Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Verfahren ist es, die verschiedenen Terroir-Signaturen im Beerenmetabolom und Transkriptom der Rebsorte Corvina zu beobachten. Die hier beschriebene Fallstudie umfasste die Entnahme und Analyse von Proben in drei Reifestadien von sieben Weinbergen in drei Makrozonen über drei Vegetationsperioden. Die beschriebenen Techniken zeigen den vorherrschenden Reifeeffekt im Jahrgang auf das Beerenmetabolom.

Klare spezifische chemische Signaturen, die die drei Makrozonen repräsentieren, wurden auch in den reifen Beeren identifiziert. Die Terroir-Signatur auf der Ebene der Makrozone wurde mit geeigneten statistischen Techniken wie der PCA, der Hauptkomponentenanalyse, und der auto-BLSDA, der bidirektionalen orthogonalen Projektion auf bleierne Strukturen, der diskreten Analyse, zur Analyse sowohl der Transkriptomik als auch der Metabalomik-Datenmatrix aufgedeckt. Auf der anderen Seite sind die Unterschiede zwischen den einzelnen Weinbergen subtiler und erfordern auch ausgefeiltere und sensiblere statistische Ansätze.

Beginnen Sie das Experiment, indem Sie einen geeigneten Stichprobenplan entwickeln. Stellen Sie sicher, dass im Probenahmeplan die Probenahmeorte, -zeiten und das genaue Probenahmeverfahren angegeben sind. Nach der Ernte von 30 Beeren aus verschiedenen Positionen entlang von zwei Rebzeilen wählen Sie drei Beeren nach dem Zufallsprinzip aus jeder Traube aus und vermeiden Sie solche mit sichtbaren Schäden und/oder Anzeichen einer Infektion.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, um drei unabhängige Pools für jede Reifephase zu erhalten. Entkernen Sie die Beeren und frieren Sie das Perikarp sofort in flüssigem Stickstoff ein. Zerkleinern Sie alle gefrorenen Beeren aus jedem Pool mit einer automatischen Mühle.

Teilen Sie jede pulverisierte Probe in zwei gleiche Teile, einen für die Transkriptomik-Analyse und einen für die Metabolomik-Analyse. Schließen und entfernen Sie dann den Schlauch und lagern Sie die Pulver bei minus 80 Grad Celsius. Die Stoffwechselextrakte der Beerenproben werden bei Raumtemperatur in drei Volumina Methanol, angesäuert mit 0,1 %iger Ameisensäure, in einem Ultraschallbad bei 40 Kilohertz für 15 Minuten hergestellt.

Zentrifugieren Sie die Extrakte bei 16.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie das Übergewicht in zwei Volumina deionisiertem Wasser und passieren Sie einen 0,2-Mikron-Filter. Richten Sie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gekoppelt an die Massenspektrometrie, unter Verwendung einer Elektrospray-Ionisationsquelle oder eines HPLC-ESI-MS-Systems ein, wie im Textprotokoll beschrieben.

Führen Sie die HPLC-Trennung mit einem linearen Gradienten der Lösungsmittel A und B bei einer konstanten Flussrate von 0,2 Millilitern pro Minute unter Verwendung eines Probeninjektionsvolumens von 30 Mikrolitern durch. Erfassen Sie Massenspektren im abwechselnden negativen und positiven Ionisationsmodus, wobei die Parameter im Textprotokoll aufgeführt sind. Um die LCMS-Daten zu verarbeiten, implementieren Sie die Verfahren Peak Detection Alignment, Gap-Filling und Peak-Filterung mit geeigneter Software, wie z. B. der Open-Source-Software M Zeta Mine, Version 2.14.

Importieren Sie die resultierenden Textdateien in eine Tabelle. Daraus ergibt sich eine Datenmatrix, in der alle detektierten Metaboliten, die durch eine Identifikationsnummer, einen Wert des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses und eine Retentionszeit erkannt werden, in allen Proben in Bezug auf ihre Peakflächenwerte quantifiziert werden. Bereiten Sie die Hybridisierungsanordnung auf der Grundlage von Spezifikationen für vier Packungsformate vor, indem Sie 1,65 Mikrogramm Cyanin-markierte komplementäre RNA in ein Endvolumen von 41,8 Mikrolitern deionisierter RNAse freies Wasser geben.

Fügen Sie 11 Mikroliter 10-faches Blockierungsmittel und 2,2 Mikroliter 25-fachen Fragmentierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Thermostatbad, um die RNA zu fragmentieren. Nach 30 Minuten sofort eine Minute auf Eis abkühlen lassen.

