Name: Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Erfahren Sie den Aufbau eines kostengünstigen Morbidostaten zur Untersuchung der Antibiotikaresistenz bei Bakterien. Diese Methode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des Bakterienwachstums und die dynamische Anpassung der Antibiotikakonzentration.

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Die Autoren danken Prof. Sze-Bi Hsu und Frau Zhenzhen für die nützlichen Diskussionen und die Hilfe bei der theoretischen Analyse und numerischen Simulation. Y. T. Y. möchte sich für die finanzielle Unterstützung durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie unter den Fördernummern MOST 103-2220-E-007-026 und MOST 104-2220-E-007-011 und durch die National Tsing Hua University unter den Fördernummern 103N2042E1 bedanken, 104N2042E1 und 105N518CE1.

1. Montage und Vortests des Morbidostat Geräte <ol><li> Die Montage des Morbidostat <ol><li> Lochen 3 Löcher auf der Kappe des Kulturfläschchen mit einer 18 G Spritzennadel. Schneiden drei Stück Polyethylenschlauch ~ 7 cm in der Länge. Legen Sie diese drei Stücke aus Polyethylenschlauch auf der Kappe. </li><li> Verwenden Sie Klebeband den Rand der Kappe zu wickeln, wie die Besetzung für das Polydimethylsiloxan (PDMS) Mischung zu dienen. Mischungs 5 ​​g A-Komponente und 0,5 g B-Komponente der PDMS in einem 150 ml Kunststoffbehälter durch manuelles Rühren mit einem Zahnstocher. Laden des Gemischs in eine 10 ml Spritze. <ol><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Kappe mit der Spritze. Backen Sie die gesamte Kappe die PDMS für 8 Stunden im Ofen bei 70 ° C zu heilen. </li></ol></li><li> Löten Sie die LED-Anode mit dem 24-Gauge-Kabel und LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mit einem Lötkolben. Dazu wird ein 680 Ω Kohlewiderstand mit 24 G Draht. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband. </li><li> Damitlder dem Kollektor des Photodetektors mit dem 24 G Draht und dem Emitter des Photodetektors mit einem 100 k &amp; OHgr Kohlewiderstand. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband. </li><li> Setzen Sie die Leuchtdiode in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie die Leuchtdiode und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Stellen Sie sicher , dass die LED arbeitet mit einer Digitalkamera , die IR (zB ein Handy-Kamera) erkennen kann. </li><li> Setzen Sie den Photodetektor in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie den Photodetektor und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Schließen Sie das Kabel an beiden Seiten der Photowiderstände , die Spannung über die elektronische Steuerkarte zu messen. </li><li> Kleben Sie einen Magneten an der Welle des Lüfters, der als Magnetrührer Einheit dient. Beachten Sie, dass die alignment der Welle des Gebläses zu dem Kulturfläschchen, und der Abstand zwischen der Phiole der Kultur und dem Magneten ist für die ordnungsgemäße Funktion der magnetischen Rühreinheit sehr kritisch. </li><li> Schließen Sie jedes Stück Polyethylenschlauch des Kulturfläschchen in das entsprechende Stück Silikonschlauch für die Mikropumpen, mittlere Flaschen und Abfallflasche. Schalten Sie die Pumpe für 1 Stunde und messen das Gesamtvolumen der Mittelflasche in die Kulturfläschchen, die Pumprate zu bestimmen, gepumpt wird. Beachten Sie, dass die typische Pumprate sollte ~ 4 ml / h, die D = 0,33 h dem Verdünnungsrate entspricht -1 für eine 12 ml Arbeitsvolumen der Kulturfläschchen. </li><li> Legen Sie die gesamte Baugruppe auf einem mittelgroßen (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Vortests die Morbidostat <ol><li> Set Versorgungsspannung von kühlem Ventilator bis 5 V seinen Motor zu starten, die magnetischen Rührstab zu testen. Beachten Sie, dass die Rührwirkung visuell inspiziert werden kann. Die Spannung, die fahrens der Lüftermotor wird durch Pulsweitenmodulation (PWM) präzise gesteuert werden. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Wildtyp E. coli Proben mit optischen Dichten bei 600 nm typischerweise im Bereich von 0,07 bis 0,3 für die Kalibrierung. Legen Sie einen Test E. coli Probe in der Kulturfläschchen und notieren Sie die Photospannung. <ol><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l der gleichen Probe in dem Plattenleser und notieren Sie die optische Dichte. Verwenden Sie die Photospannung gegenüber der optischen Dichtedaten der Eichkurve zu zeichnen. Beachten Sie, dass typischerweise in der optischen Dichte einer Einheitsänderung mit dem Bias-Schema hier verwendet, um ~ 7,6 V Änderung der Photodetektor entspricht. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ausführen des Morbidostat <ol><li> Vorbereitung vor dem täglichen Experiment starten <ol><li> Bereiten Sie die Kulturfläschchen mit drei extrem chemikalienbeständige Tygon Schläuche mit Innendurchmesser 1/32 Zoll und Außendurchmesser 3/32 Zoll für Einlässe, wie in Abschnitt der Vorrichtung zu bilden1.1 und in Ergänzungs 1. </li><li> Bereiten Sie die M9-Minimalmedium (0,2% Glucose) und Trimethoprim (TMP) Arzneimittel enthaltenden Medium. Sterilisieren des Mediums, das Medium Flasche, das Medikament Mittelflasche, die Abfallflasche, und die Kulturfläschchen in einem Autoklaven bei 121 ° C. HINWEIS: Der TMP ist eine Stammlösung , die später verwendet wird , um die Konzentrationen in Tabelle 1 und das Medikament dem Medium autoklaviert wird enthaltende TMP erreichen nicht. </li></ol></li><li> Das Ausführen des Morbidostat <ol><li> Am ersten Tag des Experiments, tauen 1 ml der gefrorenen Wildtyp E. coli MG1655 - Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und Übertragung 120 ul der Zellen zu dem Kultur Durchstechflasche mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. Nach dem ersten Tag auftauen 1 ml der gefrorenen E. coli - Zellen aus dem vorherigen Tag für 5 min und Übertragung 120 ul der Zellen zu einer neuen Kultur Fläschchen mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. </li><li> Schalten Sie den Schüttelinkubator und stellen Sie die tempe<html> rature bis 30 ° C ohne Schütteln inkubiert. </li><li> Starten Sie die morbidostat Operation durch auf der Mikropumpe dreht, die magnetische Rühreinheit und der optische Dichtemessung. HINWEIS: Während des Betriebs wird ein Rückkopplungs Schwellwert-Algorithmus wird verwendet, um die Arzneimittelinjektion zu steuern. Wenn die gemessene optische Dichte einen voreingestellten Schwellenwert überschreitet, würde die