eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

Das übergeordnete Ziel dieses speichelbasierten, kernbasierten Multiplex-Immunoassays für Antikörper besteht darin, die kausalen Erreger von umweltbedingten symptomatischen und asymptomatischen Erkrankungen zu identifizieren, indem die IGG-Antikörperantworten gegen mehrere Krankheitserreger gleichzeitig gemessen werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Expositionswissenschaft zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Erreger sind für die Entstehung von Erkrankungen in bestimmten Bevölkerungsgruppen verantwortlich?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur schnellen und kostengünstigen Bestimmung von Antikörpern gegen mehrere Analyten gleichzeitig mit sehr geringen Probenvolumina genutzt werden kann. Diese Methode kann Aufschluss über ätiologische Agentien und deren Expositionsquellen geben, einschließlich lebensmittel-, wasser- und luftübertragener Übertragungswege. Die offizielle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Ergebnisse bei unsachgemäßer Durchführung unzuverlässig sein können.

Vortexen und sonifizieren Sie zunächst die Stammlösungen der an die Antigene gebundenen Perlen jeweils 20 Sekunden lang, um homogene Perlen-Suspensionen zu erzeugen. Verdünnen Sie anschließend die konjugierten Perlen-Stammlösungen auf eine Endkonzentration von 100 Perlen pro Mikroliter jeder einzelnen Perlen-Set in PBS, ergänzt mit 1 % BSA. Bereiten Sie danach mindestens sieben zweifache serielle Verdünnungen des primären Anti-Spezies-IGG-Antikörpers gemäß den Herstellerempfehlungen in PBS mit BSA in einer 96-Loch-Rundbodenplatte vor.

Befeuchten Sie separat eine acht 12-Spalten-Kolonne einer 96-Loch-Filterbodenplatte für jeden Antigen-Kopplungsbestätigungstest mit 100 µL Waschpuffer und entfernen Sie den Überstand mittels Vakuum. Geben Sie anschließend 50 µL der mit Antigen beschichteten Perlen in die vorbefeuchteten Vertiefungen sowie jeweils 50 µL des seriell verdünnten Antikörpers in die Reihen eins bis sieben der 96-Loch-Filterplatte; geben Sie 50 µL PBS mit BSA in Reihe acht als Hintergrundkontrolle für den verdünnten Antikörper. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Inhalt jedes Wells fünfmal auf- und abzusaugen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.

Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie die Antikörper mit den Antigen-gekoppelten Perlen im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem Mikroplatten-Shaker bei 500 U/min. Nach einer Stunde saugen Sie den Überstand ab und waschen die Vertiefungen mit zwei Portionen von jeweils 100 Mikroliter Waschpuffer. Nach dem zweiten Waschgang ersetzen Sie den Puffer durch 50 Mikroliter PBS mit BSA.

Verdünnen Sie nun den biotinylierten, artenspezifischen sekundären IGG-Detektionsantikörper auf 16 Mikrogramm pro Milliliter in PBS mit BSA und geben Sie 50 Mikroliter des verdünnten sekundären Antikörpers in jede Reihe. Inkubieren Sie die Kügelchen und Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Plattenschüttler. Am Ende der Inkubation saugen Sie den Überstand ab und waschen die Kügelchen mit zwei Portionen je 100 Mikroliter Waschpuffer.

Nach der zweiten Waschung die Pellets in 50 Mikrolitern PBS mit BSA erneut suspendieren und den Streptavidin-r-Phycoerythrin-Reporter auf 24 Mikrogramm pro Milliliter in PBS mit BSA verdünnen. 50 Mikroliter des Reporters zu jeder Vertiefung hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln auf dem Schüttler inkubieren, gefolgt von zwei Spülgängen mit je 100 Mikrolitern Waschpuffer, wie gezeigt.

