Herstellung von homogenen MALDI Proben für die quantitative Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser Probenvorbereitungsmethode aus MALDI MS ist es, die räumliche Heterogenität der Ionensignale während der MALDI MS zu reduzieren. Es wurde eine gut kontrollierte Trocknungsumgebung aufgebaut, um die herkömmliche Methode der getrockneten Tröpfchen zu optimieren, indem die hydrodynamischen Strömungen im Inneren des Probentröpfchens während des Trocknungsprozesses manipuliert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die räumliche Heterogenität der Ionensignale für die Probe, die mit der optimierten Trockentröpfchenmethode hergestellt wurde, effektiv reduziert werden kann. Diese Methode kann jedoch homogene Proben für das THAP Metric System liefern.

Es kann auch auf andere metrische Systeme angewendet werden, wie z. B. Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure. Im Allgemeinen hatten Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut waren, Schwierigkeiten, da es nicht einfach ist, den Trocknungszustand zu kontrollieren. Um diesen Vorgang zu starten, öffnen Sie die Tür einer Trockenkammer und legen Sie sofort eine zuvor gereinigte Probenplatte auf den Block auf Kupferbasis.

Schließen Sie dann die Tür. Stellen Sie den Gasdurchflussmesser manuell ein, um die Stickstoffdurchflussrate auf 10 Standardkubikfuß pro Stunde einzustellen. Stellen Sie anschließend den Gasdurchflussmesser so ein, dass die relative Luftfeuchtigkeit in der Trockenkammer immer unter 25 % liegt, gemessen mit einem Hygrometer.

Wenn Sie Thermoelemente vom Typ K verwenden, um die Temperatur zu überwachen, stellen Sie die Temperatur des Wasserzirkulators manuell ein, bis die Probenplatte für das Experiment 5 Grad Celsius erreicht. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Temperaturen und die relative Luftfeuchtigkeit erreicht sind, bevor die Probe abgelagert wird. Mischen Sie 0,25 Mikroliter 0,1 molare THAP-Lösung und 0,25 Mikroliter des gewünschten Analyten in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Wirbeln Sie die Probe drei Sekunden lang vor. Zentrifugieren Sie dann die Probe zwei Sekunden lang, um die Lösung am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Öffnen Sie nach der Zentrifugation die Tür der Trockenkammer und geben Sie vorsichtig 0,1 Mikroliter der Lösung mit einer Pipette auf die Probenplatte.

Schließen Sie die Tür sofort und warten Sie, bis der Probentropfen ausgetrocknet ist. Wenn die Temperatur der Probenplatte niedriger als die der Umgebung gehalten wird, wird die durchschnittliche Geschwindigkeit der Rezirkulationsströme innerhalb des Tröpfchens erheblich erhöht, um die Moleküle umzuverteilen. Die Probenabscheidung ist der wichtigste Schritt, der die Datenqualität und Reproduzierbarkeit bestimmt.

Die vorgemischte Probenlösung muss sofort auf der Probenplatte abgeschieden werden, um sicherzustellen, dass die Probe unter kontrollierten Bedingungen kristallisiert wird. Öffnen Sie nach dem Trocknen die Tür. der Trockenkammer.

Stellen Sie dann die Temperatur des Wasserumwälzthermostats auf 25 Grad Celsius ein. Sobald die Temperatur der Probenplatte wieder 25 Grad Celsius erreicht hat, nehmen Sie die Probenplatte aus der Trockenkammer. Untersuchen Sie die Probenmorphologie unter einem fünffach vergrößerten Stereomikroskop und machen Sie ein Schnappschuss-Hellfeldbild.

Setzen Sie an dieser Stelle die Probenplatte in ein MALDI-Massenspektrometer ein. Führen Sie dann eine bildgebende Massenspektrometrie durch. Wählen Sie einen charakteristischen Massenpeak aus der Massenliste aus, die im Ergebnisfenster angezeigt wird, und klicken Sie auf 2D, um ein zweidimensionales Ionenbild zu zeichnen.

Klicken Sie anschließend auf die Anpassungsschaltflächen im Popup-Fenster, um die obere und untere Grenze der Signalintensität zu bestimmen, um die Bildauflösung zu erhöhen, und klicken Sie auf Bild speichern. Beobachten und vergleichen Sie das Ionenbild mit dem zuvor aufgenommenen Hellfeldbild, um den wesentlichen Probenbereich zu erhalten. Klicken Sie nun auf die Nullpunkte und die rissigen Bereiche im Ionenbild, das im Ergebnisfenster angezeigt wird, um den zu analysierenden Bereich fein anzupassen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Kante suchen, um die äußerste Schicht des Ionenbilds zu suchen. Klicken Sie anschließend auf Abzug, um die Ionenhäufigkeitsinformationen der äußersten Schicht in einer Datenbank zu speichern, und entfernen Sie diese Schicht gleichzeitig aus dem Ionenbild. Nachdem Sie die vorherigen Schritte wiederholt haben, bis der Mittelpunkt des Ionenbildes definiert ist, klicken Sie auf und aktivieren Sie alle Kontrollkästchen in der Liste der Ausgabedaten und klicken Sie auf Exportieren, um die Daten zu exportieren.

Öffnen Sie abschließend die exportierten Daten mit einer Tabellenkalkulationssoftware, um die durchschnittliche Ionenhäufigkeit jeder Schicht zu berechnen und die räumlichen Verteilungsinformationen der Ionen zu erhalten. In den Hellfeld- und MALDI-Bildern der Maltotriose bevölkert sich das Ionensignal der sodierten Form hauptsächlich an der Peripherie des Probenbereichs, wenn er mit einer Probenplattentemperatur von 25 Grad Celsius präpariert wird. Durch die Absenkung der Temperatur auf fünf Grad Celsius wird das Signal homogen über den gesamten Probenbereich bevölkert, was darauf hindeutet, dass die Vorbereitung von Proben unter einer niedrigeren Probenplattentemperatur die Moleküle erheblich umverteilen und die Heterogenität verringern kann.

Das Bild des protonierten Bradykinin-Fragment-Ions zeigt einen ähnlichen Trend wie das sodierte Maltotriose. Statistische Analysen zeigen, dass die Heterogenität der Ionensignale, die unter einer Probenplattentemperatur von 5 Grad Celsius gewonnen werden, im Vergleich zu unter 25 Grad Celsius um 60 bis 80 Prozent abnimmt. Bei der sodierten Maltotriose mit einer Probenplattentemperatur von 25 Grad Celsius sind die Signalintensitäten in den Zentren viel geringer als bei einer Temperatur von 5 Grad Celsius.

Das protonierte Bradykinin-Fragment zeigt weniger Variationen, wenn die Temperatur der Probenplatte von 25 auf 5 Grad Celsius gesenkt wird. Bei dieser Trocknungsmethode müssen die Temperaturen und die relative Luftfeuchtigkeit in der Trockenkammer sorgfältig kontrolliert und überwacht werden. Einmal gemeistert, kann eine mit dieser Technik vorbereitete Probe in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der MALDI-MS, die quantitative Analyse von getrockneten Tröpfchenproben zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie homogene getrocknete Tröpfchenproben für die MALDI-MS-Analyse vorbereiten.