Name: Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie die AFLIP-Methode zur Detektion niedrig abundanter Wachstumsfaktorrezeptoren in Zebrafischembryonen. Diese Technik kombiniert Affinitätsmarkierung mit Immunpräzipitation für die Entwicklungsbiologie.

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Die Autoren danken Gilberto Morales für die Pflege und Wartung der Fische und Dr. Claudia Rivera und Dr. Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) für ihre Hilfe bei der Immunisierung von Kaninchen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von CONACYT 131226 und PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916 unterstützt.

Alle Versuche an Tieren durchgeführt wurden vom Ausschuss für Laboratory Animal Care und Verwenden der Autonomen Nationalen Universität von Mexiko (UNAM) genehmigt, unter dem CICUAL-Protokollnummer: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México&quot;). 1. Herstellung von Embryo Protein Extract <ol><li> Sammeln Sie 100 bis 200 Embryonen für jede Bedingung zu vergleichen (morphants vs. Wildtyp) in der gewünschten Stufe, zum Beispiel 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF). </li><li> Platz Embryonen in Petrischalen mit Fischwasser (siehe Tabelle 1) und manuell dechorionate Embryonen mit feinen bestückte Zange. Während dieses Schritts zu vermeiden (oder einer anderen Protease gesamten Protokoll) unter Verwendung von Pronase, da es die gezielte Rezeptor verdauen kann. </li><li> Ort Embryonen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und wasche Embryonen twEis mit 1x Phosphatpufferlösung (PBS) (siehe Tabelle 1). </li><li> In 500 ul deyolk Puffer (siehe Tabelle 1). </li><li> Lassen Sie die meisten Eigelb durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten (ca. 30 - 40-mal) die Embryonen in der Lösung. Für 72 HPF und 48 HPF Embryonen verwenden, blaue und gelbe Pipettenspitzen sind. Gelb Spitzen müssen leicht geschnitten werden kann, Zerstörung von Embryonen zu vermeiden. Die erfolgreiche Dotter Freisetzung kann durch die Beobachtung Embryonen unter dem Mikroskop geprüft werden. </li><li> Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec. </li><li> Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette. </li><li> Wash Embryonen zweimal mit 500 &amp; mgr; l Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch bei niedrigster Geschwindigkeit sanft verwirbelt. </li><li> Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec. </li><li> Ab hier geht das Verfahren bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette. </li><li> Resuspendieren Embryonen in 350 &amp; mgr; l Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und homogenisieren einen Plastik zerstoßen. </li><li> Inkubieren lysiert Embryonen 30 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge lysiert Embryonen bei 11.000 xg für 15 min, um unlösliche Rückstände zu entfernen. </li><li> Transfer geklärte Überstand einer Pipette in ein frisches Röhrchen verwenden. </li><li> Bestimmung der Gesamtprotein durch Bradford-Test 4 oder ein anderes geeignetes Verfahren. Wenn Bradford - Test verwendet wird, führen Sie die Kalibrierungskurve in Gegenwart von äquivalenten Konzentrationen der Waschmittel präsentiert im Lysepuffer, da sie eine Unterschätzung des Proteins Standard - 4 führen. </li></ol> 2. Nachweis von endogenen Rezeptor Protein <ol><li> Affinitätsmarkierung und Immunpräzipitation (alle diese Schritte wurden bei 4 ° C) <ol><li> Platzieren 400-500 ug Gesamt - Embryo - Protein in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mit Wasser auf 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l mit Puffer 1 (siehe Tabelle 1). Hinweis: Um 500 ug Gesamt-Embryo-Protein zu erhalten, etwa 100 bis 200 Embryonen müssen zunächst verarbeitet werden. 72 HPF Embryonen routinemäßig ergeben ~ 5 ug Gesamt-Embryo-Protein, das für Betaglycan Nachweis ausreichend ist. </li><li> Hinzufügen genügend Volumen an markiertem TGF-β2 Lager um eine Endkonzentration von 150 pM zu erreichen und inkubiere unter Schütteln auf einem Reagenzglas Wippe 2 h bei 4 ° C. TGF-β2 müssen gekennzeichnet werden , bevor AFLIP gestartet wird, mit 125 I nach dem Verfahren Chloramin T , wie durch Cheifetz et al. 5. ACHTUNG: Verwenden Sie Abschirmung Exposition zu minimieren , während 125 Umgang mit der Bezeichnung I - Liganden. </li><li> Hinzufügen genügend Volumen an unverdünntem Antikörper gegen den Rezeptor von Interesse, um eine 1 zu erreichen: 100 Verdünnung und weiter Inkubation für weitere 2 h bei 4 ° C (Inkubation kann O / N sein). Dies ist die optimale Verdünnung des Antiserums # 31, die in dieser Studie verwendet und anderswo 3 beschrieben, jedoch in Abhängigkeit von der Qualität der eintibody, eine größere oder kleinere Verdünnung kann die optimal sein. </li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l geeignete Immunglobulin-Bindungsperlen (zB G-Protein-Sepharose, die zuvor in TNTE äquilibriert wurde und resuspendiert 1: 5 des ursprünglichen Volumens in TNTE) und Inkubation für 50 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C. </li><li> Gewinnen Sie die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 11.000 × g für 20 Sekunden. </li><li> Überstand verwerfen in einem geeigneten radioaktiven Abfallbehälter. </li><li> Waschen Sie die IP-Perlen dreimal mit 1 ml IP - Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch Vortexen und Mikrozentrifugation bei 11.000 xg für 20 sec jedes Mal. </li><li> Resuspendieren IP-Perlen in 250 ul IP Waschpuffer. </li><li> Fügen 1,5 ul Disuccinimidylsuberat (DSS, gelöst in DMSO bei 10 mg / ml). Bereiten Sie die DSS-Lösung kurz vor der Verwendung in diesem Schritt. </li><li> Inkubieren für 15 min bei 4 ° C unter Rühren. </li><li> Um die Vernetzungsreaktion zu löschen, 500 &amp; mgr; l of IP Waschpuffer, ergänzt mit genügend Tris-Cl pH 7,4 Lager 25 mM Tris-Cl zu erreichen. Die freien Aminogruppen in Tris erfassen nicht umgesetzten DSS. </li><li> Zentrifuge bei 11.000 g für 20 sec IP-Perlen zu sammeln und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren IP-Perlen in 30 ul Puffer Laemmli reduzieren. </li><li> Boil Proben 5 min bei 94 ° C. </li><li> Optional analysieren Proben in einem Gamma-Zähler des Protokolls Hersteller. </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Gegenstand Proben einer SDS-PAGE denaturieren. Verwenden Sie Polyacrylamid auf der entsprechenden Prozentsatz für die Masse des Rezeptors und führen Gel unter Standardverfahren. </li><li> Tauchen Gel in Fixierlösung (siehe Tabelle 1) für 30 min bei RT. </li><li> Waschen Sie Gel mit destilliertem Wasser 15 min. </li><li> Setzen Sie Gel in vorher hydratisiert Filterpapier und Deckel mit Saran Wrap Folie. </li><li> Trockenen Gels bei 80 ° C für 1 Stunde. </li><li> Expose Gel auf einem weißen Phosporimager screen bei RT O / N. </li><li> Scan ausgesetzt Bildschirm mit einem Phosporimager mit Protokoll des Herstellers. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
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<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
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<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Verwendung von Western - Blots mit einem spezifischen Antikörper gegen ein Protein von Interesse ist ein wertvolles Instrument zum Ausdruck 7 während der Embryonalentwicklung zu studieren. Jedoch Immunoblotting hoch glycosylierten Proteinen war nicht sehr erfolgreich gewesen aufgrund ihrer ineffizienten Übertragung und eine schwache Bindung an Nitrocellulose oder PVDF Membranen 8,9. Proteoglykane sind ein gutes Beispiel für dieses Manko, die aufgrund ihrer kovalent ...

