Name: Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der Muskelleistung in Zebrabärblingen mittels Berührungsreaktions- und Schwimmtests. Diese automatisierte Hochdurchsatzmethode ermöglicht die Untersuchung neuromuskulärer Funktionen.

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Wir danken Viewpoint für die freundliche Unterstützung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch einen Project Grant (APP1010110) des Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) finanziert.

1. Berühren-evozierten Reaktion Assay <ol><li> Herstellung von 2 dpf Embryonen für Touch-evozierten Reaktion Assay <ol><li> Sicherzustellen , dass die Zeit des Tages , an dem der Test durchgeführt wird , konsistent zwischen den Experimenten, weil Aktivität dramatisch ganzen Tag 17,18 variieren. HINWEIS: Das Experiment ist blind durchgeführt werden, und die Reihenfolge der Tests randomisierten experimentellen Artefakte zu minimieren. </li><li> die Fische zuweisen Stämme eine Nummer, die dem einzelnen nicht bekannt ist, das Experiment durchgeführt wird. Im Anschluss daran mit frei verfügbaren Online-Tools, um eine zufällige Liste erzeugen, die die Reihenfolge der Prüfung vorschreibt. </li><li> Mindestens eine Stunde vor der Prüfung dechorionate Embryonen, die durch ein Loch in der Chorion-Ripping und sanft das Chorion Auseinanderziehen einer feinen Pinzette verwenden. Entfernen Sie die Verschmutzungen aus der Petrischale vor ° C Inkubator zum 28 zurückkehrt. </li></ol></li><li> Performing-Touch-evozierten Reaktion Assay <ol><li> wärme~~POS=TRUNC stage bis 28 ° C mindestens 15 min vor dem Test zu beginnen. HINWEIS: In dieser Phase wird die Temperatur gesteuert und wird bei 28 bleiben &#160; ° C für die Dauer des Tests. Temperatur Aktivität beeinflussen und es ist daher wichtig, eine konstante Temperatur zu halten. Wenn ein erwärmtes Stufe nicht verfügbar ist, dann sollte die Temperatur des Wassers überwacht werden, und alle Versuche sollten bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie eine Petrischale gefüllt mit Embryo Medium (5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 in Wasser) auf einer beleuchteten Bühne und montieren Sie die High-Speed - Kamera über die Petrischale. </li><li> Starten Sie die Videokamera-Aufnahme-Software (wie Stream Pix 5, hier beschrieben) und unter dem &quot;Arbeitsplatz&quot; wählen Sie die Registerkarte 1.000 Bilder pro Sekunde (1000 fps) als die Aufnahmegeschwindigkeit, die eine schnelle Schwimmverhalten der Fische zu gewährleisten, wird aufgezeichnet. </li><li> Arbeiten mit einem Embryo in einer Zeit, legen Sie den Embryo in middle der Petrischale mit der Zebrabärbling deutlich sichtbar in dem Sichtfeld. HINWEIS: Wenn der Embryo vor schwimmt weg von dem Experiment zu Beginn der Bauarbeiten mit einem anderen zu ersetzen, wie zurückzuerobern und die Positionierung des Embryos führen kann es auf den Reiz desensibilisiert werden und wiederholt Burst Antworten Muskelschwäche in einigen Krankheitsmodellen fördern kann. </li><li> Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf den &quot;Record&quot; Button klicken und liefern die mechanosensorischen Reiz auf den Embryo durch sie vorsichtig mit einer stumpfen Nadel auf der Oberseite des Kopfes zu berühren. </li><li> Beenden Sie die Aufnahme, nachdem der Embryo aus dem Sichtfeld oder wieder in Ruhe geschwommen. HINWEIS: Die Beschleunigungsspitzen innerhalb der ersten 0,2 Sekunden des Burst-Fluchtreaktion im Anschluss an die mechanischen Reiz. Daher sicher, dass zumindest während der ersten 0,2 Sekunden der Fluchtreaktion der Aufnahme die Fische im Blickfeld ist. Verwendung der Software in Schritt 1.2.3 beschrieben, werden die Daten automatisch gespeichert werdenals .avi Videodatei. Alternative Video-Capture-Software wie Free Video Capture oder Softonic, die beide frei zum Download verfügbar sind, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Bringen Sie den Embryo in eine neue Petrischale und wählen Sie einen anderen Embryo zum Testen. Führen Sie die Tests auf mindestens 15 Fische. </li></ol></li><li> Die Quantifizierung der Schwimmverhalten <ol><li> Um das Schwimmverhalten zu quantifizieren, starten Sie die Software und wählen Sie die &quot;Single Larvae Locomotion ohne Untergrundsubtraktion&quot; Modul zu öffnen Sie das gespeicherte Video in .avi - Datei. </li><li> Mit Hilfe der &quot;freihändig&quot; oder &quot;Polygon&quot; Werkzeug aus der Menüleiste wählen Sie Bereiche des Films für die Analyse verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Region umfasst sowohl die ursprüngliche Position der Fische und die Gegend, dass die Fische schwimmen in wird. Stellen Sie sicher, dass die Sonde aus dem Bereich ausgeschlossen ist, analysiert werden. Die Software wird die Flugbahn des Fisches im gewünschten Bereich automatisch zu verfolgen. </li><li> Zur Durchführung ter Analyse, klicken Sie auf &quot;Experiment&quot; in der Menüleiste und wählen Sie &quot;Ausführen&quot;. Wenn aufgefordert , die Rohdaten Analysedatei (.phr