Arzneimittelinjektionspumpe eingeschaltet und der Mittelpumpe ausgeschaltet werden würde. Andernfalls bleibt die Droge Einspritzpumpe ab und die Mittelpumpe eingeschaltet ist. </li><li> Überwachen der Spannung von Zeit zu Zeit, um sicherzustellen, dass das mikrobielle Wachstum ist. Hinweis: Wegen der Frost-Tau - Zyklus, E. coli - Zellen zeigen eine Verzögerung von ca. 4 h während jedes Wachstum des Tages. </li><li> Nach ca. 23 h, stoppen Sie die Mikropumpe durch seine Versorgungsspannung ausgeschaltet und die Kulturfläschchen herausnehmen. Hinzufügen 15% Glycerin in die Kulturfläschchen und gefrier die Probe bei -80 ° C zur Lagerung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in 96-Well-Format HINWEIS: Führen Sie die Wachstumsrate Messung in einem Plattenlesegerät mit einer 96-Well-Format, um die Antibiotikaresistenz Ebene zu bestimmen. <ol><li> Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und übertragen 15 ul der Zelle in das Kulturfläschchen ~ 15 ml M9-Medium enthält. Es ihnen ermöglichen, bis die optische Dichte bei 600 nm wachsen ~ 0,1 erreicht. Teilen Sie die 15 ml in 1 ml Flaschen und fügen Sie die TMP - Medikament bei diesem Schritt die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erhalten , wie in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Nehmen Sie 200 ul der Probe aus Schritt 3.1 und Platz in jede Vertiefung in dem Plattenleser und es ihnen ermöglichen, für 12 Stunden 5 zu wachsen. Die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm wird automatisch während der Messung aufgezeichnet. HINWEIS: Für jeden Datenpunkt werden drei Messungen aufgezeichnet und gemittelt, um die Konsistenz der Daten zu gewährleisten. Die Daten auf der optischen Dichte gegen die Zeit kann be verwendet, um die Wachstumsrate zu erhalten. </li><li> Zeichnen Sie die Wachstumsrate Daten in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration IC 50 zu erhalten. Beachten Sie, dass IC 50 als die Arzneimittelkonzentration definiert , bei der die Wachstumsrate fünfzig Prozent der maximalen Wachstumsrate beträgt 5. </li></ol> 4. Einzelzellmorphologie und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in Mikrofluidiksysteme <ol><li> Führen Sie die Herstellung der mikrofluidischen Geräte über mehrschichtige weiche Lithographie von PDMS wie an anderer Stelle 15 beschrieben. <ol><li> Verwenden photolithographischen der Photoresistform für die Steuer- und Strömungsschichten zu machen. Beachten Sie, dass für die Steuerschicht, haben negative Photoresist (~ 15 &amp; mgr; m Höhe) und positive Photoresist (~ 8 &amp; mgr; m Höhe) eine Form auf einer blanken Siliziumwafer herzustellen. </li><li> Bereiten PDMS-Mischungen mit Vernetzungsverhältnisse von 5: 1 und 20: 1 für die Steuerschicht und die Strömungsschicht. Setzen Sie die Mischungen in einem Exsikkator unter Vakuum keine Luftblasen zu entfernenFür 1 Std. </li><li> Setzen Sie die Steuerschicht Photoresist Formen auf Siliziumwafer Trimethylchlorsilan (TMCS) Dampf. Sprechen Sie die Kontrollschicht von ca. 6 mm Dicke, die durch die PDMS-Mischung Gießen (mit Vernetzungs Verhältnis 5: 1) auf dem Siliziumwafer auf der Steuerschicht Photoresist-Form. Backen Sie die Steuerschicht für 40 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen. </li><li> Bilden die Strömungsschicht durch Rotationsbeschichtung eines PDMS-Mischung (mit Vernetzungsverhältnis 20: 1, Schleuderdrehzahl 3000 Upm für 60 sec) auf eine Strömungsschicht Photoresistform. Backen Sie die Strömungsschicht für 30 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge die Steuerschicht in die gewünschte Chipgröße zu schneiden (in der Regel 3 cm x 2 cm) und abziehen manuell die Steuerschicht. Legen Sie die Steuerschicht auf der Oberseite der Strömungsschicht und richten sie unter einem Stereomikroskop. Cure die ausgerichtete Montage bei 80 ° C im Ofen über Nacht. Danach 5 h die Montage in 250 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter tränken das Rest TMCS auflösen. </li><li> Anschließend werden die Einlaßlöcher mit 20 G Nadeln stanzen und das gesamte Elastomer an einem Glasobjektträger mit einer leeren PDMS-Schicht (PDMS Quer Verhältnis Verknüpfung 5: 1, 2,000 Schleuderdrehzahl rpm für 30 sec) beschichtet bonden für 40 sec durch Luftplasmabehandlung bei 1,2 Torr Luftdruck. </li><li> Durchführung umfassende Backen für 36 h bei 80 ° C, um die zytotoxischen Wirkungen von PDMS zu reduzieren. Beachten Sie, dass diese Backschritt kritisch ist die Toxizität für die Bakterienzellen zu minimieren. </li></ol></li><li> On Chip Growth Experiment <ol><li> Bevor in die Mikrofluidik-Vorrichtung geladen wird, spülen Sie es mit entsalztem Wasser für 1 Stunde und M9-Medium für 1 Stunde. </li><li> Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und inokulieren Medium ein neues Reagenzglas mit frischem M9. Die Probe wird in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Verdünnen Sie die mikrobielle Probe 10-fach mit M9-Medium und laden Sie es in die Mikrofluidik-Vorrichtung durch die mikrobielle Probenbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Dann laden Sie die TMP-DrogeMedium in den Chip durch das Medikament Mittelbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Führen Sie die Vermischung zwischen der Mikrobe und Drogen durch Betätigung des mikromechanischen Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 min. </li><li> Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip im Mikroskop-Inkubator auf dem inversen Mikroskop angebracht. Erwerben das Zellbild in der Wachstumskammer auf dem umgekehrten Mikroskop jede hr für 8 h mit der CCD-Kamera angebracht ist. </li><li> Verwenden Sie das benutzerdefinierte Programm Skript , um die Zellzahlen über einen Schwellenwert - Algorithmus auf den Zellenbilddaten 18 zu berechnen. Beachten Sie, dass die Zellzahldaten werden gemittelt, typischerweise über drei mikrofluidischen Kammern. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein Low-Fußabdruck morbidostat Gerät von Low-Cost-Komponenten demonstriert. Der Anstieg der Widerstandsniveau Medikament vom Gerät registriert sind konsistent mit denen früherer Berichte 5. Entwickelt für evolutionäre Studien der Arzneimittelresistenz ist das Gerät möglicherweise auf viele andere Experimente. Zunächst wird eine umfassende Datenbank von Medikamenten-induzierten Mutationen können für einen großen Satz von klinisch relevanten Antibiotika hergestellt werden. Zum Beispiel kann die evolutionäre Weg...