Der spezifische Nachweis von Proteinen, die während der Embryonalentwicklung exprimiert werden, ist erforderlich, um Expressionsprofile zu validieren, die durch Messung ihrer verwandten mRNAs mit RT-PCR oder in situ Hybridisierung (ISH) erhalten wurden. Dies wird in der Regel durch einen Western Blot von Embryonenextrakten erreicht, gefolgt von einem Nachweis mit spezifischen Antikörpern. Dieser Ansatz lässt sich jedoch nur schwer auf Proteine anwenden, die in sehr geringer Menge vorkommen oder die Eigenschaften aufweisen, die ihren quantitativen Transfer während ihres Blottings behindern. Betaglykan, auch bekannt als Typ III transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)-Rezeptor (TGFBR3), ist ein Beispiel für diese Schwierigkeiten. TGFBR3 ist ein Teilzeit-Membranproteoglykan, das TGF-β über sein Kernprotein1 bindet, mit einer deutlich höheren Affinität für die Isoform TGF-β2, eine Eigenschaft, die es von allen anderen TGF-β-bindenden Proteinen2 unterscheidet. TGFBR3 wird im Zebrafisch ab 8 hpf exprimiert und erreicht ein Maximum von 72 hpf, wie durch RT-PCR seiner mRNA3 nachgewiesen wird. 
Trotz der Verfügbarkeit eines sehr spezifischen Antikörpers3 erwies sich jeder Versuch, sein translatiertes Produkt mittels Western Blot nachzuweisen, als erfolglos. Unter der Annahme, dass die Proteoglykan-Natur von TGFBR3 sowie die mutmaßlich geringe Abundanz für dieses Versagen verantwortlich sein könnten, wurde eine Nachweismethode, AFLIP, entwickelt, die sich die hohe Affinität von TGFBR3 zu TGF-β2 zunutze macht. Bei dieser Methode wird einem Proteinextrakt aus gepoolten Embryonen erlaubt, spezifisch an 125I-markiertes TGF-β2 zu binden, und die Rezeptor-Liganden-Komplexe werden durch Immunpräzipitation gereinigt und vor der Trennung durch SDS-PAGE vernetzt. Die durch die Autoradiographie der Gele beobachteten Migrationsmuster zeigten das Vorhandensein und die Art der markierten Rezeptorspezies. Dieser Ansatz kombiniert die Ligandenspezifität der Affinitätsmarkierung mit der Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper, wodurch der Nachweisbereich erhöht und das ineffiziente Transfer-Blotting von TGFBR3 vermieden wird. Aufgrund seiner inhärenten Eigenschaften handelt es sich beim AFLIP Assay nicht um einen quantitativen Assay, sondern es kann verwendet werden, um relative experimentelle Unterschiede im analysierten Rezeptor sicher zu messen.

