Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, lebensfähige zirkulierende Tumorzellen (CTCs) aus Vollblut effektiv zu erfassen. Diese CTCs können in Kultur gegeben oder für nachgelagerte Analysen verwendet werden, bei denen nicht fixierte Proben erforderlich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Metastasierung zu beantworten.

Es kann auch verwendet werden, um das Fortschreiten der Krankheit, das Ansprechen auf die Therapie und das Risiko eines erneuten Auftretens zu bewerten. Der Vorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, lebensfähige CTCs aus jedem soliden Tumor markierungsfrei zu erfassen und gleichzeitig unabhängig von der Biomarker-Expression zu bleiben. Wir hatten zuerst die Idee, CTCs aus dem Filter freizusetzen, weil wir eine nachgeschaltete RNA-Analyse und Kultivierung von CTCs durchführen wollten, anstatt sie in-situ auf dem Filter zu kultivieren.

Zu Beginn des Experiments wird so viel PIPAAm gewiegt, dass eine Lösung mit 10 Gew.-% pro Volumen in einem 15-Milliliter-Röhrchen hergestellt wird, die Butanol enthält. Wirbeln Sie das Röhrchen vor, bis die Lösung klar ist. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere Objektträger aus Kunststoff in etwa 12 Millimeter x 12 Millimeter große Quadrate.

Schneiden Sie dann mit einer scharfen Schere mit geraden Kanten einen schlitzporigen Mikrofilterwafer in acht Millimeter mal acht Millimeter große Quadrate und platzieren Sie diese Stücke direkt auf den Kunststoffquadraten. Befestigen Sie die geschnittenen Filter mit einem Polyimid-Folienband auf den Kunststoffquadraten, nur am Rand und an der Ecke des Filters, so dass mindestens sieben Millimeter x sieben Millimeter Filterfläche nicht vom Band verdeckt wird. Setzen Sie den Mikrofilter, der auf dem Kunststoffquadrat befestigt ist, auf das Vakuumfutter des Spin Coaters.

Programmieren Sie den Schleudercoater nach folgendem Rezept. Geben Sie dann mit einer Standard-Transferpipette aus Kunststoff genügend 10 % Gewicht pro Volumen PIPAAm-Lösung ab, um die Mikrofilteroberfläche vollständig zu bedecken und den Schleudercoater zu starten. Nachdem die Beschichtung abgeschlossen ist, nehmen Sie den PIPAAm-beschichteten Mikrofilter aus dem Spin-Coater und lassen Sie den Filter während der Lagerung am Kunststoffquadrat befestigt.

Fahren Sie mit der Filtrationskassette fort und rehydrieren Sie den PIPAAm-beschichteten Mikrofilter bei Raumtemperatur, indem Sie den Mikrofilter in eine Petrischale legen. Fügen Sie 1X PBS hinzu, bis der Mikrofilter vollständig eingetaucht ist. Lösen Sie nach dem Hydratationsschritt den Filter vom Kunststoffquadrat, indem Sie das Polyimidfolienband vom Filter abziehen oder abschneiden.

Bauen Sie anschließend den Mikrofilter in die Filterkassette ein, indem Sie den Mikrofilter zwischen dem oberen und unteren Acrylstück entlang der PDMS-Teile platzieren, die als Dichtung dienen. Klemmen Sie dann die Acrylkassette mit Klammern fest, um den Filter zu sichern und eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Erwärmen Sie drei Milliliter des Zellkulturmediums von McCoy auf 37 Grad Celsius.

Geben Sie 7,5 Milliliter Hanks ausgewogene Salzlösung oder HBSS zu der 7,5 Milliliter Blutprobe und aspirieren Sie dieses verdünnte Blut in eine 25-Milliliter-Spritze. Nachdem Sie die Oberseite der Kassette identifiziert haben, greifen Sie die Filterkassette mit der Spritze ein und setzen Sie sie auf die Spritzenpumpe. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussmenge von 75 Millilitern pro Stunde ein.