Seit der Einführung des ersten Antibiotikums Penicillin hat mikrobielle Antibiotika - Resistenz in ein Problem der globalen Gesundheit entwickelt 1. Obwohl der Erwerb von Antibiotika - Resistenzen können nachträglich in vivo untersucht werden, werden die Bedingungen dieser Versuche häufig nicht während der gesamten Evolution 2 gesteuert. Alternativ können adaptive gerichtete Evolution offenbaren die molekulare Evolution einer mikrobiellen Spezies unter Umweltbelastungen oder Selektionsdruck aus einem Antibiotikum 3. In jüngster Zeit haben viele gut kontrollierten evolutionäre Experimente von Antibiotika-Resistenzen, die Entstehung von Antibiotika-Resistenzen aufgeklärt. Zum Beispiel zeigte Austin Gruppe rasche Entwicklung in einem richtig entwickelt mikrofluidische compartmented Umwelt 4. Die neu entwickelte morbidostat induziert systematische Mutationen unter Drogenselektionsdruck 5,6. Die morbidostat, eine mikrobielle selecGerät werden , die die Antibiotika - Konzentration kontinuierlich einstellt eine nahezu konstante Bevölkerung zu erhalten, ist ein großer Fortschritt von der Fluktuationstest in der Mikrobiologie verwendeten 7,8. Im Fluktuationstest, ein Antibiotikum Medikament wird in hoher Konzentration injiziert, und die überlebenden Mutanten werden gesiebt und gezählt. Stattdessen Mikroben in einem morbidostat werden ständig in Frage gestellt und mehrere Mutationen erwerben. Die morbidostat arbeitet ähnlich der Chemostat, eine Kulturvorrichtung von Novick und Szliard 1950 erfunden , die Nährstoffe durch kontinuierliche Zufuhr während Verdünnen der Mikrobenpopulation 9 eine konstante Population aufrecht erhält. Seit seiner Einführung hat sich die Chemostat wurde weiterentwickelt und verbessert. Aktuelle mikrofluidischen Chemostate haben Nano- und Einzelzellen-Kapazitäten erreicht. Jedoch sind diese Vorrichtungen nicht für adaptive Evolutionsexperimenten, die eine große Zellpopulation mit vielen Mutationsereignisse 10,11 erfordern. Vor kurzem Mini-Chemostate mit einem Arbeitsvolumen von ca. 10 ml wurden ebenfalls entwickelt in den Spalt zwischen Liter Bioreaktoren und der mikrofluidischen chemostat 12,13 zu füllen. Hier präsentieren wir das Design und die Verwendung eines Low-Cost, automatisierte morbidostat für ein Antibiotikum drug resistance Studie. Das vorgeschlagene Modul kann mit minimalen Hardware-Anforderungen in einem Schüttelinkubator in einem mikrobiologischen Labor eingesetzt werden. Die Open-Source - Firmware auch leicht an spezifische Anwendungen der adaptiven Evolution zugeschnitten, wie Metabolic Engineering 3. Schließlich wird die morbidostat in ein Multiplex - Mikrofluidik - Plattform integriert für die Antibiotika - Resistenzprüfung 14.