Anschießend die Kügelchen in 100 Mikroliter PBS mit BSA wieder in Suspension bringen und die antigengebundenen Kügelchen mit dem Analysator auswerten. Nach dem erneuten Suspandieren der antigengebundenen Kügelchenlager durch Vortexen und Beschallung für 20 Sekunden, die gebundenen Kügelchenlager auf eine Endkonzentration von 100 Kügelchen pro Mikroliter jedes einzelnen Kügelchensatzes in PBS mit BSA verdünnen. Danach eine Verdünnung von Speichel bei Raumtemperatur im Verhältnis 1:4 in PBS mit BSA in einer 96-Loch-Tiefbrunnenplatte herstellen.

Befeuchten Sie eine Filterplatte mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und aspirieren Sie den Überstand. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter antigenbeschichtete Kügelchen und ein gleiches Volumen der verdünnten Speichellösung in 95 Vertiefungen der 96-Loch-Filterplatte für eine Endverdünnung von eins bis acht. Gleichzeitig geben Sie 50 Mikroliter antigenbeschichtete Kügelchen sowie 50 Mikroliter PBS mit BSA allein in das Kontrollloch.

Die Kügelchen im Dunkeln eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf dem Mikroplatten-Shaker mit 500 U/min inkubieren. Danach den Überstand abpipettieren und die Vertiefungen zweimal mit jeweils 100 Mikrolitern Waschpuffer waschen. Nach dem zweiten Waschgang die Kügelchen in 50 Mikrolitern PBS mit BSA erneut suspendieren.

Verdünnen Sie den sekundären Antikörper und geben Sie 50 Mikroliter davon in jede Vertiefung. Nach dem Mischen des Inhalts der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln auf dem Schüttler, waschen Sie die Vertiefungen anschließend zweimal mit jeweils 100 Mikrolitern Waschpuffer und resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern frischem PBS mit BSA. Verdünnen Sie nun den Reporter und geben Sie 50 Mikroliter davon in jede Vertiefung.

Sorgfältig mit einer Mehrkanalpipette mischen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler im Dunkeln die Vertiefungen zwei Mal wie gezeigt waschen, dann die Perlen in 100 µL PBS mit BSA resuspendieren und die Proben auf dem Analysator auswerten. Um sicherzustellen, dass die antigenbelegten Perlen in der Lage sind, den dynamischen Bereich des Assays zu erreichen, wird eine geeignete Kopplung definiert als eine mittlere Fluoreszenzintensität größer oder gleich 18.000.

Wie anhand dieser repräsentativen Kopplungsbestätigungen der Antigene im Test für C.jejuni und T.gondii gezeigt wurde. Basierend auf dem etablierten Cut-off-Wert lagen die Immunprävalenzraten für die Proben zwischen etwa 2 % für T.gondii und nahezu 50 % für Norovirus-Genogruppe 1.1, was darauf hinweist, dass die Immunprävalenzrate für Noroviren am höchsten war, gefolgt von Hepatitis A und H. pylori. Während 32 % der Proben gegenüber allen im Test enthaltenen Erregern immunonegativ waren, erwiesen sich 68 % der Proben als immunpositiv gegenüber einem oder mehreren Erregern.

Wenn man einmal die Beherrschung dieser Methode erlangt hat, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa vier Stunden abgeschlossen werden. Während des Durchführens dieser Prozedur ist es wichtig, die Perlen vor Licht zu schützen, um eine Photo-Bleiche zu vermeiden. Nach dieser Methode können andere Verfahren wie ELISAs und Western Blotting angewendet werden, um zusätzliche Fragen zur Empfindlichkeit und Spezifität zu beantworten.

Sowie der Kreuzreaktivität der Antikörper. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten der Epidemiologie, Expositionswissenschaft und klinischen Mikrobiologie den Weg, menschliche Risiken durch Umweltexpositionen zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man einen multiplex-Immunoassay entwickelt, analysiert und die Ergebnisse interpretiert, um Antikörper gegen mehrere Erreger gleichzeitig zu messen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Körperflüssigkeiten und Natriumazid äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung sowie die ordnungsgemäße Entsorgung von Reagenzien zu beachten sind, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.