Format) in der gewünschten Position zu speichern. Einmal gespeichert, klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Analyse zu beginnen. Beenden Sie die Analyse durch einen Klick auf &quot;Stop&quot; unter dem &quot;Experiment&quot; Drop-Down-Menü. Ein Fenster mit den Ergebnissen wird angezeigt. </li><li> Blättern Sie nach rechts, um die &quot;maximale Beschleunigung&quot; Wert zu erhalten. Falls gewünscht, können diese Daten exportieren, indem Sie das Ergebnisfenster zu schließen und auf den &quot;Export sofortige Ergebnisse&quot; -Knopf unter &quot;Ergebnisse&quot; im Dropdown-Menü klicken. Wählen Sie die entsprechende Rohdaten Analysedatei, und klicken Sie auf Open. Eine Textdatei, die in einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden kann, wird im Zielordner gespeichert werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden einzelnen Fisch und durchschnittlich die mittlere maximale Beschleunigung für jeden Stamm zu erhalten (siehe Abbildung 1). HINWEIS: Als Alternative zu using die hier beschriebene Software, ähnliche Pakete wie die frei verfügbaren ImageJ-Software kann die relevanten Bewegungsdaten zu extrahieren, verwendet werden. Die 3D-Particle Tracker Plugin kann verwendet werden, Schwimmbahnen zu verfolgen. </li></ol></li></ol> 2. Locomotion Assay - 10 min Schwimmtest <ol><li> Herstellung von 6 dpf Embryonen für Schwimmanalyse <ol><li> Falls erforderlich, sort Embryonen für die gewünschte Genotyp, beispielsweise durch Expression eines fluoreszierenden Proteins oder durch Phänotyp untersucht, und in einen separaten Petrischale (25-30 Embryonen pro Schale). Alternativ kann der Genotyp nach Beendigung der Fortbewegung Assay bestimmt werden. </li><li> Bei 3 dpf, erneut zu prüfen, Petrischalen und entfernen Sie alle nicht geschlüpften Embryonen und Schutt. Rückpetrischalen auf 28 ° C Inkubator bis 6 dpf. </li><li> Führen Sie die Tests aller Stämme von 9.00 bis 12.00 Uhr, die die Zeit ist, bei der Zebrabärblingembryonen am aktivsten sind. Randomisieren die Reihenfolge des Testens und der Position in der pEnde von Wildtyp und Mutante Proben, die die Auswirkungen der zirkadianen Unterschiede und andere experimentelle Bias zu minimieren. Hinweis: Es ist wichtig, daß die Testzeit zwischen den Experimenten konsistent ist, weil Aktivität dramatisch während des Tages variieren. </li><li> Mindestens 30 Minuten vor der Prüfung statt Larven in einer 48-Well-Platte mit einer Larve pro Vertiefung. Nach der Übertragung füllen die Vertiefungen, so dass die Wasseroberfläche knapp unter dem oberen Ende des Bohrloches ist, um sicherzustellen, gibt es keine Blasen. Rückplatten bis 28 ° C Inkubator. </li><li> im Licht für fünf Minuten vor dem Test nehmen Platten aus dem Inkubator und akklimatisieren. </li></ol></li><li> Durchführen von Locomotion Assay <ol><li> Platzieren Sie die 48-Well-Platte in die Aufzeichnungskammer, die mit einer Infrarot-Kamera ausgestattet ist, die Erfassung von bis zu 60 Bildern / sec, so daß Larven im Dunkeln erkannt werden. Prüfen, ob alle der Vertiefungen im Inneren des kreisförmigen Gitters auf der Lokomotion Software gesetzt und dass alle Larven CLEarly nachweisbar. </li><li> Starten Sie die Software und wählen Sie das &quot;Tracking&quot; Modul. Unter &quot;Datei&quot; klicken Sie auf &quot;generieren neue Protokoll&quot; und die Anzahl der Brunnen für das Experiment verwendet bearbeiten. Stellen Sie sowohl die Versuchsdauer und der Integrationsperiode bis 10 min durch einen Klick auf den &quot;Parameter&quot; Drop-Down-Menü und die Auswahl der &quot;Protokollparameter&quot; und anschließend die &quot;Zeit&quot; aus. Auf der gleichen &quot;Protokollparameter&quot; Dialogfenster klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Optionen&quot; und stellen Sie sicher das &quot;Numeriscope&quot;, um folgende geklickt wird, das kann der &quot;Protokollparameter&quot; Dialogfeld geschlossen werden. </li><li> So stellen Sie die Aufnahmebereiche das gesamte Raster und klicken Sie doppelt auf einen der Brunnen hervorzuheben. Klicken Sie auf die &quot;ziehen Bereiche&quot; und ziehen um die oben links, oben rechts und unten links Brunnen und klicken Sie auf &quot;Build&quot;, das die Software die Position jeder Vertiefung automatisch bestimmen können. zeichnen sich auch in einer SkalaLeiste und klicken Sie auf &quot;gelten Gruppe&quot;. Einmal abgeschlossen, klicken Sie auf den &quot;ziehen Bereichen&quot; -Taste. </li><li> bestimmen visuell Detektionsschwelle durch die &quot;Detektionsschwelle&quot; bar auf ein Niveau Gleiten, bei dem nur die Fischbewegungen ohne Hintergrundsignale werden hervorgehoben. HINWEIS: Die Detektionsschwelle zwischen den Stämmen und somit müssen die Schwellenwerte festgelegt werden, wann immer ein neuer Stamm getestet variieren. In der repräsentativen Daten, die eine Detektionsschwelle von 25 mm vorgestellt / s verwendet wurde. </li><li> Vor Beginn der Prüfung eingeben Bewegung Schwellen für die Erkennung von Inaktivität, und kleine und große Bewegungen. HINWEIS: Bei