<table><tbody><tr><td>Umwelt-Shaker-Inkubator</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo-Platine</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Kohlenstoffwiderstand</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias-Widerstand für LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Kohlenstoffwiderstand</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias-Widerstand für Fototransistor</td></tr><tr><td>940 nm Leuchtdiode</td><td>Helle LED Elektronik</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optische Dichtemessung</td></tr><tr><td>940 nm Fototransistor</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optische Dichtemessung</td></tr><tr><td>Darlington-Paar-IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>diesem IC treibt Mikropumpen und Magnetrührwerk</td></tr><tr><td>an 5 V DC bürstenloser Lüfter</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>Spezifikation: 5 V Versorgungsspannung und 80&nbsp; Mutti; verfügbar www.jameco.com</td></tr><tr><td>Piezoelektrische Mikropumpe</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Druck > 3&nbsp; kPa; Durchflussrate >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' &nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetrührstab</td><td>COWIE</td><td></td><td>konische Form Maße: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Glasszintillation 20 ml Fläschchen</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrexglas 28 mm (Durchmesser) x 61 mm (Höhe)</td></tr><tr>Halter <td></td><td></td><td>für Kulturfläschchen</td><td>Sonderanfertigung aus Polyformaldehyd&nbsp;</td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>zum Verschließen des Glasfläschchens</td></tr><tr><td>Medium Flasche</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimales Salz 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Cadamino Acid</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td></td><td>Glucose Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td>für Agarplatte</td></tr><tr><td>Luria Bertani Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>für mikrofluidische Messungen Verwendung 40X Objektiv NA = 0,55</td></tr><tr><td>Mikroskop Inkubator</td><td>Lebendzellinstrument</td><td>CU-109</td><td>für mikrofluidische Messung</td></tr><tr><td>Magnetventile</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Schließer 1,3 Watt 12 VDC</td></tr><tr><td>USB-Schnittstellenkarte</td><td>Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R Digitales I/O-Modul&nbsp;</td><td>für mikrofluidische Messung</td></tr><tr><td>Luftkompressor</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Druckquelle für Mikrofluidik; Max. Druck 80 psi</td></tr><tr><td>Luer-Lock-Anschlüsse auf 1/8" Widerhaken</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>für die mikrofluidische Steuerung</td></tr><tr><td>1/8" Widerhaken auf 10-32 Gewindeanschluss</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>für die mikrofluidische Steuerung</td></tr><tr><td>Luer-Lock-Innengewindeanschlüsse auf 10-32 Gewindeanschluss</td><td>ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>für die mikrofluidische Steuerung</td></tr><tr><td>NPN Darlington-Transistor 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>für die mikrofluidische Regelung</td></tr><tr><td>10 kOhm, Kohlefilmwiderstand, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>für die mikrofluidische Regelung</td></tr><tr><td>Tantalkondensator, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, 10</td>%<td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>für die mikrofluidische Steuerung</td></tr><tr><td>Andor CCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>für mikrofluidische On-Chip-Bildgebung</td></tr><tr><td>ELISA-Plattenleser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zweikomponenten-Silikon</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>für die Herstellung von mikrofluidischen Chips</td></tr><tr><td>SU-8 Fotolack</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>für die Herstellung von mikrofluidischen Chips</td></tr><tr><td>AZ4620 Fotolack</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>für die Herstellung von mikrofluidischen Chips</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>für die Herstellung von mikrofluidischen Chips</td></tr><tr><td>20 Gauge Spritzennadel</td><td>BD</td><td></td><td>für die Herstellung von mikrofluidischen Chips</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid</td><td>Messung der Antibiotikaresistenz</td></tr></tbody></table>

