Name: Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie die visuelle Erkennung von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einer pneumatischen Tropfenmanipulationsplattform. Diese einfache Methode ermöglicht die Detektion genetischer Mutationen ohne aufwendige Geräte.

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Das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan hat diese Forschung im Rahmen der Verträge MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3 finanziell unterstützt.

1. Verfahren zum Erkennen von MNP Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, das MNP basierend auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikeln zu erkennen. <ol><li> Bereiten Sie die DNA-Sonde (5&#39;-Thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) Lösung bei einer Konzentration von 100 uM. </li><li> Bereiten Sie die Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Partikel. 21 Hinweis: Die Lautstärke hier hängt von der Anforderung der Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Teilchen verwendet. Es ist daher abhängig von der Anzahl von Experimenten durchgeführt werden. Wir bereiten typischerweise überschüssige AuNP Meßteilchen als Ersatzteile. Das Volumen in diesen Schritten verwendet ist einstellbar und flexibel. <ol><li> Hinzufügen Sonden-DNA (100 &amp; mgr; M, hergestellt in Schritt 1,1) zu einer Lösung von Gold-Nanopartikeln (13 nm, 17 nm) bei einer Konzentration von 1 OD / ml. </li><li> Bringen die Endkonzentrationen von Natriumdodecylsulfat (NaC 12 H 25 SO 4, SDS) und Phosphatpuffer (PBS) mit 0,01% und 0,01 M, respectively. </li><li> Nach 20 min bringt die Konzentration von Natriumchlorid (NaCl) und 0,05 M mit einer Lösung von NaCl (2 M) und PBS (0,01 M), während SDS bei 0,01% und Inkubation für 20 min beibehalten wird. </li><li> Erhöhung der NaCl-Konzentration in Schritten von 0,1 M bis zu einer Endkonzentration von 1 M über 20 min Intervallen. </li><li> Inkubieren über Nacht mit bei 23 ° C auf einem Vortex-Mixer schütteln. Die Schüttelgeschwindigkeit wirkt sich nicht auf das Experiment, solange die DNA-Proben und AuNP Sonden hybridisiert werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Gold-Nanopartikel bei 7.000 × g für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. </li></ol></li><li> In AuNP Meßteilchen in entsalztes Wasser (VE-Wasser) bei einer Konzentration von 25 nM (AuNP Sondenlösung). </li><li> Bereiten Ziel - DNA - Proben (vollständig komplementär: 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 &#39;, drei Basenpaar - mismatched: 5&#39;-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3&#39;, sechs Basenpaar mismatched: 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;) in Konzentrationenvon 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectively. </li><li> In AuNP Sondenlösung (6 &amp; mgr; l, 25 nM) in die DNA-Proben (350 ul) mit NaCl (14 &amp; mgr; M). </li><li> Schütteln der Mischung von DNA-Proben und AuNP Sonden mit einem Vortex-Mischer bei 23 ° C für 5 min für die DNA-Hybridisierung. </li><li> Für AuNP Wachstum, fügen NH 2 OH (6 ul, 400 mM) und HAuCl 4 (6 &amp; mgr; l, 25,4 mM) zu der Lösung (die Mischung von DNA - Proben und AuNP Sonden). Das Wachstum von AuNP dauert ca. 30 sec für die Fertigstellung. Die stetige Veränderung der Färbung unterhält mehr als 1 Stunde. ACHTUNG: Der Hautkontakt mit HAuCl 4 könnte schwere toxische Wirkungen hervorrufen. Bitte beachten Sie die geltenden Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Bitte tragen Sie Handschuhe und ein Abzug verwenden bei der Verwendung von HAuCl 4. </li></ol> 2. Herstellung eines pneumatischen Droplet Manipulation Platform Hinweis: Das PDMS-basierte Tröpfchenmanipulationsplattform besteht aus zwei Komponenten: a PDMS-Membran (100 &amp; mgr; m) mit einer superhydrophoben Oberfläche und einer Luftkanalschicht (5 mm). Ohne einen MEMS-Prozess wurden die gemeinsamen Bearbeitungsverfahren verwendet, um diese Vorrichtung herzustellen, die Computer-numerischen Steuerung (CNC) Mikrobearbeitung zur Herstellung einer Form, PDMS Gießen und Replikation für das Rapid Prototyping von mikrofluidischen Komponenten und Laser-Mikrobearbeitung für die Herstellung umfasst von ein super-hydrophobe Oberfläche (siehe Abbildung 3). <ol><li> Verwenden Sie die CNC - Maschine mit einem Bohrer (0,5 mm) ausgestattet PMMA-Basis - Master zur Herstellung von Formen (siehe Abbildung 3) mit Mikrostrukturen. Verwenden Sie eine Vorschubgeschwindigkeit des Bohrers 7 mm / s und einer Drehrate 26.000 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie