Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, den evolutionären Weg der Antibiotikaresistenz mithilfe eines Morbidostaten zu charakterisieren, der das bakterielle Wachstum kontinuierlich überwacht und die Antibiotikakonzentration dynamisch anpasst, während die Bakterien Resistenzen gegen das Medikament entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass der Aufbau aus kostengünstigen, leicht verfügbaren elektronischen Komponenten besteht und problemlos für spezifische Zwecke umkonfiguriert werden kann. Die Durchführung der Verfahren wird Po Cheng Liu und Yi Tai Lee demonstrieren, beide sind Doktoranden in meinem Labor.

Um den Morbidostaten zusammenzubauen, stanzen Sie zunächst mit einer 18-Gauge-Nadel drei Löcher in den Verschluss des Kulturfläschchens. Schneiden Sie drei Stücke Polyethylen-Schlauch mit einer Länge von etwa sieben Zentimetern zu und führen Sie sie in die Löcher im Verschluss ein. Wickeln Sie Klebeband um den Rand des Verschlusses, um eine Form für die Polydimethylsiloxan- (PDMS-)Mischung zu bilden.

Fügen Sie dann fünf Gramm Komponente A und 0,5 Gramm Komponente B des PDMS in einen 150-Milliliter-Kunststoffbehälter hinzu und rühren Sie die Mischung manuell mit einem Zahnstocher um. Füllen Sie die Mischung in eine 10-Milliliter-Spritze. Injizieren Sie dann mit der Spritze die PDMS-Mischung auf die Kappe.

Den gesamten Deckel acht Stunden lang bei 70 Grad Celsius aushärten, um das PDMS zu vernetzen. Anschließend die LED-Anode mit dem 24-Adern-Draht und die LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mithilfe eines Lötkolbens verlöten. Danach einen 680-Ohm-Kohlewiderstand mit einem 24-Adern-Draht verlöten.

Verwenden Sie Isolierband, um die Drahtverbindung zu isolieren. Löten Sie den Kollektor des Photodetektors mit dem Draht der Stärke 24 und den Emitter des Photodetektors mit einem Kohleschichtwiderstand von 100 Ohm. Isolieren Sie anschließend die Drahtverbindung mit Isolierband.

Platzieren Sie die Leuchtdiode in der Kulturgefäßhalterung. Schließen Sie die Leuchtdiode gemäß des hier gezeigten Schaltplans an und verwenden Sie eine 5-Volt-Stromversorgung, um sie zu betreiben. Stellen Sie sicher, dass die LED funktioniert, indem Sie eine digitale Kamera verwenden, die Infrarotlicht (IR) detektieren kann. Platzieren Sie nun den Lichtdetektor in der Kulturgefäßhalterung.

Danach das Diagramm befolgen, den Fotodetektor anschließen und ihn mit einer 5-Volt-Stromversorgung versorgen. Das Kabel an beiden Seiten der Fotodetektorwiderstände anschließen, um die Spannung über die elektronische Steuerplatine zu messen. Einen Magneten auf die Welle des Kühlventilators kleben, der als magnetische Rührvorrichtung dient.

Da die magnetische Rührvorrichtung aus dem Magneten und dem Kühllüfter besteht, ist es entscheidend, das Fach des Lüfters mit der Kulturflasche auszurichten. Auch der Abstand zwischen der Kulturflasche und dem Magneten ist sehr kritisch, um einen stabilen Betrieb sicherzustellen. Verbinden Sie jedes Stück Polyethylen-Schlauch der Kulturflasche mit dem entsprechenden Stück Silikon-Schlauch für die Mikropumpen, Medium-Flaschen und Abfallflasche.

Schalten Sie die Pumpe eine Stunde lang ein und messen Sie das gesamte Volumen, das aus der Medium-Flasche in das Kulturfläschchen gepumpt wird, um die Pumpgeschwindigkeit zu bestimmen. Die typische Fördergeschwindigkeit sollte etwa vier Milliliter pro Stunde betragen, was einer Verdünnungsrate von D gleich 0,33 pro Stunde bei einem Arbeitsvolumen von 12 Milliliter im Kulturfläschchen entspricht. Sobald der Aufbau abgeschlossen ist, stellen Sie die gesamte Apparatur in einen mittelgroßen Schüttelinkubator.

Um den Morbidostaten vorab zu testen, stellen Sie die Versorgungsspannung des Lüfters auf fünf Volt ein, um den Motor zu starten und den magnetischen Rührstab zu testen. Nachdem eine Reihe von E.-coli-Proben vorbereitet und eine Kalibrierungskurve gemäß dem Textprotokoll erstellt wurde, bereiten Sie die Kulturflasche mit drei sieben Zentimeter langen Stücken ultrachemikalienbeständigem Tygon-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1/32 Zoll und einem Außendurchmesser von 3/32 Zoll für die Zuleitungen zur Geräteherstellung vor. Bereiten Sie M9-Minimalmedium mit 0,2 % Glukose sowie M9, das den Wirkstoff Trimethoprim oder TMP enthält, vor.

