Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Verfahren besteht darin, die unterschiedlichen Terroir-Signaturen im Metabolom und Transkriptom der Traubenrebsorte Corvina zu beobachten. Die hier beschriebene Fallstudie umfasste die Sammlung und Analyse von Proben in drei Reifestadien aus sieben Weinbergen in drei Großzonen über drei Anbausaisons hinweg. Die beschriebenen Techniken zeigen den vorherrschenden Einfluss des Jahrgangs auf das Traubenmetabolom während der Reifung auf.

Klare, spezifische chemische Signaturmuster, die die drei Makrozonen repräsentieren, wurden ebenfalls in den reifen Beeren identifiziert. Die Terroir-Signatur auf Ebene der Makrozonen wurde mithilfe geeigneter statistischer Verfahren wie der PCA, der Hauptkomponentenanalyse, und der auto BLSDA, der bidirektionalen orthogonalen Projektion auf bleihaltige Strukturen, diskrete Analyse, aufgedeckt, um sowohl die Transkriptomik- als auch die Metabolomik-Datenmatrizen zu analysieren. Die Unterschiede zwischen einzelnen Weinbergen hingegen sind subtiler und erfordern zudem anspruchsvollere und empfindlichere statistische Ansätze.

Beginnen Sie das Experiment mit der Erstellung eines geeigneten Probenahmeplans. Stellen Sie sicher, dass der Probenahmeplan die Probenahmestellen, -zeiten und das genaue Probenahmeverfahren angibt. Nachdem Sie 30 Trauben aus verschiedenen Positionen entlang von zwei Reihen geerntet haben, wählen Sie zufällig drei Beeren aus jeder Traube aus, wobei Sie solche mit sichtbaren Schäden oder Anzeichen einer Infektion vermeiden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, um drei unabhängige Pools für jeden Reifestadium zu erhalten. Entkernen Sie die Beeren und frieren Sie das Perikarp sofort in flüssigem Stickstoff ein. Zerkleinern Sie alle gefrorenen Beeren aus jedem Pool mit einer automatischen Mühle.

Teilen Sie jede pulverförmige Probe in zwei gleiche Teile, einen für die Transkriptomik-Analyse und einen für die Metabolomik-Analyse. Schließen und entfernen Sie anschließend den Duer und lagern Sie die Pulver bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die metabolischen Extrakte der Beerenproben bei Raumtemperatur in drei Volumina Methanol, angesäuert mit 0,1 % Ameisensäure, in einem Ultraschallbad bei 40 Kilohertz für 15 Minuten vor.

Zentrifugieren Sie die Extrakte bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie das Überstand in zwei Volumina entionisiertem Wasser und filtrieren Sie es durch einen 0,2-Mikron-Filter. Richten Sie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gekoppelt an die Massenspektrometrie, mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle oder einem HPLC-ESI-MS-System gemäß dem schriftlichen Protokoll ein.

Führen Sie die HPLC-Trennung mit einem linearen Gradienten der Lösungsmittel A und B bei einer konstanten Flussrate von 0,2 Milliliter pro Minute durch, wobei ein Probenvolumen von 30 Mikroliter injiziert wird. Erfassen Sie Massenspektren abwechselnd im negativen und positiven Ionisationsmodus mit den in der Textanleitung aufgeführten Parametern. Zur Verarbeitung der LC-MS-Daten wenden Sie Verfahren zur Peakdetektion, Ausrichtung, Lückenfüllung und Peakfilterung mit geeigneter Software an, beispielsweise der Open-Source-Software M Zeta Mine, Version 2.14.

Importieren Sie die resultierenden Textdateien in eine Tabellenkalkulation. Dadurch entsteht eine Datenmatrix, in der alle nach Identifikationsnummer, Masse-zu-Ladung-Verhältnis und Retentionszeit identifizierten Metaboliten anhand ihrer Peakflächenwerte in allen Proben quantifiziert werden. Bereiten Sie die Hybridisierungsansammlung gemäß den Vorgaben des Vierer-Pack-Formats vor, indem Sie 1,65 Mikrogramm cyaninfarben markierte komplementäre RNA in einem Endvolumen von 41,8 Mikrolitern deionisiertem RNAse-freiem Wasser aufbringen.

Fügen Sie 11 µL 10X-Blockierungsmittel und 2,2 µL 25X-Fragmentierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 60 °C in einem thermostatischen Bad, um die RNA zu fragmentieren. Kühlen Sie nach 30 Minuten unverzüglich eine Minute lang auf Eis ab.