der repräsentativen Daten, die eine Inaktivitätsschwelle von 6 mm / s und eine Aktivität platzen Schwelle von 30 mm / s verwendet wurde, vorgestellt. Die Schwellenwerte bestimmen die minimale Bewegung aktiv zu berücksichtigen und das Niveau erforderlich ist, um Burst-Aktivität in Betracht gezogen werden und die Klassifizierung der Tätigkeit in kleine (aktiv erlauben aber unter Burst activity Schwellen) und groß (größer als der Schwellenwert Burst-Aktivität) Bewegungen. Die Schwellenwerte können abhängig von der Aktivität der besonderen Fischstämme analysiert verändert werden. HINWEIS: Obwohl der Test kann in entweder hellen oder dunklen Bedingungen durchgeführt werden, Zebrabärblingembryonen im Dunkeln 18 , aktiver zu sein gezeigt worden sind. </li><li> Stellen Sie die Lichtintensität innerhalb der Kammer bei 0% liegen, indem Sie auf die &quot;Lichtfahr Einstellungen&quot; Taste unter dem &quot;Parameter&quot; klicken Dropdown-Menü. Auf dem resultierenden Dialogfeld, fügen Sie die erforderlichen Lichteinstellungen. HINWEIS: Die Lichtintensität innerhalb der Kammer kann ausgelöst werden, zum Ein- und Ausschalten während der Testzeit Larven Aktivität zu stimulieren </li><li> Schließen Sie die Tür des Aufzeichnungskammer und Videoaufnahme zu starten. </li></ol></li><li> Die Quantifizierung der Schwimmverhalten <ol><li> Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, klicken Sie auf &quot;Stopp&quot; unter dem &quot;Experiment&quot; Drop-Down-Menü. Ein Dialog box mit allen Ergebnissen wird angezeigt. </li><li> Für den Zugriff auf diese Ergebnisse in Excel, klicken Sie auf &quot;Übergeordneten Ordner öffnen&quot; und öffnen Sie die Excel-Datei, die in dem resultierenden Ordner angezeigt wird. Die wichtigen Parameter sind &quot;smlct&quot; (kleine Bewegung count) &quot;larct&quot; (große Bewegung count) &quot;smldist&quot; (Gesamtstrecke durch die Fische in kleinen Bewegungen abgedeckt) und &quot;lardist&quot; (total durch die Fische zurückgelegte Strecke in große Bewegungen ). HINWEIS: Nach der Aufnahme, gibt die Software auch zwei zusätzliche Ausgabedateien in Form einer .avi - Datei (ein Video von der 10 min Aufzeichnung enthält) und eine .png Bilddatei (eine visuelle Darstellung der Fortbewegung während der 10 - haltigen min Experiment, siehe Abbildung 2). </li><li> Sobald die Bewegungswerte berechnet werden, wiederholen Sie die .avi und PNG - Dateien , ob die Bewegungswerte , um die Schwimmbewegungen des Fisches (siehe Abbildung genau abbilden berechnet Meinung3). HINWEIS: Als Alternative, die Software zu verwenden hier beschriebenen Pakete wie die frei verfügbaren ImageJ Software verwendet werden, können die Bewegungsverhalten zu verfolgen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splice+site+mutation+in+laminin-%CE%B12+results+in+a+severe+muscular+dystrophy+and+growth+abnormalities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43794(2012).</li>
<li>Gupta, V., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+%26+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+BAG3+myofibrillar+myopathy+suggest+a+toxic+gain+of+function+leading+to+BAG3+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).</li>
<li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).</li>
<li>Sztal, T. E., Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+nemaline+myopathy+reveal+a+spectrum+of+nemaline+bodies+contributing+to+reduced+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function.</a> Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).</li>
<li>Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+discovery+and+global+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish.</a> Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).</li>
<li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2005).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. (82), e50925(2013).</li>
<li>Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+measurement+during+contraction+to+assess+muscle+function+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+6-minute+walk+test+as+a+new+outcome+measure+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).</li>
<li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+6-minute+walk+test+and+other+clinical+endpoints+in+duchenne+muscular+dystrophy%3A+reliability%2C+concurrent+validity%2C+and+minimal+clinically+important+differences+from+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study.</a> Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).</li>
<li>Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+of+locomotor+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).</li>
<li>MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+in+larval+zebrafish%3A+Influence+of+time+of+day%2C+lighting+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li>
<li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+dominant+ACTA1+disease+recapitulate+human+disease+and+provide+insight+into+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies.</a> Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).</li>
