Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den evolutionären Weg der Antibiotikaresistenz mit Hilfe eines Morbidostat zu charakterisieren, der das Bakterienwachstum kontinuierlich überwacht und die Antibiotikakonzentration dynamisch anpasst, wenn Bakterien Arzneimittelresistenzen erwerben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Aufbau aus kostengünstigen, leicht verfügbaren elektronischen Komponenten besteht und für bestimmte Zwecke leicht neu konfiguriert werden kann. Po Cheng Liu und Yi Tai Lee, beide Doktoranden meines Labors, werden die Verfahren vorführen.

Um den Morbidosat zusammenzubauen, stanzen Sie zunächst mit einer 18-Gauge-Nadel drei Löcher in die Kappe des Kulturfläschchens. Schneiden Sie drei etwa sieben Zentimeter lange Stücke Polyethylenschlauch ab und stecken Sie sie in die Löcher in der Kappe. Wickeln Sie den Rand der Kappe mit Klebeband um, um ihn als Abguss für die Mischung aus Polydimethylsiloxan oder PDMS zu verwenden.

Geben Sie dann fünf Gramm Komponente A und 0,5 Gramm Komponente B des PDMS in einen 150-Milliliter-Kunststoffbehälter und rühren Sie es mit einem Zahnstocher manuell um. Geben Sie die Mischung in eine 10-Milliliter-Spritze. Injizieren Sie dann mit der Spritze das PDMS-Gemisch auf die Kappe.

Backen Sie die gesamte Kappe acht Stunden lang bei 70 Grad Celsius, um das PDMS auszuhärten. Als nächstes löten Sie mit einem Lötkolben die LED-Anode mit dem 24-Gauge-Draht und die LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand. Löten Sie dann einen 680 Ohm Kohlewiderstand mit einem 24-Gauge-Draht an.

Verwenden Sie Isolierband, um die Kabelverbindung zu isolieren. Löten Sie den Kollektor des Fotodetektors mit dem 24-Gauge-Draht und den Emitter des Fotodetektors mit einem 100 Ohm Kohlewiderstand. Verwenden Sie dann Isolierband, um die Kabelverbindung zu isolieren.

Setzen Sie die Leuchtdiode in den Halter des Kulturfläschchens ein. Befolgen Sie den hier gezeigten Schaltplan, schließen Sie die Leuchtdiode an und verwenden Sie ein Fünf-Volt-Netzteil, um sie mit Strom zu versorgen. Stellen Sie sicher, dass die LED funktioniert, indem Sie eine Digitalkamera verwenden, die IR erkennen kann. Setzen Sie nun den Photodetektor in den Halter des Kulturfläschchens ein.

Schließen Sie dann gemäß dem Diagramm den Fotodetektor an und verwenden Sie ein Fünf-Volt-Netzteil, um ihn mit Strom zu versorgen. Schließen Sie das Kabel an beide Seiten der Widerstände des Fotodetektors an, um die Spannung auf der elektronischen Steuerplatine zu messen. Kleben Sie einen Magneten auf die Welle des Lüfters, der als Magnetrühreinheit dient.

Da die magnetische Rühreinheit aus dem Magneten und dem Lüfter gebildet wird, ist es wichtig, die Ablage des Lüfters auf das Kulturfläschchen auszurichten. Auch der Abstand zwischen dem Kulturfläschchen und dem Magneten ist sehr wichtig, um einen stabilen Betrieb zu gewährleisten. Verbinden Sie jedes Stück Polyethylenschlauch des Kulturfläschchens mit dem entsprechenden Stück Silikonschlauch für die Mikropumpen, die Mittelflaschen und die Abfallflasche.

Schalten Sie die Pumpe eine Stunde lang ein und messen Sie das Gesamtvolumen, das von der Mediumflasche in das Kulturfläschchen gepumpt wird, um die Pumprate zu bestimmen. Die typische Pumprate sollte ungefähr vier Milliliter pro Stunde betragen, was der Verdünnungsrate von D entspricht, die 0,33 pro Stunde für ein Arbeitsvolumen von 12 Millilitern des Kulturfläschchens entspricht. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, stellen Sie die gesamte Baugruppe auf einen mittelgroßen Schüttelinkubator.

Um den Morbidosat vorzutesten, stellen Sie die Versorgungsspannung des Lüfters auf fünf Volt ein, um den Motor zu starten und den magnetischen Rührstab zu testen. Nachdem Sie eine Reihe von E-Coli-Proben vorbereitet und eine Kalibrierungskurve gemäß dem Textprotokoll gezeichnet haben, bereiten Sie das Kulturfläschchen mit drei sieben Zentimeter langen ultrachemikalienbeständigen Tygon-Schläuchen mit einem Innendurchmesser von 132 Zoll und einem Außendurchmesser von 332 Zoll für die Einlässe vor, um das Gerät zu bilden. Bereiten Sie M9-Minimalmedium mit 0,2% Glukose und M9 vor, das das Medikament Trimethoprim oder TMP enthält.

