Artbestimmung und Quantifizierung in Mischungen Mit MRM-Massenspektrometrie von Peptiden, der Fleisch-Authentifizierung
20. September 2016
Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung der Komponenten in Mischungen von Spezies, die ähnliche Proteine besitzen. Die Massenspektrometrie detektiert Peptide zur Identifizierung und liefert eine relative Quantifizierung durch Verhältnisse der Peakflächen. Als Werkzeugfutter zur Betrugserkennung kann die Methode 1 % Pferd im Rind nachweisen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Massenspektrometrie zur Mehrfachreaktionsüberwachung zu nutzen, um die in rohen Fleischmischungen vorhandenen Spezies zu identifizieren und zu quantifizieren, um sie als Werkzeug zur Aufdeckung von Lebensmittelbetrug zu verwenden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Lebensmittelintegrität zu beantworten, wie z. B. die Bestätigung der in Produkten wie Würstchen oder Burgern enthaltenen Spezies. Unser Ansatz basiert auf der Massenspektrometrie der Proteinkomponente.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles und quantitatives Ergebnis liefern kann. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir bemerkten, dass die gleichnamigen Proteine und verschiedene Spezies tatsächlich unterschiedlich genug sind, um eine Artbestimmung zu ermöglichen, aber ähnlich genug, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. Denaturieren Sie gereinigte Referenzmyoglobine thermisch, indem Sie die Probe in einem heißen Block 30 Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.
Die Probe wird ca. 15 Minuten lang abgekühlt, bis sie Raumtemperatur erreicht hat. Fügen Sie dann 30 Milligramm Harnstoff hinzu, um die Verdauung zu verbessern, und mischen Sie. Geben Sie der Probe eine Trypsinlösung in einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von eins zu 30 nach Gewicht.
Dann durch sanftes Vortexen mischen und über Nacht bei 37 Grad Celsius proteolysieren lassen. Entsalzen Sie anschließend die Probe nach der Proteolyse, indem Sie die Probe zunächst ein bis zwei Volumen zu Volumen mit Wasser verdünnen. Aktivieren Sie eine Polymer-Umkehrphasenpatrone, die mit 30 Milligramm Umkehrphasenmaterial gefüllt ist, indem Sie einen Milliliter Methanol hinzufügen.
Gleichen Sie dann die Kartusche aus, indem Sie einen Milliliter ein Prozent Ameisensäure hinzufügen. Laden Sie die Probe unter der Schwerkraft auf die Kartusche. Waschen Sie nun mit einem Milliliter fünfprozentigem Methanol, das ein Prozent Ameisensäure enthält.
Eluieren Sie die Peptide mit einem Milliliter Acetonitrilwasser in zwei Milliliter-Mikrozentrofugenröhrchen, die mit fünf Mikrolitern DMSO vorgefüllt sind. Entfernen Sie anschließend das Lösungsmittel unter Vakuum bei 50 Grad Celsius mit einem Zentrifugalverdampfer für 120 Minuten. Lösen Sie dann den Rückstand wieder in 250 Mikrolitern Acetonitrilwasser auf.
Übertragen Sie die Lösung in ein Autosampler-Fläschchen mit geringem Volumen. Suchen Sie die Myoglobinsequenzen für die verschiedenen Treffen in der UniProt-Datenbank. Geben Sie die Myoglobinsequenzen in das Zielfeld der Peptid- und Übergangsvorhersagesoftware ein.
Bewegen Sie den Mauszeiger bei Bedarf über ein Peptid, um seine Fragmentliste anzuzeigen. Nachdem Sie die im Textprotokoll beschriebenen Einstellungen eingegeben haben, klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Übergangsliste, um eine Tabelle mit den generierten MRM-Übergängen und -Parametern zu erstellen. Richten Sie ein Hochleistungs-Flüssigchromatographie- oder HPLC-System mit binärem Gradienten mit einem Autosampler und einer C18-Kernschalen-HPLC-Säule ein, die mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer verbunden ist, das im positiven Elektrospray-Modus mit MRM-Detektion betrieben wird.
Wählen Sie im Abschnitt "Parameter bearbeiten" der Software zur Datenerfassung der Flüssigchromotographie-Massenspektrometrie den Scantyp als MRM und die Polarität als positiv aus. Geben Sie die Werte Q1, Q3, Zeit, ID, DP und CE für die in der Tabelle erstellten Übergänge ein und speichern Sie die Erfassungsmethode. Nachdem Sie die Methodenparameter wie im Textprotokoll beschrieben eingerichtet haben, navigieren Sie zur Datenerfassungssoftware, klicken Sie auf Acquire und wählen Sie Equilibrate.
Wählen Sie im sich öffnenden Feld die gewünschte Erfassungsmethode aus, um die Äquilibrierung des Geräts zu starten. Legen Sie anschließend die Probengefäße in ein Gestell im Autosampler. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Neu, gefolgt von Akquise-Batch.