ein Luftgebläse und DI-Wasser die PMMA Schrott zu entfernen und die Oberfläche der Masterform zu reinigen. </li><li> Bereiten eines Gemisches aus dem PDMS Basis und dem Härter in einem Verhältnis 10: 1. Entgasen das Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> Gießen Sie die PDMS in the Masterform und backen Sie die PDMS für 3 Stunden bei 60 ° C im Ofen der inversen Mikrostrukturen der Luftkammern (PDMS-Membran) und Luftkanäle (PDMS-Schicht) zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Schicht aus der Urform (von Hand). Stanzlöcher auf der PDMS-Schicht für Luft-Ansaugöffnungen. </li><li> Setzen Sie die PDMS-Membran, die PDMS-Schicht und das Glassubstrat in die Kammer des Sauerstoff-Plasma-Behandlungssystem. Nach Sauerstoff-Plasmabehandlung, binden die PDMS-Membran, die PDMS-Schicht und dem Glassubstrat zusammen auf einer Heizplatte (90 ° C) für 10 min. </li><li> Setzen Sie den Composite-Chip in den Laser-Schneidemaschine (PDMS Membranseite nach oben). Importieren Sie die DWG-Datei die superhydrophoben Bereich (15 mm × 12 mm) zu definieren. Siehe Abbildung 3. Direkt gravieren die PDMS - Membran mit einem CO 2 -Laser Maschine die superhydrophoben Bereich auf der PDMS - Membran (Leistung 12 W, Scangeschwindigkeit 106,68 mm / sec) zu erstellen. </li><li> Reinigen Sie die superhydrophoben Oberfläche mit DI-Wasser zu waschendie carbonisierten Rückstände auf der Oberfläche entfernt. </li><li> Schließen Sie den Luft Saugeinlass und Vakuumpumpe durch ein Magnetventil (siehe Abbildung 4). Verbinden des Magnetventils mit dem Computer und die Steuerung mit einer digitalen I / O USB-Modul. </li></ol> 3. Betrieb zum Nachweis von MNP auf der Pneumatik-Plattform Hinweis: In diesem Abschnitt wird die Operation beschreibt colorimetrisch und schnell die MNP an der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform (siehe Abbildung 5) zu identifizieren. Alle Schritte erfolgen bei 23 ° C (Umgebungstemperatur) und die relative Luftfeuchtigkeit 85%. <ol><li> Legen Sie die Ziel-DNA-Probe Tröpfchen (10 &amp; mgr; l, 0,5 &amp; mgr; M) auf der superhydrophoben Bereich der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform. </li><li> Legen Sie die AuNP Sonde Tröpfchen (10 &amp; mgr; l, 25 nM) auf der superhydrophoben Bereich der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform. </li><li> Steuern die Luftansaugung der Auslenkung der PDMS-Membran mit einem Magnetventil und einem Si zu bewirkenmple Programm (zB Labview). Luftansaugung in jeder Luftkammer bereitzustellen, entlang der Migrationspfad der Tröpfchen (die Ziel-DNA und Sonden AuNP respectively) auf dem PDMS-Membran, so daß die Tröpfchen miteinander kollidieren und sich vereinigen. Verwenden Sie einen Arbeitsdruck der Vakuumpumpe von -80 kPa (Überdruck). <ol><li> Alternativ dazu steuern die Luftansaugung manuell solange die Tröpfchen vollständig vermischt ist. Mit der Hand, verbinden oder die Vakuumpumpe und Einlässen Luftkammer mit Rohren in den frühen Stadien der Prüfung trennen. </li></ol></li><li> Kontrollieren Sie die Luftansaugung der verschmolzenen Tröpfchen vorwärts und rückwärts zu rollen, die Mischeffizienz für 3 Minuten mit dem Steuerungssystem des Magnetventils zu verbessern. Die Ziel-DNA und AuNP Sonden werden gut gemischt und innerhalb von 3 min hybridisiert. Verwenden einer Antriebsfrequenz und ein Arbeitsdruck von 5 Hz und -80 kPa (Überdruck), respectively. </li><li> Legen Sie ein Tröpfchen enthält , NH 2 OH (2 ul, 400 mM) und HAuCl4 (2 &amp; mgr; l, 25,4 mM) auf der superhydrophoben Bereich des pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform. </li><li> Kontrollieren Sie die Luftansaugung (-80 kPa Überdruck) die Tröpfchen miteinander und coalesce kollidieren zu lassen. Dann steuern die Luftansaugung (5 Hz und -80 kPa Überdruck) die koaleszierten Tröpfchen Rolle vorwärts und rückwärts zu lassen, die Mischeffizienz für 1 min zu erhöhen. </li><li> Messen und die Farbe des koaleszierten Tröpfchen mit dem bloßen Auge aufzunehmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll zu erfassen ein einfaches kolorimetrisches Verfahren kann MNP bei Konzentrationen von 0,11 bis 0,50 &amp; mgr; M in Mikrozentrifugenröhrchen Bereich realisiert werden. Darüber hinaus ist die vorgeschlagen MNP Detektionsverfahren auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform durchgeführt, die für die DNA-Screening und andere biomedizinische Anwendungen ein hohes Potential aufweist. In der Praxis hängt der detektierbare Bereich der Proben-DNA-Konzentration auf die Mischeffizienz der Betriebss...

Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), die eine einzelne Basenpaarunterschied in einer DNA-Sequenz ist, ist eine der häufigsten genetischen Veränderungen. Aktuelle Studien berichten , dass SNPs mit Erkrankungsrisiko assoziiert sind, Wirksamkeit von Medikamenten und Nebenwirkungen von Individuen durch die Genfunktion zu beeinflussen. 1,2 Jüngste Studien zeigten auch , dass zwei- oder mehrPunktMutationen (Multi-nucleotide polymorphism) verursachen bestimmte Krankheiten und individuelle Unterschiede in den Auswirkungen der Krankheit. 3,4 der Nachweis von Nukleotid - Polymorphismus ist in prescreening Krankheit daher unerlässlich. Einfache und effiziente Verfahren zum schnellen Nachweis von sequenzspezifischen Oligonucleotide wurden in den letzten zwei Jahrzehnten hoch entwickelt. 1,5 Aktuelle Ansätze DNA Mutationen umfassen typischerweise Verfahren , einschließlich Sonde Immobilisierung, Fluoreszenzmarkierung, Gelelektrophorese, usw., zu identifizieren 6,7 aber diese Methoden erfordern in der Regel einen langen analytischen Prozess, Expensive Ausrüstung, gut ausgebildete Techniker und signifikanten Verbrauch von Proben und Reagenzien. Ein Nanopartikel mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist ein ideales Material als hochempfindliche und billige Detektionsplattform für spezifische Biomarker. Gold - Nanopartikel (AuNP) zur DNA - Detektion weit verbreitet wegen ihrer großen Fähigkeit , mit Oligonukleotid - Sonden modifiziert werden. 8-10 SNP Detektionstechniken wurden auch AuNP entwickelt worden war . 11-13 In dieser Arbeit wurde ein neues farbmetrischen Ansatz der zu erkennen Multi-Nukleotid - Polymorphismus (MNP) , durch DNA - Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden. 14 Diese einfache und schnelle Sondieren Verfahren liegt die Theorie zugrunde , daß vielfältige Längen von Einzelstrang - DNA (ssDNA) oder Doppelstrang - DNA (dsDNA) , konjugiert mit AUNP das Wachstum Größe und Form des AuNP beeinflussen (siehe Abbildung 1). 15 diese Methode der DNA - Nachweisverfügt über einen kleinen Verbrauch von Reagenzien eine kleine Testdauer (wenige Minuten) und ein einfaches Verfahren ohne thermische Kontrolle, die prospektiv anwendbar für die klinische Diagnostik und häusliche medizinische Untersuchung ist. Mehrere Mikrofluidik - Systeme , die die DNA - Sequenz zu detektieren , wurden entwickelt; 16 Diese mikrofluidischen Systemen, von traditionellen experimentelle Protokolle entwickelt, weniger Stücke von Großgeräten und vereinfacht die experimentellen Protokolle erforderlich , um die Empfindlichkeit, die Nachweisgrenze und Spezifität der DNA zu verbessern Biosensor. DNA Detektionsmethoden in der mikrofluidischen Systeme noch erfordern jedoch Instrumente einem nachfolgenden Prozess , wie beispielsweise einer PCR (Polymerasekettenreaktion) Maschine zur Signalverstärkung und einem Fluoreszenzlesegerät für eine einzige Auslesung des heterogenen SNP zu identifizieren. 17,18 eine einfache Entwicklung Plattform ohne die nachfolgende Verarbeitung zu multi-nucleotide polymorphism ausgelesen direkt die Ergebnissesehr wünschenswert ist. Im Vergleich zu gut genutzt, herkömmlichen, geschlossenen mikrofluidischen Systemen, die offene Oberfläche Mikrofluidiksystemen verheißungs mehrere Vorteile, wie zum Beispiel einem klaren optischen Weg, eine einfache Möglichkeit, den Zugriff auf die Probe, eine direkte Umwelt Zugänglichkeit und nicht leicht gebildet Kavitation oder Grenzflächen Behinderung bieten in der Kanal. 19 Unsere bisherigen Arbeit führte eine einfache pneumatische Plattform für Open-Oberfläche Tröpfchenmanipulation (siehe Abbildung 2). 20 Auf dieser Plattform Tröpfchen können gleichzeitig transportiert und manipuliert werden , ohne Einmischung von einer Antriebsenergie eine Saugkraft verwendet, die eine hat ein großes Potenzial in der biologischen und chemischen Anwendungen. Diese pneumatische Plattform wurde so die Manipulation von DNA-Proben für MNP Detektion in Kombination mit dem kolorimetrischen Ansatz unter Verwendung des Konzepts der DNA-Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden auszuführen verwendet. Das Protokoll in diesem Papier beschreibteine einfache visuelle Erkennung von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche. Diese Arbeit bestätigt, dass die multi-Nukleotid-Polymorphismus mit dem bloßen Auge nachweisbar ist; die vorgeschlagene pneumatische Plattform für biologische und chemische Anwendungen geeignet.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Tischgravierer</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>Laserschneidmaschine</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffplasmabehandlungssystem</td><td>Femto Science Inc. Korea</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>Magnetventil</td><td></td><td></td><td>hausgemachte</td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP-Lösung</td><td>TAN Bead Inc., Taiwan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (mit 5'-Ende markiertem Thiol)</td><td>MDBio, Inc., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>UniRegion&nbsp; Biotechnologie,. Taiwan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>J. T. Baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylaminlösung (NH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Chloraurensäure (HAuCl4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Digisystem Laborinstrumente Inc.</td><td>VM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

