Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Konkurrenz von einem Bakterienisolat auf ein anderes sowohl quantitativ als auch qualitativ zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Untersuchung des kompetitiven Ausschlusses innerhalb von Bakteriengemeinschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das widerspiegelt, was in einer Bakteriengemeinschaft passiert.

Eindringende Isolate müssen in der Lage sein, die hemmende Wirkung etablierter Isolate zu überleben, damit die Invasion erfolgreich ist. Das Verfahren wird von Emma Crank, einer Doktorandin der Biologie des Krankenhauses, demonstriert. Bereiten Sie zunächst eine Gehirn-Herz-Infusion oder BHI-Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.

Autoklavieren Sie den Agar bei 121 Grad Celsius in 15 psi für 20 Minuten, um ihn zu sterilisieren. Gießen Sie 15 Milliliter aliquoten sterilisierten BHI-Agar in sterile Petrischalen und lassen Sie den Agar aushärten. Bereiten Sie die BHI-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers zu und füllen Sie die 10-Milliliter-Aliquote in 28-Milliliter-Universalflaschen aus Glas um.

Anschließend die BHI-Brühe 20 Minuten lang autoklavieren. Um Vaporizer-Flaschen vorzubereiten, beginnen Sie mit der Demontage der Flaschen. Sprühen Sie ein 5%iges oberflächenaktives Reinigungsmittel durch den Verdampfer, um interne Verunreinigungen zu entfernen.

Weichen Sie dann die Vaporizer-Flasche, den Deckel und den Vaporizer über Nacht in dem Reinigungsmittel ein. Trocknen Sie am nächsten Tag den Verdampfer, den Deckel und die Flaschen unter der sterilen Luftstromhaube. Verwenden Sie dann 70% Ethanol, um die Flaschen zu füllen.

Bringen Sie anschließend den Verdampfer wieder an und sprühen Sie etwas Ethanol durch den Verdampfer. Setze den Deckel auf den Vaporizer und bewahre ihn bis zur Verwendung mit Ethanol darin auf. Verwenden Sie vor dem Gebrauch sterile BHI-Brühe, um die Flasche aseptisch zu spülen, und sprühen Sie die Brühe durch den Verdampfer.

Zur Herstellung von bakteriellen Übernachtkulturen werden die Konkurrenz- und Inhibitorstämme auf eine sterile BHI-Agarplatte gestreift und bei 37 Grad Celsius aerob etwa 18 Stunden lang inkubiert. Beimpfen Sie in einer 28-Milliliter-Universalflasche 10 Milliliter sterile BHI-Brühe mit einer einzigen Kolonie des gewünschten Konkurrenzbakterienstamms. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht in einem universellen Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min.

Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Agarplatten vollständig trocken sind und sich kein Kondenswasser auf dem Deckel bildet, um zu verhindern, dass sich die Impfung auf der Platte ausbreitet. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Übernachtkultur in die Mitte der Agarplatten, wobei Sie den Pipettenkolben nicht vollständig durchdrücken, um Luftblasen zu vermeiden, die die Kultur über den Agar sprühen. Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur trocknen, um die Ausbreitung der Kultur zu begrenzen.

Inkubieren Sie die Agarplatten dann aerob bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nachdem Sie eine Kultur über Nacht gezüchtet haben, während Sie unter einem Sicherheitsschrank der Stufe zwei arbeiten, der mit saugfähigem Papier ausgekleidet ist, verwenden Sie BHI-Brühe, um die Kultur zu verzehnfachen, um etwa viermal zehn bis sechste KBE pro Milliliter zu erhalten. Gießen Sie dann die verdünnte Kultur in eine sterile Plastikflasche für einen Parfümverdampfer.

Um einen Assay zur verzögerten Wachstumshemmung durchzuführen, sprühen Sie die Kultur durch jede der Verdampferflaschen, um sicherzustellen, dass die Kultur in den Sprühmechanismus geladen wird, bevor sie auf den Agar gesprüht wird. Aus einem Abstand von etwa 15 Zentimetern über dem Agar werden ca. 250 Mikroliter verdünnte Kultur über die gesamte Agaroberfläche gesprüht. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius aerob über Nacht.

Um die verzögerte Wachstumshemmung zu interpretieren, messen Sie die Wachstumshemmungszone des besprühten Konkurrenzstamms in Millimetern und subtrahieren Sie den Durchmesser des zentralen Spots des Inhibitor-Produzenten. Notieren Sie abschließend den Klarheitswert für Hemmzonen gemäß dem Textprotokoll. Wie in dieser Abbildung gezeigt, sollten die Assay-Ergebnisse als Unterschied in dem überlagerten Konkurrenzstamm in der Nähe des zentral gefleckten Inhibitor-produzierenden Stammes beobachtbar sein.

Die Unterschiede können vollständige Hemmung, partielle Hemmung, keine Hemmung oder positive Assoziation sein. Dieses Diagramm vergleicht die Hemmzonen zwischen Inhibitor-produzierenden Isolaten, die das Ergebnis der Menge des produzierten Antibiotikas, der Fähigkeit des Inhibitors, durch das Medium zu diffundieren, der Art des produzierten Inhibitors oder des Resistenzniveaus des Konkurrenzstamms gegen die Inhibitoren sein können. Dieses Beispiel zeigt, dass bei einer zu starken Verdünnung der Kultur des Testmitbewerbers die Hemmzone größer und mit einer weniger klar definierten Kante erscheint, als dies normalerweise der Fall ist.

Wenn der Inhibitor produzierende Stammspot vor der Inkubation über Nacht nicht vollständig getrocknet wurde, breitet sich der Inhibitorstamm aus und bildet keinen vollständig definierten Spot. Wird der Konkurrenzstamm nicht gleichmäßig besprüht, kann dies alternativ zu einer ungleichmäßigen Ausbreitung der Bakterien führen. Wenn der Konkurrenzstamm zu stark konzentriert ist, kann er auf dem Inhibitorstamm wachsen und im Extremfall zu einer Umkehrung der Rollen des Konkurrenzinhibitorstamms führen.

Sobald diese Technik gemeistert ist, dauert es eine Stunde, aufgeteilt auf vier Tage pro getestetem Isolatpaar. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, gleichmäßig zu sprühen und zwischen den Assays eine gute Replikation zu erzielen. Nach diesem Verfahren können Inhibitionsdaten mit taxonomischen Daten über das Vorhandensein oder Fehlen einer Bakterienart in einer Gemeinschaft überlagert werden.

Es kann dann festgestellt werden, ob hemmende Effekte die Fähigkeit einer Art beeinflussen, sich in einer Umwelt anzusiedeln. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Gemeinschaftsmikrobiome, die Auswirkungen von Merkmalsvarianz wie der Vorhersage antimikrobieller Peptide auf die Gemeinschaftsstruktur bei kompetitivem Ausschluss zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fähigkeit eines Bakterienisolats vergleichen können, das Wachstum eines anderen sowohl qualitativ als auch quantitativ kompetitiv zu hemmen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit aerosolisierten Bakterien äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank der Stufe zwei und das Tragen geeigneter PSA.