninchen Anti-Zebrafisch BG oder Kaninchen Anti-Ratte BG als Kontrolle.

In der Autoradiographie kann BG ohne GAG oder als Glykosaminoglykan-modifiziertes BG nachgewiesen werden. Diese Abbildung zeigt, wie AFLIP verwendet werden kann, um die Expressionsniveaus eines bestimmten Rezeptors in Embryonen zu messen, die einer experimentellen Manipulation unterzogen wurden, in diesem Fall der Abnahme von Betaglykan durch die Morpholino-Injektion. Spur eins zeigt den Spiegel des TGF-beta-Rezeptors III in einem 72-hpf-Wildtyp-Embryo, während Spur zwei die Wirkung der Verabreichung von sieben Nanogramm eines Morpholinos zeigt, das auf die Exon-2-Intron-2-Grenze des primären ZFPG-Transkripts gerichtet ist. Es ist zu beachten, dass die mit diesem Morpholino erzielte BG-Herunterregulierung durch seine nicht übereinstimmende Steuerung nicht reproduziert wird.

Diese Ergebnisse bestätigten, dass der mit diesem Morpholino erhaltene Phänotyp spezifisch für den Knockdown des TGF-beta-Rezeptors III war, wie zuvor beschrieben. Der Erfolg von AFLIP beim Nachweis eines Wachstumsfaktors oder von Zytokinrezeptoren hängt von der Verfügbarkeit eines radioaktiv markierten Liganden ab, der an seinen Rezeptor gebunden und vernetzt werden kann. Ein guter Antikörper für die Immunpräzipitation ist ebenfalls erforderlich.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Da AFLIP den Transferschritt des Western Blots vermeidet, ermöglicht es eine verbesserte Detektion von stark glykosylierten Rezeptoren. Und wir haben hier für das Proteoglykan Betaglykan gesehen, das sehr ineffizient in Western Blot überträgt. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie der enzymatische Verdau durchgeführt werden, um zusätzliche posttranslationale Modifikationen zu beschreiben, sofern diese durch elektrophoretische Techniken aufgedeckt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie AFLIP Ihnen helfen kann, niedrig häufige Rezeptoren in mehreren Fischembryonen durch Affinitätsmarkierung in Verbindung mit Immunpräzipitation zu erkennen. Vergessen Sie schließlich nicht, dass die Arbeit mit Jod-125 mit Vorsicht und angemessenem Schutz erfolgen muss. Viel Glück bei Ihren Experimenten.