<li>Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ACTA1+mutation+resulting+in+a+severe+congenital+myopathy+with+nemaline+bodies%2C+intranuclear+rods+and+type+I+fibre+predominance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disord%22%5BJournal%5D)">A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance.</a> Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).</li>
<li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li>
<li>Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+larval+zebrafish%3A+ontogeny+of+body+waves+and+implications+for+locomotory+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development.</a> J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).</li>
<li>Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonia+congenita-associated+mutations+in+chloride+channel-1+affect+zebrafish+body+wave+swimming+kinematics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics.</a> PLoS ONE. 9 (8), e103445(2014).</li>
<li>Moggio, M., Colombo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disease+heterogeneity%3A+a+prognostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Myol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.</a> Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Viele verschiedene Tiermodelle einschließlich Mäuse, Hunde, Zebrabärbling, Fliegen und Würmer haben zu unserem Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen von Muskelerkrankungen beigetragen und bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen unterstützt sie zu bekämpfen. Der Zebrafisch bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung von Muskelerkrankungen. Der Zebrafisch ein genetisch manipulierbar System komplex Muskelmusterungs in einem geeigneten physiologischen Umgebung zu bewerten, die in in vitro Kultursystemen nicht möglich ist. Im Gegensatz zu anderen Wirbeltiermodellen erzeugt die große Anzahl von Fischen, zusammen mit seiner optischen Klarheit, erleichtert die schnelle Hochdurchsatz in vivo chemische und genetische Screening. Hier beschreiben wir die Entwicklung von Zebrabärbling Bewegung Assays ein Hochdurchsatz und automatisierte Verfahren zu schaffen, Muskelleistung während Zebrabärbling Embryonalentwicklung zu beurteilen. Für beide Assays festzustellen, dass zirkadiane Rhythmen quittiert undexterne Reize aus der Umwelt deutlich Zebrabärbling Schwimmverhalten 17,18 beeinflussen. Wiederholtes Testen des gleichen Zebrabärbling wird auch Gewöhnung führen eine Abnahme der Reaktion auf den taktilen Reiz verursacht 23. Daher sollten, um reproduzierbare Ergebnisse zwischen den Experimenten jedes Zebrafischembryo zu erreichen nur einmal getestet werden, die Tageszeit und Lichtbedingungen standardisiert werden sollten, und die Wassertemperatur muss streng reguliert werden. Mit dem Touch-evozierte Analyse bei 2 dpf wir direkt die maximale Beschleunigung eines Bursts Schwimmbewegungen messen können, die zu Muskelkraft proportional ist. Früheren Techniken in Zebrabärbling haben Muskelkraft untersucht , indem beide Enden der Embryonen zu Versuchsanlagen folgenden binden Kontraktion der Muskeln stimuliert wird unter Verwendung eines elektrischen Feldes und die Krafterzeugungsfähigkeit des Muskels 14 gemessen wird . Während dieses Verfahren misst die Kraft Kapazität von t Erzeugungser Larven Muskel, ist es nicht die tatsächliche Kraft messen durch die Larven Muskel erzeugt während des Schwimmens. Wir entwickelten deshalb ein Verfahren, um indirekt die Kraft beurteilen während des normalen Larvenschwimmbewegung erzeugt ein Gesamtmaß der Muskel Gesundheit zu liefern. Die Hochgeschwindigkeits-Videosystem, der fähig ist mit einer Bildrate von 1.000 Frames einzelnen Zebrabärbling Bewegungen Aufzeichnung / sec verwendet werden können kleine, aber signifikante Unterschiede in der Muskelfunktion, die nicht direkt durch unterscheidbare Auge zu identifizieren. Es wird interessant sein zu sehen, wie zuvor Änderungen berichtet in elektrisch stimulierte Kraft-Generation mit Veränderungen in der Schwimmleistung korrelieren. Darüber hinaus evoziert die Touch - Reaktion Assays können auch eine quantitative Messung des Bewegungsverhaltens zu geben Schwimmkinematik, wie die Form und die Geschwindigkeit der Körperwelle während der Schwimmbewegung 24, zu beurteilen , verwendet werden. Aufgrund der spontanen Bewegung zebrafish Larven nach 3 dpf, waren wir die berührungs evozieren Tests durchzuführen, um zu messen Muskelfunktion nicht in der Lage. Im Gegensatz dazu messen wir die Muskelleistung über einen längeren Zeitraum, indem der Abstand geschwommen von Zebrabärblingembryonen bei 6 dpf zu bestimmen. Dieser Test, obwohl ein indirektes Maß für die Muskelfunktion, kann verwendet werden , Fisch Anzeige beeinträchtigter Muskelleistung 8 oder Neurodegeneration 25,26 zu identifizieren. Dieser Test liefert nicht nur eine Messung analog zum 6 min - Gehtest , sondern eignet sich auch für die automatisierte Hochdurchsatz - in - vivo - Arzneimittel oder Mutagenese - Bildschirme.