design und die verwendung eines low cost, automatisierte morbidostat für adaptive evolution der bakterien unter antibiotikums selection

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Wir beschreiben eine kostengünstige, konfigurierbar morbidostat für den Evolutionsweges der Antibiotikaresistenz zu charakterisieren. Die morbidostat ist eine bakterielle Kulturvorrichtung, die kontinuierlich das Bakterienwachstum überwacht und reguliert dynamisch die Arzneimittelkonzentration, die Bakterien ständig herausfordern, wie sie Arzneimittelresistenz zu erwerben entwickeln. Das Gerät verfügt über ein Arbeitsvolumen von ca. 10 ml und ist voll automatisiert und mit Messung der optischen Dichte und Mikropumpen für mittlere und Medikamentenabgabe ausgestattet. Um die Plattform zu validieren, maßen wir die schrittweise Übernahme von Trimethoprim Resistenz in Escherichia coli MG 1655 und integriert , um die Vorrichtung mit einer Mikrofluidik - Multiplex - Plattform Zellmorphologie und Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Der Ansatz kann auf Laboruntersuchungen von Antibiotika-Resistenzen hochskaliert werden, und ist verlängerbar Evolution für Stamm Verbesserungen in Metabolic Engineering und andere Bakterienkultur Experimente adaptiv.

Die oben beschriebene morbidostat ist in 1. Die gemeinsamen morbidostat Operationen, einschließlich der experimentellen Entwicklung, antibiotische Empfindlichkeitstest und Zellmorphologie Prüfung, validiert wurden in einem E. schematisierte coli MG1655 Kultur Trimethoprim (TMP) ausgesetzt, ein häufig verwendetes Antibiotikum 5,6. TMP induziert sehr ausgeprägte schrittweise Erhöhungen der Arzneimittelresistenz und die Mutationen sind um die Di...