Geben Sie im Feld Probenname die Identität jeder zu analysierenden Probe ein. Im Textprotokoll finden Sie Einzelheiten zur Visualisierung der erfassten Daten. Verwende ein Fleisch, das zuvor eingefroren und dann zu einem Pulver gemahlen wurde.
Bereiten Sie eine Reihe von Fleischmischungen zu, indem Sie die entsprechenden Fleischmengen in 15-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen wiegen. Geben Sie vier Milliliter Extraktionspuffer zum Fleischpulver. Nach 30-sekündigem Vortexen auf einem Laborschüttler bei Raumtemperatur zwei Stunden lang mit 250 Zyklen pro Minute extrahieren.
Übertragen Sie zwei Milliliter des Extrakts in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 17.000 g. Übertragen Sie 200 Mikroliter Aliquots des Überstands in zwei Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Trocknen Sie die Proben mit einem Zentrifugalverdampfer, bevor Sie die Proteinkonzentration der Proben bestimmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Proteolyse von Fleischmischungen durchzuführen, lösen Sie den getrockneten Rückstand in einem Milliliter 25 Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung wieder auf.
Durch Vortexen gut mischen und wie zuvor Proteoloyse durchführen. Richten Sie dann das LCMS auf ähnliche Weise mit geplanter MRM ein, und führen Sie es aus. Zeigen Sie das vollständige Chromatogramm in der Datenanzeigesoftware an.
Zeigen Sie nacheinander die extrahierten Ionen für jeden Übergangssatz an. Vergewissern Sie sich visuell, dass jeder Cluster die erforderliche Anzahl von glockenförmigen Peaks zur erwarteten Retentionszeit enthält. Dadurch wird die Existenz des ausgewählten Peptids bestätigt.
Doppelklicken Sie anschließend in der Navigationsleiste auf Quantiation Wizard. Erstellen Sie im Fenster "Stichproben auswählen" einen Quantifizierungssatz, indem Sie eine einzelne Datendatei auswählen. Wählen Sie dann eine oder mehrere verfügbare Proben aus.
Wählen Sie Weiter aus, um die Auswahleinstellungen und das Abfragefeld anzuzeigen. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei, und wählen Sie Weiter aus, um Methode auswählen anzuzeigen. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Methode die Datei mit der Integrationsmethode aus, und wählen Sie schließlich Fertig stellen aus.
Speichern Sie die Ergebnistabelle, exportieren Sie sie als Textdatei und öffnen Sie sie in einer Tabelle, um die Daten zu überprüfen, wie im Textprotokoll beschrieben. Diese Abbildung zeigt die intensivsten MRM-Übergänge für Pferde, die aus einer Mischung von einem Gewichtsprozent mit Rindfleisch gewonnen wurden. Im Gegensatz dazu zeigt die rote Linie den Übergang vom Rind, wenn kein Pferd anwesend ist.
Dies ist ein Diagramm der gemessenen und der vorbereiteten Menge an Pferd in Rindfleisch, ausgedrückt als Verhältnis. Das Diagramm zeigt deutlich, wie die Methode für quantitative Messungen verwendet werden kann. Einmal gemeistert und bei Verwendung der Batch-Verarbeitung kann der Durchsatz bei dieser Methode bis zu 20 Proben pro 24 Stunden erreichen.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, ein geeignetes Protein für die Extraktionsanalyse auszuwählen. Myoglobin ist ein guter Kandidat für die Untersuchung von rotem Fleisch, da es reichlich vorhanden, wasserlöslich und hitzestabil ist. Dieses Verfahren kann auf weitere Arten ausgeweitet werden, die gleichzeitig identifiziert und quantifiziert werden sollen.
Die maximale Anzahl ist nur durch die Scangeschwindigkeit der Massenspektrometrie begrenzt. Diese Technik ebnet Forschern den Weg, Pepto-Fingerabdrücke in Bereichen wie dem Verbraucher- und Markenschutz einzusetzen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, das die mehrfache Reaktionsüberwachung mittels Massenspektrometrie nutzt, um Arten in rohen Fleischmischungen zu identifizieren und zu quantifizieren, was bei der Aufdeckung von Lebensmittelbetrug hilft. Die Methode kann bereits 1 % Pferdefleisch in Rindfleischprodukten nachweisen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Lebensmittelsicherheit
- Massenspektrometrie
- Proteinanaylse
Hintergrund
- Lebensmittelbetrug ist ein erhebliches Problem in der Lebensmittelindustrie.
- Die Identifizierung von Arten in Fleischprodukten ist entscheidend für die Verbrauchersicherheit.
- Die Massenspektrometrie ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse von Proteinen.