der visual kolorimetrischen nachweis von multi-nukleotid-polymorphismen auf einem pneumatischen droplet manipulation platform

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismus (MNP) zu erfassen wurde auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche ausgeführt. Dieser Ansatz zur farbmetrischen DNA-Nachweis auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikel-Sonden (AuNP Sonden) basiert. Die Wachstums Größe und Konfiguration des AuNP werden durch die Anzahl von DNA-Proben mit den Sonden hybridisierten dominiert. Auf der Grundlage der spezifischen größen- und formabhängigen optischen Eigenschaften der Nanopartikel, die Anzahl von Fehlpaarungen in einer Proben-DNA-Fragment an die Sonden können unterschieden werden. Die Versuche wurden über jeweils Tröpfchen durchgeführt, enthaltend Reagenzien und DNA-Proben und wurden transportiert und an der pneumatischen Plattform mit dem gesteuerten pneumatischen Ansaugen des flexiblen PDMS-basierten superhydrophoben Membran gemischt. Droplets können gleichzeitig und präzise auf eine offene Fläche an der vorgeschlagenen pneumatischen Plattform geliefert werden, die ohne Neben eff hoch biokompatibelect von DNA-Proben in den Tröpfchen. Die Kombination der beiden vorgeschlagenen Verfahren kann das multi-Nukleotid-Polymorphismus auf den Blick auf den pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform detektiert werden; kein zusätzliches Gerät erforderlich ist. Das Verfahren von der Installation der Tröpfchen auf der Plattform zum Endergebnis in weniger als 5 min, viel weniger als mit bestehenden Methoden. Darüber hinaus erfordert diese kombinierte MNP Detektionsansatz ein Probenvolumen von nur 10 &amp; mgr; l in jede Operation, die bemerkenswert geringer ist als die eines Makrosystem.

unter Verwendung eines einfachen und neuartigen Nachweismethode durch die DNA-Hybridisierung vermittelte Wachstum der AuNP Sonden in dieser Arbeit wurden drei DNA-Proben getestet. Die Sequenzen der Sonden-DNA und DNA-Proben von drei Arten, nämlich, CDNA, TMDNA (drei Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) und SixMDNA (sechs Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) aufgelistet sind in Protokoll Schritt 1 (völlig komplementäre DNA-Sonde). die Fehlpaarungen an die Sonde der hier getesteten DNA - Pro...

Diese Arbeit stellt eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform zu erfassen. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird das gesamte Experiment, einschließlich Tropfenmanipulation und zum Nachweis von Mehr nucleotide polymorphisms, kann in der Nähe von 23 ° C ohne Zuhilfenahme moderner Instrumente durchgeführt werden.