Sterilisieren Sie dann das Medium, die Mediumflasche, die Drug-Medium-Flasche, die Abfallflasche und das Kulturfläschchen in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius. Am ersten Tag des Versuchs tauen Sie einen Milliliter gefrorener Wildtyp-E-coli MG1655-Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf und geben Sie 120 Mikroliter der Zellen in ein Kulturfläschchen mit etwa 12 Millilitern M9-Wachstumsmedium. Schalten Sie den Schüttelinkubator ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein, ohne zu schütteln.

Starten Sie den Morbidostat-Betrieb, indem Sie die Mikropumpe, das Magnetrührwerk und die optische Dichtemessung einschalten. Stoppen Sie die Mikropumpe nach ca. 23 Stunden, indem Sie die Versorgungsspannung ausschalten und das Kulturfläschchen herausnehmen. Geben Sie 15 % Glycerin in das Kulturfläschchen und frieren Sie die Proben zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein.

Der Wechsel zu einem neuen Kulturfläschchen zu Beginn jedes dieser Experimente ist ebenfalls wichtig, um Biotinbildungen zu vermeiden. Sonst kann es innerhalb von zwei bis drei Tagen zur Biotinbildung kommen. Nachdem Sie die täglich gefrorene Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur aufgetaut haben, beimpfen Sie ein neues Reagenzglas mit frischem M9-Medium.

Legen Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Schüttelinkubator. Am nächsten Tag verdünnen Sie die mikrobielle Probe mit M9-Medium um das Zehnfache und laden Sie sie in das mikrofluidische Gerät, indem Sie den mikrobiellen Probenbehälter mit fünf PSI unter Druck setzen. Laden Sie dann das TMP-haltige Medium in den Chip, indem Sie den M9 mit TMP-Behälter mit fünf PSI unter Druck setzen.

Führen Sie das Mischen zwischen der Mikrobe und dem Medikament durch, indem Sie das mikromechanische Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip 15 Minuten lang betätigen. Platzieren Sie abschließend den mikrofluidischen Chip in den Mikroskop-Inkubator, der auf dem inversen Mikroskop montiert ist. Mit einer CCD-Kamera können Sie acht Stunden lang stündlich Zellbilder in der Wachstumskammer aufnehmen.

Berechnen Sie die Daten der Zellzahl gemäß dem Textprotokoll. Die üblichen Morbidostat-Operationen, einschließlich der experimentellen Evolution, des Antibiotika-Empfindlichkeitstests und der Überprüfung der Zellmorphologie, wurden mit einer E-coli MG1655-Kultur für ungültig erklärt, die dem Antibiotikum TMP ausgesetzt war, das eine deutliche schrittweise Zunahme der Arzneimittelresistenz mit Mutationen induziert, die sich um das Dihydrofolat-Reduktase- oder DHFR-Gen gruppieren. Es wird erwartet, dass die Mikrobe jeden Tag über die voreingestellte optische Dichteschwelle wächst und die Injektion des Medikaments auslöst, wie hier gezeigt.

Es wird erwartet, dass die Medikamenteninjektion das Wachstum hemmt und infolgedessen die optische Dichte verringert. Dieses Diagramm zeigt den zeitlichen Anstieg der Antibiotikaresistenz in einem Experiment zur Bestimmung des IC50. Die Arzneimittelresistenz stieg über etwa 12 Tage um das 1500-fache auf 1.000 Mikrogramm pro Milliliter.

In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen. Die DHFR-Punktmutationen in der Letzttagsmutante wurden durch Sanger-Sequenzierung gemessen und sind in dieser Tabelle aufgeführt. Der Erwerb einer Arzneimittelresistenz mit mehreren Mutationen beweist die Nützlichkeit des Morbidostats.

Da die Selektion auf Arzneimittel, die Agarplatten enthalten, tendenziell nur die einzelne Mutation verleiht. Diese Abbildung zeigt die On-Chip-Wachstumskurven bei verschiedenen Konzentrationen von TMP. Die mutierten Proben zeigen einen signifikanten Anstieg der Antibiotikaresistenz

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher, die Position der Antibiotikaresistenz in einer realen Kontrolllaborumgebung zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Maßnahmen wie die mikrofluidische Einzelzellmessung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. dass sich die Morphologie aufgrund der Exposition gegenüber Antibiotika noch verändert. Einmal gemeistert, kann dieses Gerät leicht für alle Bakterienkulturexperimente neu konfiguriert werden, z. B. für die Kultivierung eines Bakterienzeichens oder die Erhöhung der Kostentoleranz eines Bakterienstamms.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Erwerb von Antibiotikaresistenz in einem echten kontrolladaptiven Labor-Evolutionsexperiment untersucht. Vergessen Sie nicht, die arzneimittelresistenten Bakterien gemäß den Biosicherheitsregeln für die mikrobiologische Praxis zu behandeln. Für einen Versuch, bei dem Bakterien grundlegend trainiert werden, kann eine Sondergenehmigung erforderlich sein.