Wir beschreiben ein kostengünstiges, konfigurierbares Morbidostat, das die Charakterisierung von Antibiotikaresistenzen durch dynamische Anpassung der Wirkstoffkonzentration ermöglicht. Das Gerät kann mit einer gemultiplexten mikrofluidischen Plattform integriert werden. Der Ansatz kann für Laborstudien zur Antibiotikaresistenz skaliert werden.

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, den evolutionären Weg der Antibiotikaresistenz mithilfe eines Morbidostaten zu charakterisieren, der das bakterielle Wachstum kontinuierlich überwacht und die Antibiotikakonzentration dynamisch anpasst, während die Bakterien Resistenzen gegen das Medikament entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass der Aufbau aus kostengünstigen, leicht verfügbaren elektronischen Komponenten besteht und problemlos für spezifische Zwecke umkonfiguriert werden kann. Die Durchführung der Verfahren wird Po Cheng Liu und Yi Tai Lee demonstrieren, beide sind Doktoranden in meinem Labor.Um den Morbidostaten zusammenzubauen, stanzen Sie zunächst mit einer 18-Gauge-Nadel drei Löcher in den Verschluss des Kulturfläschchens. Schneiden Sie drei Stücke Polyethylen-Schlauch mit einer Länge von etwa sieben Zentimetern zu und führen Sie sie in die Löcher im Verschluss ein. Wickeln Sie Klebeband um den Rand des Verschlusses, um eine Form für die Polydimethylsiloxan- (PDMS-)Mischung zu bilden.Fügen Sie dann fünf Gramm Komponente A und 0,5 Gramm Komponente B des PDMS in einen 150-Milliliter-Kunststoffbehälter hinzu und rühren Sie die Mischung manuell mit einem Zahnstocher um. Füllen Sie die Mischung in eine 10-Milliliter-Spritze. Injizieren Sie dann mit der Spritze die PDMS-Mischung auf die Kappe.Den gesamten Deckel acht Stunden lang bei 70 Grad Celsius aushärten, um das PDMS zu vernetzen. Anschließend die LED-Anode mit dem 24-Adern-Draht und die LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mithilfe eines Lötkolbens verlöten. Danach einen 680-Ohm-Kohlewiderstand mit einem 24-Adern-Draht verlöten.Verwenden Sie Isolierband, um die Drahtverbindung zu isolieren. Löten Sie den Kollektor des Photodetektors mit dem Draht der Stärke 24 und den Emitter des Photodetektors mit einem Kohleschichtwiderstand von 100 Ohm. Isolieren Sie anschließend die Drahtverbindung mit Isolierband.Platzieren Sie die Leuchtdiode in der Kulturgefäßhalterung. Schließen Sie die Leuchtdiode gemäß des hier gezeigten Schaltplans an und verwenden Sie eine 5-Volt-Stromversorgung, um sie zu betreiben. Stellen Sie sicher, dass die LED funktioniert, indem Sie eine digitale Kamera verwenden, die Infrarotlicht (IR) detektieren kann. Platzieren Sie nun den Lichtdetektor in der Kulturgefäßhalterung.Danach das Diagramm befolgen, den Fotodetektor anschließen und ihn mit einer 5-Volt-Stromversorgung versorgen. Das Kabel an beiden Seiten der Fotodetektorwiderstände anschließen, um die Spannung über die elektronische Steuerplatine zu messen. Einen Magneten auf die Welle des Kühlventilators kleben, der als magnetische Rührvorrichtung dient.Da die magnetische Rührvorrichtung aus dem Magneten und dem Kühllüfter besteht, ist es entscheidend, das Fach des Lüfters mit der Kulturflasche auszurichten. Auch der Abstand zwischen der Kulturflasche und dem Magneten ist sehr kritisch, um einen stabilen Betrieb sicherzustellen. Verbinden Sie jedes Stück Polyethylen-Schlauch der Kulturflasche mit dem entsprechenden Stück Silikon-Schlauch für die Mikropumpen, Medium-Flaschen und Abfallflasche.Schalten Sie die Pumpe eine Stunde lang ein und messen Sie das gesamte Volumen, das aus der Medium-Flasche in das Kulturfläschchen gepumpt wird, um die Pumpgeschwindigkeit zu bestimmen. Die typische Fördergeschwindigkeit sollte etwa vier Milliliter pro Stunde betragen, was einer Verdünnungsrate von D gleich 0,33 pro Stunde bei einem Arbeitsvolumen von 12 Milliliter im Kulturfläschchen entspricht. Sobald der Aufbau abgeschlossen ist, stellen Sie die gesamte Apparatur in einen mittelgroßen Schüttelinkubator.Um den Morbidostaten vorab zu testen, stellen Sie die Versorgungsspannung des Lüfters auf fünf Volt ein, um den Motor zu starten und den magnetischen Rührstab zu testen. Nachdem eine Reihe von E.