Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Muskelleistung und -funktion beim Zebrafisch mit Hilfe von berührungsevozierten Reaktions- und Schwimmassays zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der neuromuskulären Forschung zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von beeinträchtigter Muskelleistung oder neurodegenerativen Defekten in Zebrafisch-erkrankten Modellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Beurteilung der Muskelleistung in Zebrafisch-erkrankten Modellen bietet.

Um den Assay durchzuführen, stellen Sie eine mit etwa 25 Millilitern Embryomedium gefüllte Petrischale auf einen beleuchteten, temperaturgesteuerten Tisch, der auf etwa 28 Grad Celsius eingestellt ist. Montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera über der Schüssel. Starten Sie die Videoaufzeichnungssoftware und stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf 1.000 Bilder pro Sekunde ein, um sicherzustellen, dass schnelle Schwimmgeschwindigkeiten erfasst werden können.

Positionieren Sie den Embryo in der Mitte der Petrischale, gut sichtbar im Sichtfeld. Drücken Sie auf Aufnahme und geben Sie dann einen mechanosensorischen Stimulus ab, indem Sie den Embryo sanft mit einer stumpfen Nadel auf dem Kopf berühren. Stoppen Sie die Aufnahme, sobald der Embryo aus dem Sichtfeld geschwommen ist oder zur Ruhe zurückgekehrt ist.

Wiederholen Sie den Test der gleichen Larven, hauptsächlich zur Gewöhnung oder zur Förderung der Muskelschwäche bei einigen erkrankten Modellen, was zu einer verminderten Reaktion auf den taktilen Reiz führt, daher sollte jeder Embryo nur einmal getestet werden. Um das Schwimmverhalten zu quantifizieren, starten Sie die Software und wählen Sie die Fortbewegung der einzelnen Larven mit unserem Hintergrund-Subtraktionsmodul aus, um die AVI-Videodatei zu öffnen. Wählen Sie in der Menüleiste das Freihand- oder Polygonwerkzeug aus und wählen Sie den Bereich des Films aus, der sowohl die ursprüngliche Position des Fisches als auch den Bereich, zu dem er schwimmt, umfasst, während die Sonde, die zum Auslösen des mechanosensorischen Stimulus verwendet wird, ausgeschlossen ist.

Klicken Sie in der Menüleiste auf Experimentieren und wählen Sie Ausführen. Speichern Sie an der Eingabeaufforderung die Rohdatenanalysedatei im PHR-Format am gewünschten Speicherort. Klicken Sie anschließend auf Start, um die Analyse zu starten.

Sobald der Fisch aus dem Sichtfeld geschwommen ist oder der Videoclip beendet ist, schließen Sie die Analyse ab, indem Sie im Experimentmenü auf Stopp klicken, und ein Fenster mit den Ergebnissen wird angezeigt. Scrollen Sie im Fenster nach rechts, um den maximalen Beschleunigungswert zu erhalten. Exportieren Sie die Daten, indem Sie im Dropdown-Menü "Ergebnisse" auf die Schaltfläche "Sofortige Ergebnisse exportieren" klicken.

Wählen Sie die entsprechende Rohdatenanalysedatei aus und klicken Sie zum Öffnen. Dadurch wird eine Textdatei im Zielordner gespeichert, die in einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden kann. Legen Sie die Testlarven in eine 48-Well-Platte, eine pro Well.

Füllen Sie als Nächstes die Brunnen bis knapp unter den oberen Rand des Brunnens mit Wasser, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen. Lagern Sie die Platten eine Stunde lang bei 28 Grad Celsius. Legen Sie die Platte in eine Aufnahmekammer, die mit einer Infrarot-Digitalkamera ausgestattet ist, die Larven im Dunkeln erkennen kann.

Zirkadiane Rhythmen und äußere Umweltreize können das Schwimmverhalten von Zebrafischen erheblich beeinflussen. Die Tageszeit und die Lichtverhältnisse müssen standardisiert und die Wassertemperatur streng reguliert werden. Starten Sie die Software und wählen Sie das Tracking-Modul aus.

Klicken Sie unter Datei auf Neues Protokoll generieren und bearbeiten Sie die Anzahl der für das Experiment verwendeten Wells, in diesem Beispiel 48. Klicken Sie anschließend auf Parameter und wählen Sie Protokollparameter und dann Zeit, um die Experimentdauer und den Integrationszeitraum auf 10 Minuten festzulegen. Klicken Sie außerdem in den Protokollparametern auf Optionen, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für das Numeroskop aktiviert ist.