Dann sterilisieren Sie das Medium, die Mediumflasche, die Medikamentenmediumflasche, die Abfallflasche und das Kulturgefäß im Autoklaven bei 121 Grad Celsius. Am ersten Tag des Experiments tauen Sie einen Milliliter gefrorener wildtypischer E-coli-MG1655-Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf und überführen 120 Mikroliter der Zellen in ein Kulturgefäß, das etwa 12 Milliliter M9-Wachstumsmedium enthält. Schalten Sie den Schüttelinkubator ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein, ohne zu schütteln.

Starten Sie den Morbidostat-Betrieb, indem Sie die Mikropumpe, die magnetische Rührvorrichtung und die optische Dichtemessung einschalten. Nach etwa 23 Stunden schalten Sie die Mikropumpe aus, indem Sie die Versorgungsspannung abstellen, und nehmen Sie das Kulturfläschchen heraus. Geben Sie 15 % Glycerin in das Kulturfläschchen und frieren Sie die Proben zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein.

Es ist ebenfalls wichtig, zu Beginn jedes dieser Experimente auf eine neue Kulturschale umzusteigen, um Biotinbildung zu vermeiden. Andernfalls kann die Biotinbildung innerhalb von zwei oder drei Tagen auftreten. Nach dem Auftauen der täglich eingefrorenen Probe bei Raumtemperatur für fünf Minuten eine neue Teströhre mit frischem M9-Medium beimpfen.

Platzieren Sie die Probe über Nacht in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag verdünnen Sie die mikrobielle Probe mit M9-Medium um den Faktor zehn und geben sie in das mikrofluidische Gerät ein, indem Sie den Behälter mit der mikrobiellen Probe mit einem Druck von fünf PSI beaufschlagen. Anschließend geben Sie das TMP-haltige Medium in den Chip, indem Sie den Behälter mit M9-Medium und TMP mit einem Druck von fünf PSI beaufschlagen.

Führen Sie das Mischen von Mikrobe und Wirkstoff durch Betätigung des mikromechanischen Ventils zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 Minuten durch. Platzieren Sie abschließend den mikrofluidischen Chip in der Mikroskop-Inkubationskammer, die auf dem inversen Mikroskop montiert ist. Erwerben Sie mit einer CCD-Kamera stündlich über einen Zeitraum von acht Stunden Zellbilder in der Wachstumskammer.

Berechnen Sie die Zellanzahldaten gemäß dem Textprotokoll. Die üblichen Morbidostat-Operationen, einschließlich experimentelle Evolution, Antibiotikaresistenztest und Überprüfung der Zellmorphologie, wurden anhand einer mit dem Antibiotikum TMP behandelten E-coli-MG1655-Kultur ungültig gemacht, die eine charakteristische stufenweise Zunahme der Arzneimittelresistenz mit Mutationen in der Nähe des Dihydrofolatreduktase- oder DHFR-Gens aufweist. Täglich wird erwartet, dass sich das Mikrobenwachstum über die voreingestellte optische Dichteschwelle hinaus entwickelt und somit die Arzneimittelzufuhr auslöst, wie hier gezeigt.

Es wird erwartet, dass die Medikamenteninjektion das Wachstum hemmt und infolgedessen die optische Dichte verringert. Diese Darstellung zeigt den zeitlichen Anstieg der Antibiotikaresistenz in einem Experiment zur Bestimmung der IC50. Die Medikamentenresistenz stieg innerhalb von etwa 12 Tagen um etwa das 1500-Fache auf 1.000 Mikrogramm pro Milliliter an.

Im Einklang mit früheren Befunden. Die DHFR-Punktmutationen im letzten Tag-Mutanten wurden durch Sanger-Sequenzierung gemessen und sind in dieser Tabelle aufgeführt. Der Erwerb von Arzneimittelresistenz durch mehrere Mutationen belegt die Nützlichkeit des Morbidostats.

Da die Selektion auf Agarplatten mit Wirkstoff in der Regel nur eine einzige Mutation bewirkt, zeigt diese Abbildung die Wachstumskurven auf dem Chip bei verschiedenen Konzentrationen von TMP. Die Mutantenproben weisen einen signifikanten Anstieg der Antibiotikaresistenz auf.

Nach seiner Entwicklung ebnete dieses Verfahren den Forschern den Weg, die Position der Antibiotikaresistenz in einer realen Kontrolllaborumgebung zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können weitere Messungen wie mikrofluidische Einzelzellmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Morphologie aufgrund der Exposition gegenüber Antibiotika weiterhin verändert wird. Sobald die Handhabung beherrscht ist, kann dieses Gerät leicht für alle Experimente mit Bakterienkulturen umkonfiguriert werden, wie beispielsweise den Anbau einer Bakterienart oder die Erhöhung des Kostenresistenzniveaus eines Bakterienstamms.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Erwerb von Antibiotikaresistenz in einem realen, kontrollierten adaptiven Labor-Experiment zur Evolution untersucht. Vergessen Sie nicht, die resistenten Bakterien gemäß den Biosicherheitsregeln für mikrobiologische Arbeitsverfahren zu handhaben. Für ein Experiment, das die Grundausbildung von Bakterien beinhaltet, kann eine besondere Genehmigung erforderlich sein.