Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache Methode zur visuellen Detektion von Multinukleotid-Polymorphismen mit einer pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform zu kombinieren. Die DNA-Detektionsplattform befindet sich auf einer offenen Oberfläche und ist für biochemische Forscher einfach zu verwenden. Wir untersuchten ein einfaches Werkzeug, um wiederholt genetische Mutationen und genetische Krankheiten zu erkennen.

Es hat ein größeres Potenzial, uns zu helfen, zu verstehen, wie genetische Variation zu Krankheiten führt. Wir haben zwei neuartige und einfache Methoden kombiniert. Der Multinukleotid-Polymorphismus kann auf der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform mit bloßem Auge und ohne zusätzliches Instrument nachgewiesen werden.

Die Methode zum Nachweis von Multinukleotid-Polymorphismen wird von Tzu-Ming Wang, dem Postdoktorand in unserer Gruppe, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 100 mikromolare Lösung der Sonden-DNA vor, wie im Textprotokoll angegeben. Fügen Sie dann die Sonden-DNA zu einer Lösung von Goldnanopartikeln mit einem OD pro Milliliter hinzu.

Die Endkonzentration von SDS wird auf 0,01 % und die von PBS auf 0,01 molar erhöht. Lassen Sie die Lösung 20 Minuten lang inkubieren. Erhöhen Sie anschließend die Konzentration von Natriumchlorid auf 0,05 molaren Molekülen, indem Sie eine Lösung aus zwei molaren Natriumchlorid und 0,01 molaren PBS hinzufügen.

Halten Sie die SDS-Konzentration bei 0,01 % und lassen Sie die Lösung weitere 20 Minuten inkubieren. Erhöhen Sie die Konzentration von Natriumchlorid in Schritten von 0,1 molar in Abständen von 20 Minuten, bis eine Endkonzentration von einem molaren erreicht ist. Inkubieren Sie die Lösung bei 23 Grad Celsius über Nacht auf einem Rotator.

Nachdem die DNA-Proben und Goldnanopartikel konjugiert sind, zentrifugieren Sie die Lösung 30 Sekunden lang bei 7.000 g g. Entfernen Sie den Überstand. Bereiten Sie als Nächstes eine 25-nanomolare Gold-Nanopartikel-Sondenlösung vor, indem Sie das Pellet in entionisiertem Wasser resuspendieren.

Bereiten Sie Ziel-DNA-Proben vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie sechs Mikroliter Gold-Nanopartikel-Sondenlösung mit Natriumchlorid in jede DNA-Probe. Schütteln Sie jede Probenlösung mit einem Vortex-Mischer fünf Minuten lang bei 23 Grad Celsius.

Fügen Sie dann jeder DNA-Probenlösung sechs Mikroliter 400 millimolare Hydroxylamin und sechs Mikroliter 25,4 millimolare Chloraurinsäure hinzu. Legen Sie diese Proben beiseite, da sich die Färbung in der nächsten Stunde stetig ändert. die Größe, die formabhängigen optischen Eigenschaften des Nanopartikels, die Anzahl der typischen Fehlanpassungen in einem DNA-Fragment der Probe können mit dem Auge erkannt werden.

Um mit der Herstellung der Tröpfchenmanipulationsplattform zu beginnen, verwenden Sie eine computergesteuerte Maschine, die mit einem 0,5-Millimeter-Bohrer ausgestattet ist, um PMMA-basierte Masterformen mit Mikrostrukturen herzustellen. Verwenden Sie für den Bohrer eine Vorschubgeschwindigkeit von sieben Millimetern pro Sekunde und eine Drehzahl von 26.000 U/min und inspizieren Sie die Formen nach dem Bohren. Verwenden Sie ein Luftgebläse und entionisiertes Wasser, um die Oberfläche der Masterformen zu reinigen und PMMA-Schrott zu entfernen.

Bereiten Sie anschließend eine Mischung aus PDMS-Basis und Härter im Verhältnis 10 zu 10 vor. Entgasen Sie das Gemisch in einem Exsikkator, bis alle Luftblasen entfernt sind. Gießen Sie dann die PDMS-Mischung in die Masterform.

Drei Stunden bei 60 Grad Celsius backen, um die inversen Mikrostrukturen in den Luftkammern und Luftkanälen zu erhalten. Entfernen Sie nach dem Backen die PDMS-Schicht aus der Urform und stanzen Sie Löcher für die Luftansaugeinlässe. Verwenden Sie ein Sauerstoffplasmabehandlungssystem, um die PDMS-Membran und die PDMS-Schicht zu reinigen.