Fügen Sie abschließend 55 Mikroliter 2X Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren. Nach einer Zentrifugation für eine Minute bei 15.500 × g bei Raumtemperatur stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen umgehend auf Eis. Zum Beladen des kundenspezifischen Mikroarrays laden Sie einen Dichtungsobjektträger mit der Beschriftung nach oben in den Boden einer Hybridisierungskammer ein.

100 Mikroliter der Hybridisierungsprobe langsam auf jedes Dichtungsfach geben, wobei die Flüssigkeit mit der Pipettenspitze zugegeben wird und Blasen vermieden werden sollten. Das maßgeschneiderte Mikroarray langsam mit der Unterseite nach unten platzieren, wobei der numerische Barcode nach oben zeigen muss. Sicherstellen, dass das Sandwich-Paar korrekt ausgerichtet ist.

Schließlich wird der Deckel der Hybridisierungskammer auf die belegten Objektträger gesetzt und die Klammer per Hand fest an der Kammer angezogen. Die montierte Kammer wird gedreht, um die Beweglichkeit von Luftblasen zu überprüfen. Die montierte Objektträgerkammer wird in einen ausgewuchteten Rostgrill im Hybridisierungsofen bei 65 Grad Celsius gestellt.

Stellen Sie den Rotator auf 10 U/min ein. Lassen Sie die Hybridisierung 17 Stunden lang durchlaufen. Um mit der Wäsche der Microarray-Objektträger fortzufahren, bereiten Sie drei Objektträgerfärbungsgefäße vor und füllen Sie diese mit den entsprechenden Waschpuffern.

Füllen Sie zwei Schalen mit Waschpuffer eins, bei Raumtemperatur, und eine Schale mit vorgewärmtem Waschpuffer zwei. Bauen Sie die Hybridisierungskammer auseinander und entfernen Sie das Sandwich. Tauchen Sie das Sandwich mit der numerischen Barcode-Seite des Microarray-Slides nach oben in die erste Färbeschale, die mit Waschpuffer eins bei Raumtemperatur gefüllt ist, und lösen Sie mit Hilfe sauberer Pinzette die Dichtung vom Microarray-Slide.

Überführen Sie den Microarray-Objektträger schnell in einen Objektträgerkäfig und legen Sie ihn in die zweite Färbegefäße, die mit Waschpuffer eins bei Raumtemperatur gefüllt ist. Stellen Sie das Färbegefäß auf einen magnetischen Rührer und waschen Sie eine Minute lang mit mäßiger Rührung. Überführen Sie den Objektträgerkäfig schnell in das dritte Färbegefäß, das mit vorgewärmtem Waschpuffer zwei gefüllt ist, und waschen Sie eine Minute lang mit mäßiger Rührung.

Entfernen Sie den Rack langsam aus der Objektträgerfärbewanne und nehmen Sie vorsichtig den Objektträger aus dem Rack, wobei Tropfenbildung vermieden werden sollte. Legen Sie den Microarray-Objektträger in einen geeigneten Scanner und scannen Sie jeden Array unter Verwendung der in der Bedienungsanleitung des Microarray-Herstellers empfohlenen Parametersätze. Um die statistische Analyse-Software vorzubereiten, importieren Sie zunächst die Metabolomik- und Transkriptomik-Daten.

Gehen Sie zu Datei, Neues reguläres Projekt, Neues reguläres Projekt, um die erhaltene Datenmatrix zu importieren. Klicken Sie dann auf Bearbeiten. Transponieren Sie die gesamte Matrix, Startseite, und weisen Sie die entsprechenden primären und sekundären IDs zu. Und beenden Sie.

Um die multivariate statistische Analyse durchzuführen, wechseln Sie zum Workset-Fenster, wählen Sie PCAX als Modelltyp aus und klicken Sie auf AutoFit. Wählen Sie anschließend Scores und dann Scatter, um das Diagramm anzuzeigen, das die mögliche Gruppierung der Proben zeigt. Untersuchen Sie das PCA-Score-Diagramm.

Wenn ein gutes Modell erhalten wurde, verwenden Sie dieselben Probenklassen, um ein O2PLS-Diskriminanzanalysemodell zu erstellen. Um zwei O2PLS-Diskriminanzanalysemodelle unter Verwendung der nach MacroZone klassifizierten Proben zu erstellen, weisen Sie die Klassen zu, indem Sie zum Startfenster gehen, dann Neu Als, M1 und Beobachtungen auswählen. Legen Sie die gewünschten Klassen fest.

