Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Konkurrenz eines bakteriellen Isolats gegenüber einem anderen sowohl quantitativ als auch qualitativ zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Zusammenhang mit Untersuchungen zur kompetitiven Ausschließung innerhalb bakterieller Gemeinschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie das widerspiegelt, was in einer bakteriellen Gemeinschaft auftritt.

Invasionsisolates müssen in der Lage sein, den hemmenden Wirkungen etablierter Isolate zu widerstehen, damit die Invasion erfolgreich sein kann. Den Ablauf demonstriert Emma Crank, eine Doktorandin aus der Krankenhaushygiene. Zunächst bereiten Sie Agar aus Hirn-Herz-Infusion (BHI) gemäß den Herstelleranweisungen vor.

Autoklavieren Sie das Agar bei 121 Grad Celsius und 15 psi für 20 Minuten, um es zu sterilisieren. Geben Sie 15-Milliliter-Aliquote des sterilisierten BHI-Agars in sterile Petrischalen und lassen Sie das Agar erstarren. Bereiten Sie BHI-Brühe gemäß den Herstelleranweisungen zu und überführen Sie 10-Milliliter-Aliquote in 28-Milliliter-Glasuniversalfläschchen.

Anschließend den BHI-Brühe 20 Minuten lang autoklavieren. Zum Vorbereiten der Verdampferflaschen beginnen Sie mit dem Zerlegen der Flaschen. Sprühen Sie ein 5%iges oberflächenaktives Reinigungsmittel durch den Verdampfer, um interne Kontaminanten zu beseitigen.

Danach die Verdampferflasche, den Deckel und den Verdampfer über Nacht in das Reinigungsmittel eintauchen. Am folgenden Tag die Verdampfereinheit, den Deckel und die Flaschen unter der sterilen Luftstromhaube trocknen. Anschließend die Flaschen mit 70 % Ethanol füllen.

Anschließend den Verdampfer wieder anbringen und etwas des Ethanols durch den Verdampfer versprühen. Den Deckel auf den Verdampfer setzen und diesen mit Ethanol gefüllt bis zur Verwendung aufbewahren. Vor der Verwendung die Flasche aseptisch mit steriler BHI-Brühe ausspülen und die Brühe durch den Verdampfer versprühen.

Um bakterielle Übernachtkulturen vorzubereiten, streiche die Konkurrenz- und Inhibitorenstämme auf eine sterile BHI-Agarplatte und inkubiere sie etwa 18 Stunden lang aerob bei 37 Grad Celsius. In einer 28-Milliliter-Universalflasche 10 Milliliter sterile BHI-Brühe mit einer einzelnen Kolonie des erforderlichen konkurrierenden Bakterienstamms ansäen. Die Kultur über Nacht in einem universellen Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min inkubieren.

Am folgenden Tag sicherstellen, dass die Agarplatten vollständig trocken sind und keine Kondensation auf dem Deckel vorhanden ist, um zu verhindern, dass die Inokulation auf der Platte verläuft. 25 Mikroliter der Übernachtkultur auf das Zentrum der Agarplatten pipettieren, wobei der Pipettierkolben nicht vollständig niedergedrückt werden sollte, um Luftblasen zu vermeiden, die die Kultur auf dem Agar versprühen könnten. Die Kultur bei Raumtemperatur trocknen lassen, um die Ausbreitung der Kultur einzuschränken.

Anschließend die Agarplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen inkubieren. Nach dem Anzüchten einer Übernachtkultur unter der Sicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe zwei, die mit absorbierendem Papier ausgelegt ist, die Kultur mit BHI-Brühe zehnfach verdünnen, um etwa vier mal zehn hoch sechs KBE pro Milliliter zu erhalten. Danach die verdünnte Kultur in eine sterile Kunststoff-Parfümzerstäuberflasche geben.

Um einen verzögerten Wachstumshemmtest durchzuführen, sprühen Sie die Kultur durch jede der Verdampferflaschen, um sicherzustellen, dass die Kultur vor dem Aufsprühen auf das Agarmedium in der Sprühvorrichtung enthalten ist. Sprühen Sie aus einem Abstand von etwa 15 Zentimetern über dem Agar etwa 250 Mikroliter der verdünnten Kultur gleichmäßig über die gesamte Oberfläche des Agars. Inkubieren Sie die Petrischalen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen.

Um die verzögerte Wachstumshemmung zu interpretieren, messen Sie die Wachstumshemmzone des aufgesprühten Konkurrenzstamms in Millimetern und ziehen Sie den Durchmesser des zentralen Flecks des Inhibitorenbildners ab. Notieren Sie abschließend die Klarheitsbewertung für die Hemmzonen gemäß dem Textprotokoll. Wie in dieser Abbildung dargestellt, sollten die Ergebnisse des Tests als Unterschied im überlappenden Konkurrenzstamm in der Nähe des zentral aufgetragenen, inhibitorbildenden Stammes sichtbar sein.

Die Unterschiede können eine vollständige Hemmung, eine teilweise Hemmung, keine Hemmung oder eine positive Assoziation sein. Dieses Diagramm vergleicht die Hemmzonen zwischen Inhibitor-produzierenden Isolaten, was auf der Menge des produzierten antimikrobiellen Wirkstoffs, der Fähigkeit des Inhibitors, sich durch das Medium zu diffundieren, dem Typ des produzierten Inhibitors oder dem Resistenzniveau des konkurrierenden Stammes gegenüber den Inhibitoren beruhen kann. Dieses Beispiel zeigt, dass, wenn die Test-Konkurrenzkultur zu verdünnt ist, die Hemmzone größer erscheint und einen weniger scharf definierten Rand aufweist, als typischerweise beobachtet wird.

Wenn der Spot der hemmstoffproduzierenden Stammkultur vor der Übernachtsinkubation nicht vollständig getrocknet war, breitet sich der Hemmstoffstamm aus und bildet keinen klar abgegrenzten Fleck. Alternativ kann eine ungleichmäßige Besprühung mit dem Konkurrenzstamm zu einer unregelmäßigen Verteilung der Bakterien führen. Schließlich kann eine zu hohe Konzentration des Konkurrenzstamms bewirken, dass dieser über dem Hemmstoffstamm wächst und in extremen Fällen sogar zu einer Umkehrung der Rollen zwischen Konkurrenz- und Hemmstoffstamm führen kann.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, dauert sie eine Stunde, aufgeteilt auf vier Tage pro getestetes Isolatpaar. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, gleichmäßig zu sprühen und eine gute Reproduzierbarkeit zwischen den Assays zu gewährleisten. Anschließend können die Hemmungsdaten mit taxonomischen Daten über das Vorhandensein oder Fehlen einer Bakterienart in einer Gemeinschaft überlagert werden.

Anschließend lässt sich bestimmen, ob hemmende Effekte die Besiedlungsfähigkeit einer Art in einem bestimmten Milieu beeinflussen. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschenden im Bereich der mikrobiellen Gemeinschaften, die Auswirkungen von Merkmalsvariationen – beispielsweise die Vorhersage antimikrobieller Peptide – auf die Gemeinschaftsstruktur im Kontext der kompetitiven Ausschließung zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fähigkeit eines bakteriellen Isolats, das Wachstum eines anderen kompetitiv zu hemmen, sowohl qualitativ als auch quantitativ vergleichen kann.

Es darf nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit aerosolisierten Bakterien äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Sicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe zwei sowie das Tragen geeigneter PSA sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.