-coli-Proben vorbereitet und eine Kalibrierungskurve gemäß dem Textprotokoll erstellt wurde, bereiten Sie die Kulturflasche mit drei sieben Zentimeter langen Stücken ultrachemikalienbeständigem Tygon-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1/32 Zoll und einem Außendurchmesser von 3/32 Zoll für die Zuleitungen zur Geräteherstellung vor. Bereiten Sie M9-Minimalmedium mit 0,2 % Glukose sowie M9, das den Wirkstoff Trimethoprim oder TMP enthält, vor.Dann sterilisieren Sie das Medium, die Mediumflasche, die Medikamentenmediumflasche, die Abfallflasche und das Kulturgefäß im Autoklaven bei 121 Grad Celsius. Am ersten Tag des Experiments tauen Sie einen Milliliter gefrorener wildtypischer E-coli-MG1655-Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf und überführen 120 Mikroliter der Zellen in ein Kulturgefäß, das etwa 12 Milliliter M9-Wachstumsmedium enthält. Schalten Sie den Schüttelinkubator ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein, ohne zu schütteln.Starten Sie den Morbidostat-Betrieb, indem Sie die Mikropumpe, die magnetische Rührvorrichtung und die optische Dichtemessung einschalten. Nach etwa 23 Stunden schalten Sie die Mikropumpe aus, indem Sie die Versorgungsspannung abstellen, und nehmen Sie das Kulturfläschchen heraus. Geben Sie 15 % Glycerin in das Kulturfläschchen und frieren Sie die Proben zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein.Es ist ebenfalls wichtig, zu Beginn jedes dieser Experimente auf eine neue Kulturschale umzusteigen, um Biotinbildung zu vermeiden. Andernfalls kann die Biotinbildung innerhalb von zwei oder drei Tagen auftreten. Nach dem Auftauen der täglich eingefrorenen Probe bei Raumtemperatur für fünf Minuten eine neue Teströhre mit frischem M9-Medium beimpfen.Platzieren Sie die Probe über Nacht in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag verdünnen Sie die mikrobielle Probe mit M9-Medium um den Faktor zehn und geben sie in das mikrofluidische Gerät ein, indem Sie den Behälter mit der mikrobiellen Probe mit einem Druck von fünf PSI beaufschlagen. Anschließend geben Sie das TMP-haltige Medium in den Chip, indem Sie den Behälter mit M9-Medium und TMP mit einem Druck von fünf PSI beaufschlagen.Führen Sie das Mischen von Mikrobe und Wirkstoff durch Betätigung des mikromechanischen Ventils zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 Minuten durch. Platzieren Sie abschließend den mikrofluidischen Chip in der Mikroskop-Inkubationskammer, die auf dem inversen Mikroskop montiert ist. Erwerben Sie mit einer CCD-Kamera stündlich über einen Zeitraum von acht Stunden Zellbilder in der Wachstumskammer.Berechnen Sie die Zellanzahldaten gemäß dem Textprotokoll. Die üblichen Morbidostat-Operationen, einschließlich experimentelle Evolution, Antibiotikaresistenztest und Überprüfung der Zellmorphologie, wurden anhand einer mit dem Antibiotikum TMP behandelten E-coli-MG1655-Kultur ungültig gemacht, die eine charakteristische stufenweise Zunahme der Arzneimittelresistenz mit Mutationen in der Nähe des Dihydrofolatreduktase- oder DHFR-Gens aufweist. Täglich wird erwartet, dass sich das Mikrobenwachstum über die voreingestellte optische Dichteschwelle hinaus entwickelt und somit die Arzneimittelzufuhr auslöst, wie hier gezeigt.Es wird erwartet, dass die Medikamenteninjektion das Wachstum hemmt und infolgedessen die optische Dichte verringert. Diese Darstellung zeigt den zeitlichen Anstieg der Antibiotikaresistenz in einem Experiment zur Bestimmung der IC50. Die Medikamentenresistenz stieg innerhalb von etwa 12 Tagen um etwa das 1500-Fache auf 1.000 Mikrogramm pro Milliliter an.Im Einklang mit früheren Befunden. Die DHFR-Punktmutationen im letzten Tag-Mutanten wurden durch Sanger-Sequenzierung gemessen und sind in dieser Tabelle aufgeführt. Der Erwerb von Arzneimittelresistenz durch mehrere Mutationen belegt die Nützlichkeit des Morbidostats.Da die Selektion auf Agarplatten mit Wirkstoff in der Regel nur eine einzige Mutation bewirkt, zeigt diese Abbildung die Wachstumskurven auf dem Chip bei verschiedenen Konzentrationen von TMP. Die Mutantenproben weisen einen signifikanten Anstieg der Antibiotikaresistenz auf.Nach seiner Entwicklung ebnete dieses Verfahren den Forschern den Weg, die Position der Antibiotikaresistenz in einer realen Kontrolllaborumgebung zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können weitere Messungen wie mikrofluidische Einzelzellmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Morphologie aufgrund der Exposition gegenüber Antibiotika weiterhin verändert wird. Sobald die Handhabung beherrscht ist, kann dieses Gerät leicht für alle Experimente mit Bakterienkulturen umkonfiguriert werden, wie beispielsweise den Anbau einer Bakterienart oder die Erhöhung des Kostenresistenzniveaus eines Bakterienstamms.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Erwerb von Antibiotikaresistenz in einem realen, kontrollierten adaptiven Labor-Experiment zur Evolution untersucht. Vergessen Sie nicht, die resistenten Bakterien gemäß den Biosicherheitsregeln für mikrobiologische Arbeitsverfahren zu handhaben. Für ein Experiment, das die Grundausbildung von Bakterien beinhaltet, kann eine besondere Genehmigung erforderlich sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