Nach der Behandlung verbinden Sie die PDMS-Membran und die PDMS-Schicht und stanzen dann Löcher in diese konjugierte Struktur. Als nächstes verbinden Sie das PDMS und das Glassubstrat mit einer Heizplatte bei 90 Grad Celsius für 10 Minuten miteinander. Sobald die Schichten miteinander verbunden sind, legen Sie die Verbundplatte mit der Membran nach oben in eine PDMS-Laserschneidmaschine.

Importieren Sie die DWG-Datei, um den superhydrophoben Bereich zu definieren, und beachten Sie, dass dieser direkt in die PDMS-Membran graviert wird. Reinigen Sie die neu gravierte superhydrophobe Oberfläche mit entionisiertem Wasser. Dadurch werden alle verkohlten Rückstände weggespült.

Nachdem die Oberfläche gereinigt wurde, schließen Sie den Luftansaugeinlass und die Vakuumpumpe über ein Magnetventil an. Schließen Sie dann das Magnetventil an einen Computer an, um es mit einem digitalen IO-USB-Modul zu steuern. Sobald die pneumatische Tröpfchenmanipulationsplattform eingerichtet ist, fügen Sie 10 Mikroliter 0,5 mikromolare Ziel-DNA auf den superhydrophoben Bereich hinzu.

Geben Sie als Nächstes 10 Mikroliter einer frisch hybridisierten 25-Nanomol-Gold-Nanopartikel-Sondenlösung neben den Ziel-DNA-Tropfen. Verwenden Sie ein einfaches Programm, um die Luftansaugung zur Plattform über ein Magnetventil zu steuern. Stellen Sie den Druck auf minus 80 Kilopascal und die Antriebsfrequenz auf fünf Hertz ein.

Sorgen Sie für einen Sog entlang der Vibrationswege des Tropfens, wodurch sie kollidieren und verschmelzen. Mischen Sie anschließend das koaleszierte Tröpfchen, indem Sie die Saugkraft so manipulieren, dass die Probe drei Minuten lang gerollt wird. Geben Sie zwei Mikroliter 400 Millimolare Hydroxylamine und zwei Mikroliter 25,4 Millimolare Chloraursäure in den superhydrophoben Bereich der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform.

Manipulieren Sie den Sog so, dass die Tröpfchen kollidieren und verschmelzen. Mischen Sie dann das zusammengeschmolzene Tröpfchen, indem Sie es eine Minute lang rollen. Beobachten Sie die Farbe des letzten Tröpfchens mit bloßem Auge.

In dieser Studie werden Multinukleotid-Polymorphismen kolometrisch mit Hilfe des DNA-Hybridisierungs-vermittelten Wachstums von Goldnanopartikel-Sonden detektiert. Dabei weisen die DNA-Proben unterschiedliche Affinitäten zur Sonden-DNA auf, was zu Unterschieden im Wachstum der Goldnanopartikel führt, was sich als Farbveränderung äußert. Die nicht übereinstimmende DNA-Probe mit drei Basenpaaren weist eine geringere Hybridisierung auf als die vollständig komplementäre DNA, was als auffällige Farbunterschiede gesehen werden kann, insbesondere bei höheren Konzentrationen.

Die nicht übereinstimmende DNA mit sechs Basen weist eine schwache Hybridisierungsaffinität zur Sonde auf, so dass die Wachstumsgröße der Goldnanopartikel gering war. Es hat sich gezeigt, dass diese kolometrische Analyse wiederholbar ist, wenn die Proben über eine pneumatische Saugplattform manipuliert werden, da die Ergebnisse der DNA-Fehlanpassung mit bloßem Auge leicht zu erkennen sind. Sobald das gesamte Verfahren gemeistert ist, dauert es weniger als fünf Minuten von der Zugabe der Probe und des Reagenzes bis zum Ergebnis, was viel schneller ist als bei der herkömmlichen Methode.

Die Gesamtmenge in jedem Arbeitsgang beträgt nur 10 Mikroliter, was deutlich weniger ist als in einer großen Anlage erforderlich. Nach diesem Verfahren wird einmal bestätigt, dass die Sequenzvariation des Raums des DNA-Fragments für eine bestimmte Krankheit verantwortlich ist. Das speziell entwickelte Produkt kann verwendet werden, um eine Reihe von Fehlanpassungen der Proben-DNA zu erfassen.

Die pneumatische Tröpfchenmanipulationsplattform ist biokompatibler als andere Methoden wie optische Gewichtung, Farbstoff-Elektrofluoreszenz, Elektrogewichtung und Shoomoo-Kapillarbetätigung. Die vorgeschlagene Methode zum Nachweis von Multinukleotid-Polymorphismen wurde unter einer pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform durchgeführt, was bedeutet, dass die Proben und Reagenzien direkt geladen und mit der Pipette gesammelt werden können. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik ein hohes Potenzial für DNA-Screenings und andere chemische und biomatische Anwendungen.