- Proteine verschiedener Arten können ähnlich sein, sind jedoch oft unterschiedlich genug, um identifizierbar zu sein.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zum Nachweis von Arten in Fleischmischungen.
- Verbesserung der Lebensmittelintegrität durch Bestätigung der Artenzugehörigkeit in verarbeiteten Fleischprodukten.
- Bereitstellung eines quantitativen Werkzeugs zum Nachweis von Lebensmittelbetrug.
Verwendete Methoden
- Thermische Denaturierung von Myoglobinen gefolgt von Proteolyse.
- Massenspektrometrie zur Peptididentifizierung und -quantifizierung.
- Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Probenanalyse.
- Datenanalyse mittels MRM-Übergängen zur Bestätigung des Vorhandenseins von Arten.
Hauptergebnisse
- Die Methode identifizierte erfolgreich Pferdefleisch in Rinderfleischmischungen.
- Quantitative Messungen wurden mit hoher Genauigkeit erreicht.
- Die Durchsatzkapazität kann bis zu 20 Proben in 24 Stunden betragen.
- Die visuelle Bestätigung des Vorhandenseins von Peptiden wurde gezeigt.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist wirksam zur Aufdeckung von Lebensmittelbetrug.
- Die Massenspektrometrie stellt ein schnelles und zuverlässiges Analyseverfahren bereit.
- Dieser Ansatz kann die Lebensmittelsicherheit und -integrität verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine schnelle, quantitative Artenidentifizierung in komplexen Fleischmischungen mittels MRM-Massenspektrometrie und unterstützt die Lebensmittelintegritätsprüfung in an biopharmazeutische Lieferketten angrenzenden Versorgungsketten. Durch den Nachweis von Artenverfälschungen bei 1 % w/w stellt sie ein skalierbares Werkzeug für die Verifizierung von Rohmaterialien und die Minderung von Betrugsrisiken dar. Der Ansatz nutzt entsprechende Peptide für die relative Quantifizierung, wodurch die Abhängigkeit von externen Standards verringert und die Robustheit des Assays in regulierten Testumgebungen verbessert wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Proteinhomologie und artenspezifischen Sequenzvarianten zur Zielstrukturdiskriminierung.
- Operationaler Wert: Nutzt endogene Proteine wie Myoglobin als intrinsische Marker und macht dadurch exogene Markierungen oder Standardsubstanzen überflüssig.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Die MRM-Detektion entsprechender Peptide ermöglicht die multiplexe Arterkennung in komplexen Matrizes.
- Operativer Wert: Peakflächenverhältnisse entsprechender Peptide ermöglichen die relative Quantifizierung ohne Kalibrierkurven.
- Wissenschaftlicher Wert: Die Methode unterstützt die Hochdurchsatzanalyse mit einer Durchsatzleistung von bis zu 20 Proben pro 24 Stunden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der proteinbedingten Variabilität zwischen Arten in Modellen zur Lebensmittelsicherheit.
- Operationaler Wert: Der Workflow zur Probenvorbereitung ist auf andere komplexe biologische Matrizes übertragbar, die eine Artdifferenzierung erfordern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in Workflows der Entdeckungsbiologie für die Authentifizierung von Rohmaterialien einfügen und ermöglicht eine Risikobewertung in frühen Entwicklungsstadien von Biologika sowie die Überwachung der Lieferkette.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich der Proteinreinheit und der Artzugehörigkeit bei der Beschaffung von Rohmaterialien.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse mittels MRM-Peakflächenverhältnissen für den Vergleichsanalysen.
- Analytik: Erzeugt übergangsspezifische Daten, die eine präzise Peakintegration und Quantifizierung ermöglichen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll kann in verschiedenen Laboren standardisiert werden, um eine konsistente Artnachweisung in globalen Liefernetzwerken sicherzustellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Artenzuordnung durch Peptid-spezifische Analyse.
- Operationaler Wert: Standardisierte Probenvorbereitung und LC-MS/MS-Arbeitsabläufe gewährleisten Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Bedienern und Standorten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht datengestützte Entscheidungen über die Annahme von Rohmaterialien, wodurch das Risiko von Verfälschungen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Strategien zur Qualifizierung von Lieferanten und Beschaffung von Rohmaterialien.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteomik, der LC-MS/MS-Methodenentwicklung und der Optimierung von MRM-Übergängen.
- Setzt den Zugang zu einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer und HPLC-Systemen mit zeitlich gesteuerter MRM-Funktion voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Probengewinnung, Verdauung und Entsalzung über Teamgrenzen hinweg.
- Die Anpassung an Nicht-Fleisch-Matrizes kann eine Neubewertung der entsprechenden Proteinwahl erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Empfindlichkeit der Methode hängt von der Häufigkeit und Nachweisbarkeit spezies-spezifischer Peptide ab.