<table><tbody><tr><td>Disuccinimidylsuberat (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Geltrockner Modell 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto Gamma Counter</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

affinitatsmarkierung nachweis endogener receptors von zebrafischembryonen

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Durch die Kombination der Kräfte von Affinity Labeling und ImmunopRecipitation (AFLIP) wurde eine Technik zum Nachweis von Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen implementiert. Diese Technik nutzt die Selektivität und Sensitivität, die durch die Affinitätsmarkierung eines gegebenen Rezeptors durch seinen Liganden mit der Spezifität der Immunpräzipitation verliehen wird. Wir haben AFLIP verwendet, um den Typ-III-TGF-β-Rezeptor (TGFBR3), auch bekannt als Betaglykan, während der frühen Entwicklung des Zebrafisches nachzuweisen. AFLIP war maßgeblich an der Validierung der Wirksamkeit eines TGFBR3-Morphanten-Zebrafisch-Phänotyps beteiligt. Im ersten Schritt werden embryonale Proteinextrakte hergestellt und zur Herstellung von 125I-TGF-β2-TGFBR3-Komplexen verwendet, die durch Immunpräzipitation aufgereinigt werden. Später werden diese Komplexe kovalent vernetzt und mittels SDS-PAGE-Trennung und Autoradiographie-Detektion freigelegt. Diese Technik erfordert die Verfügbarkeit eines markierten Liganden für den zu detektierenden Rezeptor und eines spezifischen Antikörpers gegen ihn und muss leicht angepasst werden können, um jeden Wachstumsfaktor oder Zytokinrezeptor zu identifizieren, der diese Anforderungen erfüllt.

Figur 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit AFLIP erhalten. Die Signale in Spur 1 kommen aus dem 125 I-Ligand kovalent an entweder der Zebrabärbling Betaglycan Core - Protein (BG Kern unterhalb der 150 kDa - Marker) verknüpft oder dem BG Kern, der zu seiner Proteoglykan Form verarbeitet wurde , durch Anbringung von Glykosaminoglykanen (GAG, Abstrich im Bereich von 170 kDa an die Spitze des Gels). Dieses Muster der Migration, ein scharfer Core - Protein plus...

Eine neuartige Technik zum Nachweis von endogenen Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen wird beschrieben. Wir haben es AFLIP genannt, weil es aus der Affinitätsmarkierung des Rezeptors durch seinen Liganden besteht, der mit der Immunpräzipitation verbunden ist.