Um die Aufzeichnungsbereiche festzulegen, markieren Sie das gesamte Raster und doppelklicken Sie auf eine der Vertiefungen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bereiche zeichnen, zeichnen Sie um die oberen linken, oberen rechten und unteren linken Vertiefungen und klicken Sie auf Erstellen. Die Software bestimmt dann die Position jedes Wells.

Zeichnen Sie an dieser Stelle auch die Maßstabsleiste ein und klicken Sie auf Auf Gruppe anwenden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Bereiche zeichnen. Wählen Sie als Nächstes die Farbe des Fisches aus, die in diesem Fall schwarz ist, und schieben Sie die Erkennungsschwellenleiste auf eine Ebene, auf der nur die Fischbewegungen ohne Hintergrund hervorgehoben werden.

Geben Sie Bewegungsschwellen ein, um Inaktivität und kleine, vergrößerte Bewegungen zu erkennen. In diesem Beispiel wurde ein Inaktivitätsschwellenwert von sechs Millimetern pro Sekunde und ein Aktivitätsburstschwellenwert von 30 Millimetern pro Sekunde verwendet. Klicken Sie auf das Menü "Parameter" und dann auf "Light Driving"-Einstellungen und stellen Sie die Lichtintensität der Kammer auf 0 % ein, schließen Sie die Klappe der Aufnahmekammer und starten Sie die Videoaufnahme.

Das Experiment ist in 10 Minuten abgeschlossen, wie durch den Timer auf dem Bildschirm angezeigt. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf das Dropdown-Menü Experiment und wählen Sie Stopp aus. Es wird ein Dialogfeld mit den Ergebnissen angezeigt.

Um die Ergebnisse mit Excel zu überprüfen, klicken Sie auf Enthaltenden Ordner öffnen und öffnen Sie die Datei, die im resultierenden Ordner angezeigt wird. Schließlich kann das Video abgespielt werden, um zu überprüfen, ob die aufgezeichneten Fortbewegungswerte die Schwimmbewegungen der Fische genau wiedergeben. Dies kann erreicht werden, indem die in der Videodatei beobachtete Bewegung mit dem von der Software generierten Fortbewegungsprofil verglichen wird.

Schnappschussbilder eines Zebrafischembryos, die während eines berührungsevozierten Assays aufgenommen wurden, zeigen die typische Bewegung eines Individuums in den ersten 0,2 Sekunden nach Anwendung des Stimulus. Hier zeigt die Abbildung ein Beschleunigungsprofil für die ersten 0,2 Sekunden der Fluchtreaktion beim Burst-Schwimmen bei Wildtyp- und myopathischen Individuen. Es wurde beobachtet, dass die Beschleunigung bei beiden Stämmen in diesem Zeitfenster ihren Höhepunkt erreichte, und die maximale Spitzenbeschleunigung ist proportional zur Krafterzeugungskapazität des Skelettmuskels.

maximalen Beschleunigungswerte wurden für den Wildtyp und die myopathischen Stämme gemittelt. Die myopathischen Fische zeigten eine signifikante Abnahme der maximalen Beschleunigung, was auf eine verminderte Muskelfunktion hinweist. 10-minütige Lokomotionstests von Embryonen erfassten die Bewegungsmuster und -typen sowohl von Wildtyp- als auch von myopathischen Embryonen und erzeugten diagrammatische Darstellungen von Schwimmbewegungen.

Perioden langsamer Bewegung, dargestellt durch grüne Linien und schnelle Bewegungen, dargestellt durch rote Linien, wurden ebenso kartiert wie Perioden der Inaktivität, dargestellt durch schwarze Linien. Wildtyp-Individuen zeigten ein hohes Aktivitätsniveau mit relativ keinen inaktiven Perioden, im Gegensatz zu den myopathischen Individuen, die während des Testzeitraums weniger aktiv waren. Dies spiegelte sich in signifikanten Unterschieden in der durchschnittlichen Anzahl der Bewegungen und der zurückgelegten Strecke des Wildtyps im Vergleich zu myopathischen Fischen wider.

Nach der Beherrschung kann der Assay für die berührungsevozierte Reaktion in 15 Minuten für 15 Fische und der Lokomotions-Assay in etwa 10 Minuten für bis zu 48 Fische durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Embryonen vorsichtig zu behandeln, da dies ihre Aktivität beeinträchtigen kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Techniken wie Immunmarkierung oder Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit der Muskelpathologie zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Muskelleistung in der frühen Entwicklung von Zebrafischen misst.