Platzieren Sie einen 50-Milliliter-Schlauch am Boden, um den Durchfluss aufzufangen und die Pumpe zu starten. Nachdem die Filtration abgeschlossen ist, kuppeln Sie die Filterkassette aus und achten Sie darauf, auf welcher Oberseite sich die Zellen befinden, die sich in der PIPAAm-beschichteten Oberfläche verfangen haben. Aspirieren Sie einen Milliliter des warmen Nährmediums in eine neue Spritze.

Bestimmen Sie erneut die Oberseite der Kassette und schließen Sie dann die Filtrationskassette wieder mit der Spritze mit dem Medium an und schließen Sie das untere Ende der Kassette so ein, dass die PIPAAm-beschichtete Oberfläche des Filters von der Spritze weg zeigt. Setzen Sie dann die Spritze wieder auf die Spritzenpumpe und halten Sie die Sechs-Well-Platte direkt unter die Filterkassette. Stellen Sie die Fördermenge ein und starten Sie die Pumpe.

Führen Sie das gesamte Medium durch den Filter und sammeln Sie den Durchfluss in der Petrischale. Warten Sie, bis das gesamte Medium durchgelaufen ist, stoppen Sie dann die Pumpe und entfernen Sie die Spritze und die Filtrationskassette aus der Pumpe. Lösen Sie anschließend die Filterkassette von der Spritze und öffnen Sie sie, um den Filter aus der Kassette zu holen.

Platzieren Sie den Filter mit der PIPAAm-Oberfläche nach unten in dieselbe Petrischale, die auch zum Auffangen des Rückflusses beim Lösen der Zellen aus den Poren verwendet wird. Fügen Sie den Rest des warmen Mediums hinzu und stellen Sie die Petrischale in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Kulturinkubator. Sobald der Filter aus der Kassette entnommen wurde, ist es wichtig, ihn mit den Zellen nach unten in die Platte zu legen und bei Bedarf vorsichtig im Medium zu schütteln, um sicherzustellen, dass die Zellen vom Filter gelöst werden.

Entfernen Sie nach 24 Stunden in Kultur vorsichtig den Mikrofilter mit einer Pinzette und entsorgen Sie den Filter. Resuspendieren Sie die Erythrozyten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette. Es ist wichtig, bei der Resuspendierung der Erythrozyten und PBMCs äußerst vorsichtig zu sein, um ein Auspipettieren der CTCs zu vermeiden.

Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medium, das die resuspendierten Erythrozyten und PBMCs enthält, während Sie die anhaftenden Krebszellen zurücklassen, und ersetzen Sie die Zellen durch frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Medium. Fahren Sie mit der CTC-Rentabilitätsbewertung fort. Unter Verwendung von gesundem Spenderblut, das mit kultivierten Krebszellen gespickt war, erreichte die thermisch ansprechende Technik zur Freisetzung lebensfähiger zirkulierender Tumorzellen (CTCs) eine Erfassungs-, Freisetzungs- und Entnahmeeffizienz von 94 %, 82 % bzw. 77 %.

Die Trenn- und Rückgewinnungseffizienz von unbeschichteten Filtern war deutlich geringer. Es wurde ein Lebendtot-Assay durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen vor dem Spike ins Blut und nach der Freisetzung zu bewerten. Die Zellen blieben nach der Freisetzung lebensfähig und vermehrten sich in Kultur schnell.

SKBr-3-Zellen wurden mit dem PIPAAm-beschichteten Schlitzfilter aus dem Blut gewonnen und auf einer 48-Well-Platte plattiert. Nach 16 Stunden in einer Kultur haften Tumorzellen an der Kulturplatte zusammen mit hypotonen Erythrozyten und Leukozyten, die sich am Boden der Platte abgesetzt haben. Nach dem Waschen wurden nicht adhärente Zellen entfernt, so dass nur die anhaftenden Tumorzellen auf der Platte verbleiben.

Dieselben Filter können für die stationäre Zellerfassung verwendet werden, sowohl für die Aufzählung als auch für die molekulare Charakterisierung von CTCs, um das Fortschreiten der Krebserkrankung zu verfolgen und das Krebsmanagement zu verbessern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der CTCs, die eine funktionelle Charakterisierung dieser Zellen ermöglichten, um zukünftige Wirkstoffziele zu erforschen und gleichzeitig einen Schritt in Richtung personalisierter Medizin zu machen.