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Wachstumsfaktor-Rezeptoren mit geringer Häufigkeit in Zebrafisch-Embryonen nachzuweisen, indem die Selektivität und Empfindlichkeit der Affinitätsmarkierung des gewählten Rezeptors durch seinen radioaktiven Liganden kombiniert wird. Diese Methode kann Fragen in der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise bezüglich der Expressionsebenen von Rezeptoren und deren biochemischer Eigenschaften. Diese Methode, die wir AFLIP getauft haben, erweitert die aussagekräftigen Eigenschaften der Affinitätsmarkierung – einer etablierten zellbiologischen Technik – auf Entwicklungsstudien am Zebrafisch.Um dieses Verfahren zu beginnen, sammeln Sie 100 bis 200 Embryonen für jede Bedingung und geben Sie diese in Petrischalen, die Fischwasser enthalten. Entfernen Sie dann manuell die Chorionhülle der Embryonen mit fein-spitzigen Pinzetten und vermeiden Sie den Einsatz von Pronase oder anderen Proteasen während des gesamten Protokolls, da diese die Zielrezeptoren verdauen könnten. Anschließend werden die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und zweimal mit 1X PBS gewaschen.Dann 500 Mikroliter Dejellying-Puffer hinzufügen. Den Großteil des Dotters freisetzen, indem die Embryonen vorsichtig etwa 30 bis 40 Mal auf und ab pipettiert werden. Für 72 HPF- und 48 HPF-Embryonen verwenden Sie jeweils blaue und gelbe Pipettenspitzen.Gelbe Spitzen müssen möglicherweise leicht abgeschnitten werden, um die Embryonen nicht zu beschädigen. Ein erfolgreicher Freisetzung des Dotters kann durch Beobachtung der Embryonen unter dem Mikroskop überprüft werden. Die Entfernung des Dotters muss so vollständig wie möglich erfolgen, da Dotter-Lipide und -Proteine nachfolgende Schritte der Liganden- oder Antikörperbindung stören können.Anschließend sammeln Sie die Embryonen durch Zentrifugation bei 600 x g für 15 Sekunden. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette. Waschen Sie die Embryonen danach zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern Waschpuffer, indem Sie sie sanft bei der niedrigsten Drehzahl verwirbeln.Sammeln Sie dann die Embryonen durch Zentrifugation bei 600 x g für 15 Sekunden. Führen Sie das Verfahren ab diesem Punkt bei vier Grad Celsius fort. Entsorgen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig mit einer Pipette.Anschließend suspendieren wir die Embryonen in 350 Mikrolitern Lysepuffer und homogenisieren sie mithilfe eines Plastikstößels. Danach inkubieren wir die lysierten Embryonen 30 Minuten lang unter Rütteln auf einem Reagenzglas-Schüttler bei vier Grad Celsius. Als Nächstes zentrifugieren wir die lysierten Embryonen bei 11.000 × g für 15 Minuten, um unlösliche Rückstände zu entfernen.Anschließend das klare Überstand auf ein frisches Gefäß übertragen. Die Gesamtproteinkonzentration mittels Bradford-Proteinbestimmung ermitteln und eine Kalibrierungskurve erstellen. In diesem Schritt 400 bis 500 Mikrogramm Gesamtembryoprotein in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit Puffer 1 auf eine Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter verdünnen.Fügen Sie anschließend die Iod-125-markierte TGF-beta-II-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Pikomolar zu erreichen, und inkubieren Sie unter Rütteln zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Reagenzglas-Schüttler. Danach geben Sie den unverdünnten Antikörper gegen den Rezeptor der Untersuchung hinzu, um eine 1:100-Verdünnung zu erreichen. Setzen Sie die Inkubation anschließend weitere zwei Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius fort.Nach der Inkubation 50 Mikroliter geeigneter immunoglobulinbindender Bäder hinzufügen und 50 Minuten unter Rühren auf einem Reagenzglas-Schüttler bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Bäder durch Mikrozentrifugation bei 11.000 × g für 20 Sekunden pelletieren und den Überstand in einem geeigneten Behälter für radioaktiven Abfall entsorgen. Danach die IP-Bäder dreimal mit je einem Milliliter IP-Waschpuffer durch Vortexen und Mikrozentrifugation bei 11.000 × g für jeweils 20 Sekunden waschen.Suspenderen Sie die IP-Perlen anschließend in 250 Mikroliter IP-Waschpuffer. Bereiten Sie eine frische DSS-Lösung vor und geben 1,5 Mikroliter davon zur Probe hinzu. Danach inkubieren Sie die Probe 15 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren.Um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, 500&nbsp;Mikroliter IP-Waschpuffer