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache Methode zur visuellen Detektion von Multinukleotid-Polymorphismen mit einer pneumatischen Tropfenmanipulationsplattform zu kombinieren. Die DNA-Detektionsplattform befindet sich auf einer offenen Oberfläche und ist für biochemische Forscher einfach anzuwenden. Wir haben ein einfaches Werkzeug untersucht, um genetische Mutationen und genetische Erkrankungen wiederholt nachweisen zu können.Es hat ein größeres Potenzial, uns zu helfen, zu verstehen, wie genetische Variationen zu Krankheiten führen. Wir haben zwei neuartige und einfache Methoden kombiniert. Die Multi-Nukleotid-Polymorphismen können auf der pneumatischen Tropfenmanipulationsplattform mit bloßem Auge und ohne zusätzliche Instrumente nachgewiesen werden.Die Methode zum Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen wird von Tzu-Ming Wang, dem Postdoktorand in unserer Gruppe, demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine 100 µM Lösung der Sonden-DNA gemäß der schriftlichen Anleitung herstellen. Anschließend geben Sie die Sonden-DNA zu einer Lösung von Goldnanopartikeln mit einer OD pro Milliliter.Die endgültige Konzentration von SDS auf 0,01 % un

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Droplet-based mikrofluidischen Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für einen hohen Durchsatz Experimente, da sie in der Lage, Picoliter, Selbst-compartmentalized Schiffe kostengünstig erzeugen bei kHz Preise sind. Durch die Integration mit schnellen, empfindlichen und hoch aufgelöste Fluoreszenz-spektroskopischen Methoden kann die große Mengen von Informationen in diesen Systemen erzeugt effizient extrahiert werden können, genutzt und verwertet werden.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Dieses Video zeigt die Rolle der digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion bei der Identifizierung von Indel-Mutationen in einer DNA-Probe. Die hohe Präzision und Empfindlichkeit der ddPCR ermöglicht einen genauen und konsistenten Nachweis seltener Mutationen, die in einer Probe vorhanden sind, selbst bei geringen Konzentrationen. Es kann Indel-Mutationen in verschiedenen Regionen des Genoms identifizieren und quantifizieren und liefert wertvolle Einblicke in die Mechanismen der Mutation und...

Digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von Indel-Mutationen in Zielgenen

Dieses Video demonstriert die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktionstechnik zur gleichzeitigen Quantifizierung von methylierten DNA-Regionen in verschiedenen Populationen weißer Blutkörperchen als frühen Biomarker für die klinische Diagnose und Prognose.

Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Dieses Video demonstriert die Nützlichkeit der digitalen PCR in einem Chip-in-a-Tube-Format für den Nachweis von Einzelnukleotidvariationen in DNA-Proben. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in Kammern aufgeteilt, die als unabhängige PCR-Reaktionen fungieren, und die Detektion von Fluoreszenzsignalen von den amplifizierten Zielen in den Kammern wird verwendet, um die Häufigkeit des varianten Allels in der Probe zu berechnen.

Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

Mehrfarbige Fluoreszenzdetektion in der Tröpfchenmikrofluidik beinhaltet typischerweise sperrige und komplexe Epifluoreszenzmikroskop-basierte Detektionssysteme. Hier beschreiben wir ein kompaktes und modulares mehrfarbiges Detektionsschema, das ein Array von optischen Fasern verwendet, um mehrfarbige Daten, die von einem einzigen Photodetektor gesammelt wurden, zeitlich zu kodieren.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer kleinen, Ready-to-Use Kassette, die für die visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Einzeltest können, die einfach angewendet werden zu bedienen ist. Bei diesem Ansatz wurde ein Kapillar Array für multiplex und hocheffiziente Nachweis von GVO Ziele verwendet.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Dieses Protokoll bietet die Schritte von der DNA-Extraktion bis zum Versuchsaufbau für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), einschließlich der Analyse zur Identifizierung und Quantifizierung von nicht-homologen End-Joining-Ereignissen (NHEJ) an Zielorten nach gRNA-induzierter Cas9-Spaltung und DNA-Reparatur. Andere Anwendungen dieser Methode umfassen Anwendungen wie den Polymorphismus-Nachweis und die Verifizierung von Gen-Editing-Varianten.

Digital-Droplet PCR zum Nachweis von Indel-Mutationen in gentechnisch veränderten Anopheline-Mückenpopulationen

Erfahren Sie die visuelle Erkennung von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einer pneumatischen Tropfenmanipulationsplattform. Diese einfache Methode ermöglicht die Detektion genetischer Mutationen ohne aufwendige Geräte.

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

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