Zum Schluss 55 Mikroliter 2X Hybridisierungspuffer hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen. Nachdem Sie eine Minute lang bei 15.500 g bei Raumtemperatur geschleudert haben, stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen sofort auf Eis. Um das benutzerdefinierte Micro-Array zu laden, legen Sie einen Dichtungsschieber mit dem Etikett nach oben in den Boden einer Hybridisierungskammer.

Laden Sie langsam 100 Mikroliter Hybridisierungsprobe in jede Dichtungsvertiefung und geben Sie die Flüssigkeit mit der Spitze einer Pipette ab, um Blasen zu vermeiden. Platzieren Sie das benutzerdefinierte Micro-Array langsam mit der Vorderseite nach unten, und stellen Sie sicher, dass der numerische Barcode nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass das Sandwichpaar richtig ausgerichtet ist.

Setzen Sie schließlich die Abdeckung der Hybridisierungskammer auf die Sandwich-Objektträger und ziehen Sie die Klemme von Hand an der Kammer fest. Drehen Sie die zusammengebaute Kammer, um die Beweglichkeit der Blasen zu beurteilen. Stellen Sie die zusammengesetzte Objektträgerkammer in einen ausgewogenen Drehspieß in einen Hybridisierungsofen, der auf 65 Grad Celsius eingestellt ist.

Stellen Sie den Rotator so ein, dass er sich mit 10 U/min dreht. Lassen Sie die Hybridisierung 17 Stunden lang laufen. Um mit der Micro-Array-Objektträgerwäsche fortzufahren, bereiten Sie drei Objektträgerfärbeschalen vor und füllen Sie sie mit den entsprechenden Waschpuffern.

Füllen Sie zwei Schalen mit Waschpuffer eins bei Raumtemperatur und eine Schale mit vorgewärmtem Waschpuffer zwei. Zerlegen Sie die Hybridisierungskammer und entfernen Sie das Sandwich. Tauchen Sie das Sandwich mit dem numerischen Barcode des Micro-Array-Objektträgers nach oben in die erste mit Waschpuffer gefüllte Färbeschale bei Raumtemperatur und trennen Sie mit Hilfe einer sauberen Pinzette die Dichtung vom Micro-Array-Objektträger.

Übertragen Sie den Micro-Array-Objektträger schnell in ein Objektträgergestell und legen Sie ihn in die zweite Objektträgerfärbeschale, die mit Waschpuffer eins bei Raumtemperatur gefüllt ist. Stellen Sie die Objektträger-Färbeschale auf einen Magnetrührer und waschen Sie sie eine Minute lang unter mäßigem Rühren. Schieben Sie den Objektträgerrost schnell in die dritte Objektträgerfärbeschale, die mit vorgewärmtem Waschpuffer zwei gefüllt ist, und waschen Sie ihn eine Minute lang unter mäßigem Rühren.

Nehmen Sie den Rost langsam aus der Objektträger-Fleckenschale und entfernen Sie den Objektträger vorsichtig vom Rost, wobei Sie Tröpfchen vermeiden sollten. Legen Sie den Micro-Array-Objektträger in einen geeigneten Scanner und scannen Sie jedes Array mit den Parametereinstellungen, die in der Bedienungsanleitung des Micro-Array-Herstellers empfohlen werden. Um die statistische Analysesoftware vorzubereiten, importieren Sie zunächst die Metabolomik- und Transkriptomik-Daten.

Gehen Sie zu Datei, Neues reguläres Projekt, Neues reguläres Projekt, um die erhaltene Datenmatrix zu importieren. Klicken Sie dann auf Bearbeiten. Transponieren Sie die gesamte Matrix, die Startseite, und weisen Sie die entsprechende primäre und sekundäre ID zu.

Um die multivariate statistische Analyse durchzuführen, navigieren Sie zum Fenster Workset, wählen Sie PCAX als Modelltyp aus und klicken Sie auf AutoFit. Wählen Sie Partituren und dann Streuung aus, um das Diagramm anzuzeigen, das die mögliche Gruppierung der Stichproben zeigt. Überprüfen Sie das PCA-Score-Diagramm.

Wenn Sie ein gutes Modell erhalten, verwenden Sie dieselben Stichprobenklassen, um ein O2PLS-Diskriminanzanalysemodell zu erstellen. Um zwei O2PLS-Diskriminanzanalysemodelle unter Verwendung der nach MacroZone klassifizierten Stichproben zu erstellen, weisen Sie die Klassen zu, indem Sie zu Startfenster, Neu As, M1 und Beobachtungen wechseln. Legen Sie die gewünschten Klassen fest.