zugeben, der mit ausreichend Tris-Clorid-Standardlösung bei pH&nbsp;7,4 versetzt wurde, um eine Endkonzentration von 25&nbsp;Millimolar Tris-Clorid zu erreichen. Anschließend 20&nbsp;Sekunden bei 11.000&nbsp;×&nbsp;g zentrifugieren, um die IP-Perlen zu pelletieren. Danach den Überstand entfernen und die IP-Perlen in 30&nbsp;Mikroliter reduzierendem Laemmli-Puffer resuspendieren.Als Nächstes den Probenansatz bei 94 Grad Celsius fünf Minuten lang kochen, bevor er einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterzogen wird, anschließend die getrockneten Gele in einem Phosphorimager oder mittels konventioneller Autoradiographie analysieren. Diese Abbildung zeigt repräsentative Ergebnisse, die mit AFLIP erzielt wurden. Gesamtprotein, aus den Embryonen zu den Zeitpunkten 72 hpf und 48 hpf isoliert, wurde einer Affinitätsmarkierung mit Iod-125-markiertem TGF-beta II unterzogen, gefolgt von einer Immunpräzipitation mit Kaninchen-Anti-Zebrafisch-BG oder als Kontrolle mit Kaninchen-Anti-Ratte-BG.Bei der Autoradiographie kann BG ohne GAG oder als Glykosaminoglykan-modifiziertes BG nachgewiesen werden. Diese Abbildung zeigt, wie AFLIP verwendet werden kann, um die Expressionsniveaus eines bestimmten Rezeptors in Embryonen zu bestimmen, die einer experimentellen Manipulation unterzogen wurden – in diesem Fall der Verringerung von Betaglycan durch Injektion eines Morpholinos. Spur eins zeigt das Niveau des TGF-beta-Rezeptors III in einem 72 hpf Wildtyp-Embryo, während Spur zwei die Wirkung der Verabreichung von sieben Nanogramm eines Morpholinos zeigt, das auf die Grenze zwischen Exon 2 und Intron 2 des ZFPG-Primärtranskripts gerichtet ist. Beachten Sie, dass die durch dieses Morpholino erzielte Herunterregulierung von BG durch das mismatchte Kontrollmolekül nicht reproduziert wird.Diese Ergebnisse bestätigten, dass das mit diesem Morpholino erhaltene Phänotyp spezifisch für die Herunterregulation des TGF-beta-Rezeptor-III war, wie zuvor beschrieben. Der Erfolg von AFLIP beim Nachweis von Wachstumsfaktor- oder Zytokinrezeptoren hängt von der Verfügbarkeit eines radioaktiv markierten Liganden ab, der an seinen Rezeptor binden und verknüpft werden kann. Ebenso wird ein geeigneter Antikörper für die Immunpräzipitation benötigt.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Da AFLIP den Übertragungsschritt des Western Blots vermeidet, ermöglicht es eine verbesserte Detektion stark glykosylierter Rezeptoren. Wie hier am Proteoglykan Betaglycan gezeigt, übertragen sich solche Proteine sehr ineffizient im Western Blot. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie enzymatische Verdauungen durchgeführt werden, um zusätzliche posttranslationale Modifikationen zu charakterisieren, sofern diese mittels elektrophoretischer Techniken nachweisbar sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie AFLIP Ihnen helfen kann, schwach vorhandene Rezeptoren in mehreren Fischembryonen durch Affinitätsmarkierung in Verbindung mit Immunpräzipitation nachzuweisen. Vergessen Sie schließlich nicht, dass das Arbeiten mit Iod-125 mit Vorsicht und ausreichendem Schutz erfolgen muss. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Dieses Video zeigt einen Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung der Notch/DeltaD-Signalgebung in radialen Glia-Vorläufern von Zebrafischen. Dazu gehören die Montage von in Agarose eingebetteten dechorionierten Zebrafischembryonen, die Injektion einer Farbstofflösung, die auf DeltaD-Liganden abzielt, auf RGPs und die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop für die asymmetrische Zellteilung, die die Aktivierung des Notch/DeltaD-Signalwegs bestätigt.

Ein Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung des Notch/DeltaD-Signalwegs in radialen Glia-Vorläuferzellen von Zebrafischen

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

In dieser Arbeit wird ein Antikörper-Aufnahme-Assay für die Bildgebung des Intra-Lineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in sich teilenden radialen Gliavorläuferzellen des embryonalen Zebrafischgehirns entwickelt.

Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Erfahren Sie die AFLIP-Methode zur Detektion niedrig abundanter Wachstumsfaktorrezeptoren in Zebrafischembryonen. Diese Technik kombiniert Affinitätsmarkierung mit Immunpräzipitation für die Entwicklungsbiologie.

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

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