Ändern Sie anschließend den Modelltyp von PCAX zu O2PLS-Diskriminanzanalyse. Klicken Sie auf „Autofit“. Gehen Sie im Projekt-Fenster zu M2, klicken Sie auf „Scores“ und dann auf „Scatter“, um die Grafik und die Position der Probengruppen zu sehen.

Wechseln Sie zu „Datenart auswählen“ und wählen Sie Beobachtungen und Ladungen aus. Klicken Sie dann auf „Reihe hinzufügen“ und wählen Sie die Elemente PQ-Korrelation eins und PQ-Korrelation zwei oder weitere vorhandene Komponenten aus. Drücken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, gehen Sie zu „Eigenschaft“, wählen Sie „Farbe“ und dann „Nach Begriffen“, um die Diagrammsymbole zwischen Molekülen und Klassen zu unterscheiden.

Wechseln Sie zu Layout, Diagramm formatieren, Zugriff und/oder Stile, um das Diagramm mit den gewünschten Eigenschaften zu modifizieren. Um zu beobachten, welche Metaboliten eine oder mehrere spezifische Klassen charakterisieren, wechseln Sie zur Diagramm-Liste und anschließend zu Streudiagramm. Die explorative Analyse der gesamten Datenmatrix mittels PCA zeigte, dass sich die Proben entsprechend dem Reifestadium – einschließlich Veraison, mittleres Reifen und vollreif – entlang der ersten und zweiten Hauptkomponente gruppierten.

Die Proben gruppierten sich entlang der dritten Hauptkomponente entsprechend der Wachstumssaison. Die O2PLS-Diskriminanzanalyse reifer Beeren ermöglicht die Identifizierung spezifischer Terroir-Signaturen, die die drei Makrozonen Valpolicella, Gardasee und Soave repräsentieren. Die Ladeplots dieser Modelle werden als PQ-Korrelation ausgedrückt, also als Korrelation zwischen P, der Klasse der Proben, und Q, den Metaboliten.

In den Ladeplots stellen die roten Quadrate die Klasse der Proben oder Makrozonen dar, und die farbigen Dreiecke repräsentieren die einzelnen Metaboliten. Die Metaboliten sind gemäß ihrer chemischen Klasse farbkodiert, und der Abstand zwischen den Metaboliten und den Proben spiegelt deren Beziehungen wider. Die Makrozone des Gardasees war durch Stilbene gekennzeichnet, während Soave und Valpolicella durch Flavonoide geprägt waren.

Unter den Anthocyanen waren Peonidin und seine Derivate in der Makrozone des Gardasees häufiger vertreten, während die anderen Anthocyane in der Makrozone von Valpolicella häufiger vorkamen. Außerdem waren Anthocyanin-3-O-Glucoside in der Makrozone von Valpolicella verbreiteter, während acylierte und cumarierte Derivate in der Makrozone von Soave häufiger auftraten. Mit den Methoden der Transkriptomik, RA und RNA sig können gleichzeitig Tausende von Transkripten der Weinrebe überwacht werden.

Ein neues, benutzerdefiniertes Mikroarray wurde kürzlich konzipiert und umfasst eine noch größere Anzahl von Sonden, die zusätzliche, neu entdeckte Arten der Gattung Weinrebe repräsentieren. Angesichts der schnellen Veraltung von transkriptomischen Plattformen beschreiben wir ein alternatives Verfahren unter Verwendung einer neuen Plattform mit mehr Sonden als die alte, einschließlich 249 weiterer vorhergesagter peno-Transkripte, 1392 neu identifizierter peno-Loci und 179 corvina prava-Genen. Die Metabolom-Analyse mittels HPLC-ESI-MS ist empfindlich genug, um gleichzeitig eine große Anzahl von Metaboliten nachzuweisen.

Die Fähigkeit, eine Stichprobenebene zu erstellen, ist entscheidend. Die Auswahl eines einzelnen Klons zur Minimierung genetischer Unterschiede sowie die mehrfache Dauer der Probenahme ermöglichten die Identifizierung der tatsächlichen Unterschiede zwischen den Terroirs. Es wäre interessant, denselben Sorten in weniger optimalen Zonen anzubauen, doch leider standen diese Weinberge nicht zur Verfügung.