Kontrollierte Synthese und Fluoreszenz-Tracking von Hoch Uniform Poly ( N Isopropylacrylamid) Mikrogele

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, das dynamische Verhalten und die Wechselwirkung von weichen kolloidalen Partikeln in Dispersionen verschiedener Partikeldichten in der Nähe des Glasübergangs zu untersuchen. Mikrogele sind weiche Objekte, die ihre Größe, Form und Beweglichkeit an ihre Umgebung anpassen können. Im Gegensatz zu starren kolloidalen Partikeln gibt es viele offene Fragen zum Verhalten von weichen Mikrogelen.

Der Hauptvorteil der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist die Möglichkeit, einzelne Mikrogele mit hoher Genauigkeit zu lokalisieren, ihre Bewegung in C2 direkt zu verfolgen und die Diffusionsmengen zu analysieren. Um die Dynamik einzelner Mikrogele in dichten Systemen zu untersuchen, muss nur eine kleine Anzahl von Mikrogelen fluoreszenzmarkiert werden. Die nicht gerührte Fällungspolymerisation ermöglicht die parallele Synthese von Mikrogelen mit variablen Reaktionsbedingungen, um die Größe von markierten und unmarkierten Mikrogelen bequem anzupassen.

Die dynamische Lichtstreuung liefert die durchschnittlichen hydrodynamischen Radien der Mikrogele mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern. 1,8 Gramm NIPAM und 24 Milligramm BIS werden in 245 Millilitern gefiltertem, doppelt destilliertem Wasser in einem 500 Milliliter fassenden Dreihalskolben mit rundem Boden gelöst, der mit einem Rückflusskondensator, einem Rührer und einem Gummiseptum ausgestattet ist. Führen Sie ein Thermometer und eine 120-Millimeter-Nadel für den Stickstoffeintrag durch das Septum ein.

Erhitzen Sie die Lösung unter Rühren auf 60 Grad Celsius. Dann entsaueren Sie die Lösung, indem Sie sie 40 Minuten lang mit Stickstoff spülen. Bereiten Sie gleichzeitig eine Initiatorlösung aus 155 Milligramm Kaliumpersulfat (KPS) in fünf Millilitern gefiltertem, doppelt destilliertem Wasser vor und blasen Sie die Lösung mit Stickstoff, um Sauerstoff zu entfernen.

Waschen Sie anschließend eine Spritze mit Stickstoff und geben Sie die komplette Fünf-Milliliter-KPS-Lösung in eine mit Stickstoff gewaschene Spritze, die mit einer 120-Millimeter-Nadel ausgestattet ist. Die Stickstoffnadel wird über das Lösungsniveau des Dreihalskolbens gehoben und die KPS-Lösung rasch durch das Gummiseptum in den Reaktor gegeben. Lassen Sie die Polymerisation eine Stunde lang unter Stickstofffluss und langsamem Rühren bei 60 Grad Celsius laufen.

Verwenden Sie einen Buchner-Trichter und Filterpapier, um die heiße Reaktionslösung zu filtern, und entsorgen Sie alle großen Zuschlagstoffe. Nachdem Sie die Dispersion abkühlen gelassen haben, zentrifugieren und redispergieren Sie die Dispersion dreimal für 40 Minuten bei 257.000 G. Schließlich wird das Sediment in einer minimalen lebensfähigen Menge doppelt destilliertem Wasser redispergiert, bevor Sie die Dispersion für die Lagerung lyophilisieren. Wiegen Sie 257,7 Milligramm NIPAM, 3,5 Milligramm BIS und 1,5 Milligramm Methacryloxyethylthiocarbamoylrhodamin B-Farbstoff in einem Glasgefäß und fügen Sie 10 Milliliter doppelt destilliertes Filterwasser hinzu.

Bereiten Sie die gleiche Lösung ohne den Farbstoff in einem separaten Glasgefäß vor. Beschallen Sie die Färbelösung 15 Minuten lang, um den Farbstoff in Wasser aufzulösen. Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen der Monomerlösung mit dem Farbstoff vor, um eine Konzentrationsreihe zu erhalten.