Ändern Sie dann den Modelltyp von PCAX in O2PLS-Diskriminanzanalyse. Drücken Sie auf Automatisch anpassen. Fahren Sie mit Select M2 im Projektfenster fort und klicken Sie auf Scores und dann auf Scatter, um das Diagramm und die Position der Beispielklassen anzuzeigen.

Wechseln Sie zu Datentyp auswählen, und wählen Sie Beobachtungen und Ladungen aus. Klicken Sie dann auf Reihe hinzufügen, und wählen Sie die Elemente PQ-Korrelation eins und PQ-Korrelation zwei oder weitere Komponenten aus, sofern vorhanden. Halten Sie die rechte Maustaste auf dem Diagramm gedrückt, wechseln Sie zu Eigenschaft, wählen Sie Farbe und dann Nach Begriffen aus, um die Diagrammsymbole zwischen Molekülen und Klassen zu unterscheiden.

Gehen Sie zu Layout, Plot formatieren, Access und/oder Stile, um den Plot mit den gewünschten Eigenschaften zu ändern. Um zu beobachten, welche Metaboliten eine oder mehrere spezifische Klassen charakterisieren, gehen Sie zu Diagrammliste und dann zu Streuung. Die explorative Analyse der gesamten Datenmatrix durch PCA zeigte, dass die Proben nach dem Reifestadium, einschließlich Reife, Reife, Reife, entlang der ersten und zweiten Hauptkomponente gruppiert wurden.

Die Proben gruppierten sich nach der Vegetationsperiode entlang der dritten Hauptkomponente. Die O2PLS-Diskriminanzanalyse von reifen Beeren ermöglicht die Identifizierung spezifischer Terroirsignaturen, die die drei Makrozonen Valpolicella, Gardasee und Soave repräsentieren. Die Belastungsdiagramme dieser Modelle werden als PQ-Korrelation ausgedrückt, die Korrelation zwischen P, der Klasse der Proben, und Q, den Metaboliten.

In den Loading-Plots stellen die roten Quadrate die Klasse der Proben oder Makrozonen dar, und die farbigen Dreiecke stellen die einzelnen Metaboliten dar. Die Metaboliten sind entsprechend ihrer chemischen Klasse farbcodiert, und der Abstand zwischen den Metaboliten und den Proben spiegelt ihre Beziehungen wider. Die Makrozone des Gardasees war durch Stilbene gekennzeichnet, während Soave und Valpolicella durch Flavonoide gekennzeichnet waren.

Innerhalb der Anthocyane waren Peonidin und seine Derivate in der Makrozone des Gardasees häufiger anzutreffen, während die anderen Anthocyane in der Makrozone Valpolicella häufiger vorkamen. Darüber hinaus waren Anthocyanin-Drei-O-Glucoside in der Valpolicella-Makrozone häufiger anzutreffen, während acylierte und cumerierte Derivate in der Soave-Makrozone häufiger vorkamen. Transkriptomik, RA und RNA-Sig-Methoden ermöglichen die gleichzeitige Überwachung von Tausenden von Transkripten von Weinreben.

Vor kurzem wurde ein neues, kundenspezifisches Micro-Array entwickelt, das eine noch größere Anzahl von Sonden darstellt, die zusätzliche, neu entdeckte Gattung der Weinrebe repräsentieren. Angesichts der raschen Obsoleszenz von transkriptomischen Plattformen haben wir ein alternatives Verfahren beschrieben, bei dem eine neue Plattform verwendet wird, die mehr Sonden enthält als die alte, darunter 249 mehr Peno-vorhergesagte Transkripte für 1392 neu identifizierte Peno-Loci und 179 Corvina-Prava-Gene. Die Metabolomik-Analyse mittels HPLC-ESI-MS ist sensitiv genug, um eine große Anzahl von Metaboliten gleichzeitig zu detektieren.

Die Möglichkeit, eine Stichprobenebene zu erstellen, ist von entscheidender Bedeutung. Die Wahl eines einzigen Klons, um die genetischen Unterschiede zu minimieren, und die mehrfache Dauer der Probenahme ermöglichten es, die tatsächlichen Unterschiede zwischen den Terroirs zu identifizieren. Es wäre interessant, die gleiche Sorte zu vergleichen, die in weniger optimalen Zonen angebaut wird, aber leider waren diese Weinberge nicht verfügbar.