Während des letzten Jahrzehnts Zebrabärbling zunehmend verwendet worden, um Muskel Zellbiologie und der Krankheit zu untersuchen. Die rasche Entwicklung der externen Zebrafischembryo, gekoppelt mit seiner optischen Klarheit, ermöglicht die direkte Visualisierung der Muskelbildung, Wachstum und Funktion. Der Prozess der Entwicklung der Muskulatur ist stark in Zebrabärbling konserviert und dies hat die erfolgreiche Modellierung einer Reihe von Muskelerkrankungen einschließlich Muskeldystrophien und angeborenen Myopathien 1-8 erlaubt. Detaillierte Prüfung von Zebrabärbling Modelle hat nicht nur neue Einblicke in die Pathobiologie dieser Bedingungen zur Verfügung gestellt , sondern auch eine Plattform für die Erprobung geeigneter Therapien 6,9-13 zur Verfügung gestellt. Die Analyse der Zebrabärbling Modelle von Muskelerkrankungen beruht auf zuverlässige und reproduzierbare Tests Muskelleistung zu messen. Frühere Studien haben erfolgreich die Krafterzeugungsfähigkeit des Zebrabärbling Rumpfmuskulatur in Fisch zwischen 3 und 7 dpf gemessenelektrisch stimulieren Kontraktion eines mit einem Kraftübertragungssystem 14 angebracht immobilisiert Fisch. Dies kann detaillierte Messungen von Kraft zur Verfügung stellen, sind jedoch nicht ideal für einen höheren Durchsatz Experimente geeignet und gibt es Vorteile für die Muskelleistung Messung während des Schwimmens. Bei 2 dpf Zebrabärbling Muskel ist voll funktionsfähig und die Fische können platzen Schwimmbewegungen als Reaktion auf Reize hervorzurufen. Die berührungs evozieren Fluchtreaktion-Assay wird verwendet, Beschleunigung zu messen, während eines Bursts Schwimmbewegung, die als Maß für die Kontraktionskraft verwendet werden kann. Eines der am meisten verwendeten Maßnahmen der Muskelfunktion in Myopathie - Patienten ist die 6 min - Gehtest, die die Gesamtstrecke ging auf einer harten , flachen Oberfläche 15,16 aufzeichnet. Wir haben einen vergleichbaren Test zur Messung der Muskelfunktion in 6 dpf Zebrabärblingembryonen angewandt, wobei wir die gesamte Strecke geschwommen, und die Gesamtzahl der Bewegungen von jeder Larve über einen Zeitraum von 10 Minuten gemacht überwachen. Dies wird durchgeführt,unter Verwendung eines automatischen Verfolgungssystem, das zuverlässig und mit hoher Durchsatzmessungen von Muskelleistung liefert. Beide Muskeltests sind in hohem Maße reproduzierbar und verwendet wurden Unterschiede in der Muskelleistung in Zebrabärbling Myopathie Modelle 8 zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1' Blunt Needle</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Platten</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petrischalen</td><td>Pacific Laboratory Products PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitskamera</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>Schritte 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpipette</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>Step 1.2.3</td></tr><tr><td>Temperiergerät</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, Style 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox System</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint</td><td></td><td>Schritte 1.3.1, 2.2.1</td></tr></tbody></table>

mit touch-evozierte reaktion und locomotion assays zur beurteilung der muskelleistung und funktion in zebrabärbling

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrabärbling Muskelentwicklung ist mit Säugetiersystemen hoch konserviert sie ein hervorragendes Modell macht die Muskelfunktion und Krankheit zu untersuchen. Viele Myopathien der Skelettmuskelfunktion beeinträchtigen können schnell und einfach über die ersten paar Tage der Embryonalentwicklung in Zebrabärbling beurteilt werden. Mit dem 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), Wildtyp- Zebrabärbling Vertrag spontan ihre Schwanzmuskeln und um 48 HPF, Zebrabärbling Ausstellung kontrollierten Schwimmverhalten. Verringerung der Häufigkeit von oder andere Veränderungen in, können diese Bewegungen eine Skelettmuskelfunktionsstörung hinweisen. Um Schwimmverhalten zu analysieren und die Muskelleistung in frühen Zebrabärblingentwicklung beurteilen zu können, nutzen wir beide Touch-evozierte Fluchtreaktion und Lokomotion Assays. Touch-evozierte Fluchtreaktion Assays können verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit der Muskulatur während der kurzen Burst Bewegungen beurteilen aus Kontraktion der Fast-Twitch-Muskelfasern. Als Reaktion auf einen externen Stimulus, der in diesem Fall ein Antippender Kopf, Wildtyp- Zebrabärbling bei 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) weisen typischerweise eine leistungsstarke Burst schwimmen, durch scharfe Kurven begleitet. Unsere Methode quantifiziert Skelettmuskelfunktion durch die maximale Beschleunigung während einer Burst-Schwimmbewegung zu messen, die Beschleunigung auf die Kraft direkt proportional durch Muskelkontraktion erzeugt. Im Gegensatz dazu Lokomotion Tests während der frühen Zebrabärbling Larvenentwicklung verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit der Muskulatur während anhaltender Perioden der Muskelaktivität zu bewerten. Verwendung eines Verfolgungssystems Schwimmverhalten zu überwachen, wurde eine automatisierte Berechnung der Häufigkeit der Anwendung und Entfernung in 6 Tage alten Zebrafisch, reflektierendes ihrer Skelettmuskelfunktion erhalten. Messungen der Schwimmleistung sind wertvoll für die phänotypischen Bewertung von Krankheitsmodellen und Hochdurchsatz-Screening von Mutationen oder chemischen Behandlungen Skelettmuskelfunktion zu beeinflussen.