Hier wird Farbstoff im Konzentrationsbereich von 02 bis 0,1 Millimol pro Liter verwendet. Als nächstes lösen Sie 8,4 Milligramm KPS in 10 Millilitern gefiltertem, doppelt destilliertem Wasser auf, um die Initiatorlösung zu erhalten. 0,5 Milliliter der Konzentrationsreihe und 05 Milliliter der KPS-Lösung werden in Reagenzgläser mit einem Durchmesser von 10 Millimetern überführt, um die endgültigen Reaktionslösungen zu erhalten.

Verschließen Sie die Schläuche mit Gummisepten. Heizen Sie ein Ölbad in einem doppelwandigen Glasgefäß, das mit einer Heizungsumwälzpumpe verbunden ist, auf 63 Grad Celsius vor. Desoxygenieren Sie die Reaktionslösungen, indem Sie 20 Minuten lang mit Stickstoff durch 120-Millimeter-Nadeln spülen.

Führen Sie dann die Rohre in eine schwimmende Plattform ein und tauchen Sie die Plattform in das vorgewärmte Ölbad. Stellen Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius ein. Für eine hochpräzise Abstimmung der Partikelgröße muss die Temperaturregelung während der Erstreaktion streng sein, typischerweise plus oder minus 0,1 Grad Celsius.

Lassen Sie die Reaktion für eine angemessene Zeit ablaufen. In der Regel reicht eine Stunde aus. Nach der Reaktion werden die Reaktionsgefäße schnell in einen Ofen bei 60 Grad Celsius überführt.

Einen Tropfen der heißen Dispersion in 10 Milliliter gefiltertes, doppelt destilliertes Wasser geben, das über die Poly-NITAM-Volumen-Phasenübergangstemperatur vorgewärmt wurde, um die hydrodynamischen Radien der Partikel im kollabierten Zustand zu messen. Lassen Sie die restlichen Dispersionen auf Raumtemperatur abkühlen und füllen Sie sie in Zentrifugenröhrchen um. Nach dem Zentrifugieren der Lösung verdünnen Sie die Mikrogele in zwei Millilitern gefiltertem, doppelt destilliertem Wasser, um sie als Tracerpartikel zu verwenden.

Für die hydrodynamische Radiusbestimmung im zusammengeklappten Zustand durch dynamische Lichtstreuung werden die Küvetten und Glaswaren zunächst mit Acetondampf gewaschen. Etwa ein Milliliter der verdünnten Partikeldispersion wird in eine Messküvette überführt. Temperieren Sie das dynamische Lichtstreu-Goniometer-Index-Match-Bad auf 50 Grad Celsius und übertragen Sie die Probe auf das Gerät, ohne sie abkühlen zu lassen.

Setzen Sie die Probenküvette ein und bewegen Sie den Detektorarm auf den kleinen Streuwinkel. Nachdem Sie das Strahlprofil und den Zählbereich überprüft haben, wie im Textprotokoll beschrieben, bewegen Sie den Goniometerarm auf den höchsten Streuwinkel. Prüfen Sie, ob die Zählrate noch hoch genug für die Messung ist.

Wenn die Intensität zu niedrig ist, bewegen Sie den Arm in einen niedrigeren Streuwinkel. Überprüfen Sie dann den Strahl visuell durch das Toluol-Badglas bei dem geringsten Streuwinkel. Wenn ein Leuchten um den einfallenden Strahl beobachtet wird, findet eine Mehrfachstreuung statt.

Erfassen Sie 20 Korrelogramme zwischen dem minimalen und dem maximalen Streuwinkel mit einer minimalen Erfassungszeit von 60 Sekunden. Erhöhen Sie bei Bedarf die Erfassungszeit für schwache Intensitäts-Großstreuwinkel. Verwenden Sie eine geeignete Objektivlinse mit der gewünschten Vergrößerung und Apertur zur Anregung der Tracer und zur gleichzeitigen Fluoreszenzentnahme aus der Probe.

In dieser Arbeit wird ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur und 1,3 verwendet. Stellen Sie die Feuchtigkeitskammer auf einen XYZ pi-SO-Tisch, der in ein Mikroskop passt. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, legen Sie einen plasmagereinigten Deckglas in die Feuchtigkeitskammer und pipettieren Sie 10 Mikroliter der gewünschten Konzentration der Poly-NITAM-Dispersion.