Quelle: Liu, P. C., et al. Entwicklung und Verwendung eines kostengünstigen, automatisierten Morbidostat für die adaptive Evolution von Bakterien unter Auswahl von Antibiotika. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Chips zur Visualisierung und zum Vergleich des Wachstums und der Morphologie von Wildtyp- und Trimethoprim-resistenten E. coli-Stämmen unter Trimethoprim-Antibiotika-Stress.

Bakterienwachstum auf einem mikrofluidischen Chip zur Untersuchung der Resistenz von Antibiotika

Quelle: Jian, X., et al., Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit dem mikrobiellen Mikrotröpfchenkultursystem (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die Verwendung eines mikrobiellen Mikrotröpfchenkultursystems, um die adaptive Evolution von Bakterien in Richtung Methanoltoleranz voranzutreiben. Durch das Mischen von künstlich hergestellten Bakterienkulturen mit einem Stressmedium mit hohem Methanolgehalt und deren Segmentierung in Mikrotröpfchen wählt das...

Adaptive Evolution von Bakterien mit Hilfe eines mikrobiellen Mikrotröpfchen-Kultursystems

Zellwachstumsrate ist ein regulierter Prozess und eine wesentliche Determinante für Zellphysiologie. Kontinuierliche Kultivierung mit Chemostate ermöglicht extrinsischen Kontrolle der Zellwachstumsrate von Nährstoffmangel erleichtert die Untersuchung der molekularen Netzwerke, die Zellwachstum und wie diese Netzwerke entwickeln, um das Zellwachstum zu optimieren steuern.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Wir entwickelten und validierten ein small-footprint Reihe von Miniatur Chemostate aus leicht verfügbaren Teile für niedrigen Kosten gebaut. Physiologische und experimenteller Evolution Ergebnisse waren ähnlich größeres Volumen Chemostate. Die ministat Array bietet eine kompakte, kostengünstige und leicht zugängliche Plattform für traditionelle Chemostatexperimenten, funktionaler Genomik und chemische Screening-Anwendungen.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Hier präsentieren wir eine experimentelle Methode, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu testen.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Das eVOLVER-Framework ermöglicht eine durchgängige mikrobielle Kultur mit hoher Auflösung und dynamischer Kontrolle über experimentelle Parameter. Dieses Protokoll zeigt, wie man das System für ein komplexes Fitness-Experiment einsetzt, das die Anwender bei der Programmierung automatisierter Kontrolle über viele einzelne Kulturen, das Messen, Sammeln und Interagieren mit experimentellen Daten in Echtzeit führt.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Erfahren Sie den Aufbau eines kostengünstigen Morbidostaten zur Untersuchung der Antibiotikaresistenz bei Bakterien. Diese Methode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des Bakterienwachstums und die dynamische Anpassung der Antibiotikakonzentration.

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection (Video) | JoVE Journal

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

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