Touch evozierten Reaktion Assay verwendet werden, können die Geschwindigkeit und Beschleunigung der Schwimmbewegungen zu bestimmen, die ein proportionales Maß an Muskelkraft. Als Reaktion auf einen mechanischen Reiz, wie ein kleiner Klaps auf den Kopf 2 dpf Wildtyp Zebrabärbling zeigen eine schnelle Schwimmbewegungen. Tg (ACTA1 D286G -eGFP), ein Modell von nemaline Myopathie , die erhebliche Muskelschwäche zu haben, und ein Modell der Duchenne - Muskeldystrophie , bei denen schwere Muskeldefekten hat sich gezeigt , beschrieben wurden: Videos wurden für zwei verschiedene Zebrabärbling Myopathie Modelle erfasst und analysiert bei 5 dpf 19,20. Bilder aus einem Video eines typischen Touch evozierte Assays sind in 1A dargestellt. Beschleunigung der Zebrabärbling wurde innerhalb der ersten 0,2 Sekunden des Bursts swimming Fluchtreaktion (1B) zu Spitze untersucht und festgestellt. Dieser Peak maximaler Beschleunigung liefert ein Maß, das der Kraft proportional ist, generating Kapazität der Skelettmuskulatur. Die maximale Beschleunigungswerte wurden gemittelt , um eine mittlere maximale Beschleunigungswert (± Standardfehler des Mittelwerts) für jeden Stamm zu erhalten: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): Mittelwert = 276,0 ± 28,8 m / s 2, n = 3 unabhängigen Wiederholungsversuchen umfassend 15 einzelne Fische; Wildtyp - Steuerung: Mittelwert = 500,8 ± 50,28 m / sec 2, n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen mit 15 einzelnen Fische; DMD PC2 - / - Mutante: mean = 249,9 ± 19,1 m / s 2, n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen umfassend 12-19 einzelne Fische; DMD pc2 +/- heterozygote: Mittelwert = 235,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen umfassend 16-27 einzelne Fische; DMD PC2 + / + Wildtyp - Homozygoten: Mittelwert = 230,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen umfassend 8-27 einzelnen Fisch (1C). Wie erwartet, D286 die Tg (ACTA1G -eGFP) Fische wurden eine signifikante Abnahme der maximalen Beschleunigung zu haben , die darauf hindeuteten , reduziert die Muskelfunktion, die mit Maus - Modellen und Patientendaten konsistent ist 8,21,22. Die DMD pc2 - / - Mutante Fische zeigten jedoch keinen Unterschied in der maximalen Beschleunigung, bei 2 dpf, in Übereinstimmung mit der Detektion von Muskeldefekten von 3 dpf 20 (1D). Locomotion Assays wurden bei 6 dpf geführt, um die Aktivität und die Entfernung von swum Zebrabärbling-Stämme als Hinweis auf Muskelleistung zu bestimmen. Nach der Prüfung, eine schematische Darstellung der Schwimmbewegungen während der Testphase von zehn Minuten erzeugt wurde, mit roten und grünen Linien Perioden von langsamen und schnellen Bewegung repräsentieren jeweils und schwarzen Linien , die Perioden der Inaktivität (Abbildung 2). Einzelne Wildtyp- Zebrabärbling zeigen eine hohe Aktivität mit relativ keine Perioden der Inaktivität als opposed an Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Fische, die der Testphase (2B) aktiv sind , weniger über. Das Schwimmverhalten wurde durch Mittelung der einzelnen Werte der Anzahl der Bewegungen und der Abstand swum von jedem Fisch (Abbildung 3) quantifiziert. Sowohl Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Fisch (3A und 3B) und DMD pc2 - / - Mutante Fisch (3C und 3D) wurden eine signifikante Abnahme haben in der mittleren Anzahl von Bewegungen und Entfernung gefunden SWUM im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Fisch: mittlere Anzahl der Bewegungen = 94,3 ± 13,6, Abstand geschwommen = 112,9 ± 18,4 mm, n = 3 unabhängigen Wiederholungsversuchen, die 45 Fische bedeuten; Wildtyp-Kontrollen: mittlere Anzahl der Bewegungen = 177,4 ± 14,0, mittlerer Abstand geschwommen = 300,2 ± 22,8 mm, n = 3 unabhängigen replicate Experimente, die 45 Fische; DMD PC2 - / - Mutante die mittlere Anzahl von Bewegungen = 163,3 ± 30,0, Entfernung geschwommen bedeuten: 298,4 ± 60,37 mm, n = 3 unabhängigen Wiederholungsversuchen umfassend 12-20 Fisch; DMD pc2 +/- heterozygote: mittlere Anzahl der Bewegungen = 362,3 ± 38,8, mittlerer Abstand geschwommen: 660,3 ± 86.1mm n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen umfassend 17-27 Fisch; DMD PC2 + / + Wildtyp - Homozygoten die mittlere Anzahl von Bewegungen = 341,9 ± 91,6, mittlerer Abstand geschwommen = 574,3 ± 170.9mm n = 3 unabhängige Wiederholungsversuchen umfassend 8-25 Fisch. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> Abb . 1: Die Quantifizierung der berührungs evozieren Antwort Assay für 2 dpf Genaktivität (A) Snapshot Bilder eines Steuer Zebrabärbling während berührungs evozieren Assays bei 2 dpf. (B) Beschleunigungsprofil für den ersten 0,2 Sekunden von aEinzel Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (rot) und Einzelkontrolle (blau) Zebrabärbling nach der Anwendung des Berührungsreiz. Die maximale Beschleunigung wird durch die gepunkteten Linien dargestellt. (C, D) Quantifizierung der maximalen Beschleunigung (m / s 2) aufgezeichnet von Touch-evozierten Reaktion Assays von (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Zebrabärbling und (D) DMD PC2 - / - Mutant Fisch im Vergleich Zebrabärbling zu steuern , mit 2 dpf. Die Fehlerbalken stellen ± SEM für drei Wiederholungsexperimenten, * p &lt;0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Darstellung der Lokomotion Assays für Genaktivität (A) sind Genaktivität platziert in 48-Well - Platten und Fortbewegung wird von oben mit einem Infrarot - Digitalkamera aufgenommen. (B) Schematische Darstellung der Zebrabärbling Bewegung während der Testperiode mit roten Linien zeigen schnelle Bewegungen, grüne Linien zeigen langsame Bewegungen und schwarzen Linien Inaktivität darstellt (wie eingegeben durch die Erkennungsschwellen bestimmt in der Software). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">um eine größere Version diese Figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Die Quantifizierung der Lokomotion Assays für 6 dpf Zebrabärblingembryonen Quantifizierung der (A) Anzahl der Bewegungen und (B) Entfernung von Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Zebrabärbling reiste im Vergleich Zebrabärbling zu steuern , mit 6 dpf.Die Quantifizierung der (C) Anzahl der Bewegungen und (D) Entfernung von DMD pc2 gereist - / - Mutant Fisch im Vergleich Zebrabärbling zu steuern , mit 6 dpf. Die Fehlerbalken stellen ± SEM für drei Wiederholungsexperimenten, * p &lt;0,05, ** p &lt;0.01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um Muskelfunktionen und -krankheiten zu untersuchen. Während der frühen Embryogenese beginnen Zebrafische regelmäßige Muskelkontraktionen, die ein rhythmisches Schwimmverhalten erzeugen, das sich verändert, wenn der Muskel gestört wird. Hier beschreiben wir einen berührungsevozierten Reaktions- und Fortbewegungsassay, um die Schwimmleistung als Maß für die Muskelfunktion zu untersuchen.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Muskelkapazität und -funktion bei Zebrafischen mithilfe von Berührungsreiz- und Schwimmtests zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, offene Fragen im Bereich der neuromuskulären Forschung zu klären, beispielsweise durch die Identifizierung eingeschränkter Muskelkapazität oder neurodegenerativer Defekte in Zebrafisch-Krankheitsmodellen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine automatisierte, hochdurchsatzfähige Methode zur Beurteilung der Muskelkapazität in Zebrafisch-Krankheitsmodellen bereitstellt.Um den Assay durchzuführen, stellen Sie eine Petrischale, die mit etwa 25 Milliliter Embryomedium gefüllt ist, auf eine beleuchtete, temperaturgesteuerte Probenebene, die auf etwa 28 Grad Celsius eingestellt ist. Befestigen Sie die Hochgeschwindigkeitskamera über der Schale. Starten Sie die Videoaufnahmesoftware und stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf 1.000 Bilder pro Sekunde ein, um sicherzustellen, dass schnelle Schwimmgeschwindigkeiten erfasst werden können.Platzieren Sie das Embryo in der Mitte der Petrischale, sodass es im Sichtfeld deutlich sichtbar ist. Drücken Sie auf Aufnahme starten und geben Sie dann einen mechanosensorischen Reiz, indem Sie das Embryo vorsichtig mit einer stumpfen Nadel auf dem Kopf berühren. Beenden Sie die Aufnahme, sobald das Embryo das Sichtfeld verlassen hat oder zur Ruhe zurückgekehrt ist.Wiederholen Sie die Untersuchung derselben Larven hauptsächlich aufgrund von Gewöhnungseffekten oder zur Förderung von Muskelschwäche in einigen krankhaften Modellen, was zu einer verminderten Reaktion auf den taktilen Reiz führt; daher sollte jedes Embryo nur einmal getestet werden. Um das Schwimmverhalten zu quantifizieren, starten Sie die Software und wählen Sie die Einzellarven-Lokomotion mit unserem Hintergrundsubtraktionsmodul aus, um die AVI-Videodatei zu öffnen. Wählen Sie das Freihand- oder Polygonwerkzeug aus der Menüleiste und markieren Sie den Bereich des Films, der sowohl die ursprüngliche Position des Fisches als auch den Bereich umfasst, zu dem er schwimmt, wobei die Sonde, die zur Applikation des mechanosensorischen Reizes verwendet wird, ausgeschlossen bleibt.Klicken Sie in der Menüleiste auf Experiment und wählen Sie Ausführen. Speichern Sie die Rohdatenanalyse-Datei im PHR-Format an einem gewünschten Ort, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie anschließend auf Start, um die Analyse zu beginnen.Sobald der Fisch außerhalb des Sichtfeldes geschwommen ist oder der Videoclip beendet ist, beenden Sie die Analyse, indem Sie im Experiment-Menü auf „Stop“ klicken. Ein Fenster mit den Ergebnissen wird angezeigt. Blättern Sie in diesem Fenster nach rechts, um den maximalen Beschleunigungswert abzulesen. Exportieren Sie die Daten, indem Sie im Dropdown-Menü „Ergebnisse“ die Schaltfläche „Instantanergebnisse exportieren“ anklicken.Wählen Sie die geeignete Rohdaten-Analyse-Datei aus und klicken Sie auf Öffnen. Dadurch wird eine Textdatei im Zielordner gespeichert, die in einem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden kann. Geben Sie die Testlarven einzeln in eine 48-Well-Platte, jeweils eine pro Mulde.Füllen Sie die Vertiefungen anschließend mit Wasser bis knapp unter den Rand, wobei sicherzustellen ist, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Lagern Sie die Platten eine Stunde lang bei 28 Grad Celsius. Stellen Sie die Platte in eine Aufnahmekammer, die mit einer digitalen Infrarotkamera ausgestattet ist und Larven im Dunkeln detektieren kann.Circadiane Rhythmen und äußere Umweltreize können das Schwimmverhalten von Zebrafischen erheblich beeinflussen. Tageszeit und Lichtbedingungen müssen standardisiert sowie die Wassertemperatur eng geregelt werden. Starten Sie die Software und wählen Sie das Tracking-Modul aus.Unter „Datei“ auf „Neues Protokoll generieren“ klicken und die Anzahl der für das Experiment verwendeten Vertiefungen bearbeiten, im vorliegenden Beispiel 48. Danach auf „Parameter“ klicken, „Protokollparameter“ auswählen und unter „Zeit“ die Versuchsdauer sowie den Integrationszeitraum auf 10 Minuten festlegen. Gehen Sie erneut zu „Protokollparameter“, klicken Sie auf „Optionen“ und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für numeroscope aktiviert ist.Um die Aufnahmebereiche festzulegen, markieren Sie das gesamte Raster und doppelklicken Sie auf einen der Wells. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bereiche zeichnen und zeichnen Sie um die obere linke, obere rechte und untere linke Welle herum und klicken Sie auf Erstellen. Die Software ermittelt dann die Position jedes Wells.Zu diesem Zeitpunkt ebenfalls den Maßstabsbalken einzeichnen und auf „Auf Gruppe anwenden“ klicken. Sobald dies abgeschlossen ist, auf die Schaltfläche „Bereiche zeichnen“ klicken. Als Nächstes die Farbe des Fisches auswählen, in diesem Fall Schwarz, und den Schieberegler für die Erkennungsschwelle auf einen Wert einstellen, bei dem ausschließlich die Bewegungen des Fisches hervorgehoben werden, ohne Hintergrund.Geben Sie Bewegungsschwellen zur Erkennung von Inaktivität und kleinen sowie verstärkten Bewegungen ein. In diesem Beispiel wurden eine Inaktivitätsschwelle von sechs Millimetern pro Sekunde und eine Aktivitätsschwellen-Burst von 30 Millimetern pro Sekunde verwendet. Klicken Sie auf das Menü „Parameter“, dann auf „Lichtsteuerungseinstellungen“ und stellen Sie die Lichtintensität der Kammer auf 0 % ein. Schließen Sie die Tür der Aufnahmekammer und beginnen Sie mit der Videoaufnahme.Das Experiment wird in 10 Minuten abgeschlossen sein, wie der Timer auf dem Bildschirm anzeigt. Sobald es abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Dropdown-Menü Experiment und wählen Sie Stoppen. Ein Dialogfeld mit den Ergebnissen wird angezeigt.Um die Ergebnisse mit Excel zu überprüfen, klicken Sie auf „Öffne enthaltenden Ordner“ und öffnen Sie die Datei, die im resultierenden Ordner erscheint. Abschließend kann das Video erneut abgespielt werden, um zu überprüfen, ob die aufgezeichneten Bewegungswerte die Schwimmbewegungen der Fische korrekt widerspiegeln. Dies kann erreicht werden, indem die im Videodatei beobachtete Bewegung mit dem vom Software generierten Bewegungsprofil verglichen wird.Schnappschussaufnahmen eines Zebrafischembryos aus einem Berührungs-Test zeigen die typische Bewegung eines Individuums während der ersten 0,2 Sekunden nach Reizgabe. Hier zeigt die Abbildung ein Beschleunigungsprofil für die ersten 0,2 Sekunden der Fluchtreaktion durch kurzes, intensives Schwimmen bei Wildtyp- im Vergleich zu myopathischen Individuen. In diesem Zeitfenster wurde bei beiden Stämmen ein Beschleunigungsmaximum beobachtet, wobei die maximale Spitzengeschwindigkeit proportional zur Kraftentfaltungsfähigkeit der Skelettmuskulatur ist.Die maximalen Beschleunigungswerte wurden für den Wildtyp und die myopathischen Stämme gemittelt. Die myopathischen Fische zeigten eine signifikante Abnahme der maximalen Beschleunigung, was auf eine verminderte Muskel funktion hindeutet. Zehnminütige Lokomotionsassays von Embryonen erfassten die Bewegungsmuster und -typen sowohl von Wildtyp- als auch von myopathischen Embryonen und erzeugten diagrammatische Darstellungen der Schwimm bewegungen.Phasen mit langsamer Bewegung, dargestellt durch grüne Linien, und schnelle Bewegung, dargestellt durch rote Linien, wurden ebenso erfasst wie Phasen der Inaktivität, dargestellt durch schwarze Linien. Wildtyp-Individuen zeigten hohe Aktivitätsniveaus mit relativ wenigen inaktiven Phasen, im Gegensatz zu den myopathischen Individuen, die während des Testzeitraums weniger aktiv waren. Dies spiegelte sich in signifikanten Unterschieden bei der durchschnittlichen Anzahl von Bewegungen und der zurückgelegten Distanz zwischen Wildtyp- und myopathischen Fischen wider.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann der berührungsevokierte Reaktionstest innerhalb von 15 Minuten an 15 Fischen durchgeführt werden, und die Lokomotionsassays können bei bis zu 48 Fischen innerhalb von etwa 10 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist sorgfältiges Handling der Embryonen wichtig, da dies ihre Aktivität beeinflussen könnte. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Techniken wie Immunfärbungen oder die Elektronenmikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zur Muskelpathologie zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Muskelaktivität in der frühen Entwicklung von Zebrafischen gemessen werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Dieses Video beschreibt den Tast-Evoke-Response-Assay, der die Reaktion der Zebrafischlarve auf Berührungsreize misst.

Escape Response Assay: Eine Methode zur Untersuchung der Reaktion von Zebrafischlarven auf Berührungsreize

Das Video beschreibt die Vermeidung und den Thigmotaxis-Assay von Zebrafischlarven. Das Video untersucht das Verhalten von Zebrafischlarven als Reaktion auf visuelle aversive Reize.

Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Der erwachsene Zebrafisch ist in der Lage, sich nach einer Rückenmarksverletzung funktionell zu erholen und ist ein erstklassiges Modellsystem zur Aufklärung der angeborenen Mechanismen der neuronalen Regeneration. Hier beschreiben wir Schwimmausdauer- und Schwimmverhaltensassays als funktionelle Auslesungen der Rückenmarksregeneration.

Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Erfahren Sie die Bewertung der Muskelleistung in Zebrabärblingen mittels Berührungsreaktions- und Schwimmtests. Diese automatisierte Hochdurchsatzmethode ermöglicht die Untersuchung neuromuskulärer Funktionen.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

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