Abhängig von den Anregungs- und Emissionsspektren des Fluoreszenzfarbstoffs ist ein geeigneter Laser zur Anregung zu verwenden und die Laserleistung entsprechend einzustellen. Zum Einsatz kommt hier ein 561-Nanometer-Diodenpump-Festkörperlaser mit einer konstanten Laserleistung von 16 Milliwatt. Um eine homogene Probenbeleuchtung zu erhalten, koppeln Sie den Laser in eine Multimode-Faser ein, schütteln Sie die Faser mit einem Vortexer, um die Laserflecken vorübergehend auszugleichen, und projizieren Sie das Faserende in die Probenebene.

Kalibrieren Sie den Z-Abstand von der Rückreflexion des Deckglases und fokussieren Sie mehrere Mikrometer in die Probe, indem Sie das Objektiv leicht nach oben bewegen, und fixieren Sie die Z-Position mit einem Z-Kompensator. Dadurch werden Schnittstelleneffekte mit dem Deckglas vermieden. Passen Sie die Detektorparameter, wie z. B. die Belichtungszeit, an die Stärke des Fluoreszenzsignals an.

In diesem Fall kommt eine EMCCD-Kamera mit einer Belichtungszeit von 0,1 Sekunden im Elektronenmultiplikationsmodus und einer Verstärkung von 50 zum Einsatz. Nehmen Sie mehrere Filme mit der entsprechenden Anzahl von Bildern auf, um eine angemessene Verzögerungszeit zur Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung der Mikrogele in verschiedenen Bereichen der Probe zu erhalten. Acht markierte Mikrogelchargen wurden synthetisiert.

Für sechs Chargen steigen die Korrelogramm-Zerfallsraten linear gegen das Quadrat der Streuvektorgröße an, was auf eine enge Größenverteilung hinweist. Eine Anpassung durch den Ursprung zeigt nur translationale Diffusion an. Bei zwei Chargen wird ein nichtlineares Verhalten beobachtet.

Die Abweichung wird durch eine breite Größenverteilung und ein Minimum des Partikelformfaktors verursacht, das mit dem Streuvektorbereich übereinstimmt. Um eine bessere Schätzung des mittleren Diffusionskoeffizienten der Partikel zu erhalten, schließen Sie diese Punkte aus der Anpassung aus. Das hohe Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht die Verfolgung von fluoreszierenden Mikrogelen.

Ihre Diffusion wird durch die unmarkierte Mikrogelmatrix eingeschränkt. Höhere Konzentrationen an unmarkierter Mikrogelmatrix auf der rechten Seite führen zu einem ausgeprägten Käfigeffekt, bei dem die fluoreszierenden Mikrogele in einer unmarkierten Matrix aus Mikrogelen eingeschlossen sind. Bei niedrigen Konzentrationen unmarkierter Mikrogelmatrix zeigen die Tracer-Mikrogele eine normale Diffusion, die aus der linearen Zunahme der mittleren quadratischen Verschiebung mit der Verzögerungszeit abgeleitet wird.

Bei hohen Konzentrationen in der Nähe des kolloidalen Glasübergangs zeigen sie jedoch eine nichtlineare Diffusion, die durch die nichtlineare zeitliche Entwicklung der mittleren quadratischen Verschiebungen dargestellt wird. Bei einer höheren Konzentration an unmarkierter Mikrogelmatrix werden die Tracer-Mikrogele von unmarkierten Nachbarn in transienten Käfigen gefangen, wie durch geclusterte Spuren für 12 Mikrogele veranschaulicht. Die parallele Synthese im kleinen Maßstab ermöglicht das schnelle Experimentieren mit verschiedenen Reaktionsparametern.

Dadurch werden auch unerwünschte experimentelle Schwankungen aufgrund von Temperaturunterschieden der Reaktion minimiert. In Kombination mit der sorgfältigen Charakterisierung der dynamischen Lichtstreuung können die Reaktionsbedingungen für die richtige Mikrogelgröße schnell gefunden werden. In diesem Video zeigen wir, wie wir mit Hilfe der kontrollierten Mikrogelsynthese die Diffusion einzelner Mikrogele in konzentrierten Mikrogellösungen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie untersuchen können.

Nach diesem Verfahren wird es möglich sein zu verstehen, wie die Struktur von Mikrogelen ihre Eigenschaften steuert. Dies wird die Tür zur Gestaltung neuer weicher interaktiver Materie öffnen.