Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse
19. September 2016
Wir beschreiben hier die Methodik, die zum Vergleich der schützenden Wirksamkeit und der Immunantwort der Lunge, die durch intranasale und subkutane Immunisierung mit BCG im Mausmodell induziert wird. Unsere Ergebnisse zeigen die Vorteile der Lungenimpfung und deuten auf eine Rolle der IL17-vermittelten Reaktion beim impfinduzierten Schutz hin.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Immunantworten in der Lunge nach einer Tuberkulose-Immunisierung zu untersuchen, einschließlich der schützenden Wirksamkeit des Impfstoffs gegen eine intranasale Herausforderung und der lokalen impfstoffinduzierten Lungenimmunantwort. Diese Methodik kann dazu beitragen, unsere Schlüsselfragen zum Tuberkulose-Impfstoff zu beantworten, einschließlich der Identifizierung der defensiven Lungenimmunreaktionen, die durch Lungenimpfstoffe für einen optimalen Immunschutz der Lunge ausgelöst werden. Ein Vorteil dieser Methodik besteht darin, dass die Immunantwort der Lunge des Tieres parallel zur protektiven Wirksamkeit individuell bewertet wird.
Dies ermöglicht die Identifizierung der spezifischen Immunparameter, die mit dem Schutz korrelieren. Für die subkutane Verabreichung des BCG-Impfstoffs füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel mit einem Milliliter der BCG-Impfstoffsuspension und entfernen Sie die Luftblasen. Platzieren Sie dann eine betäubte Maus in Bauchlage in einer Laminar-Flow-Haube und impfen Sie das Tier subkutan mit 100 Mikrolitern Bakterien in einer hinteren Flanke.
Für die intranasale Verabreichung beladen Sie eine Mikropipette mit 20 Mikrolitern der BCG-Suspension und platzieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage in der Haube. Verabreichen Sie das Inokulum tropfenweise zwischen den beiden Nasenlöchern, bis sich das gesamte Volumen von 20 Mikrolitern abgelagert hat, wobei zwischen den Tropfen Zeit bleibt, damit die Maus die Suspension einatmen kann. Befüllen Sie dann die Mikropipette erneut mit weiteren 20 Mikrolitern Bakterien und wiederholen Sie die Verabreichung.
Bei intranasaler Provokation mit dem H37Rv-Mikrobakterium tuberculosis-Stamm werden die Tiere zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt nach der Impfung mit intranasaler Verabreichung von 40 Mikrolitern der H37Rv-Bakteriensuspension geimpft, wie gerade gezeigt. Um die bronchoalveoläre Lavage- oder Kugelprobe zu entnehmen, verwenden Sie zunächst eine sterile Pinzette und eine Schere, um die Luftröhre freizulegen. Machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Luftröhre, achten Sie darauf, das Gewebe nicht vollständig zu entfernen, und führen Sie eine Kanüle ein, die mit einer sterilen 1-ml-Spritze verbunden ist, die 800 Mikroliter eiskaltes PBS enthält.
Wenn die Kanüle an Ort und Stelle ist, füllen Sie vorsichtig die Lunge mit dem PBS und ziehen Sie dann langsam den Kolben zurück, um mindestens 500 bis 600 Mikroliter Spülflüssigkeit zu gewinnen. Geben Sie die Kugel in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und vergewissern Sie sich, dass die Suspension farblos ist, was auf eine fehlende Blutkontamination hinweist. Lagern Sie die Proben bis zur Verarbeitung der Kugel auf Eis.
Um die bakterielle Belastung und Immunantwort in der Lunge zu bestimmen, fixieren Sie die Maus mit Nadeln in Rückenlage auf einer ebenen und desinfizierten Oberfläche in der Laminar-Flow-Haube und machen Sie einen Schnitt in der Oberhaut über der Brust. Schälen Sie dann die Haut ab, um den Brustbereich freizulegen, und schneiden Sie die Lunge auf. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um die Lunge und das Herz zu entnehmen, und legen Sie die Organe auf eine saubere Oberfläche.
Entfernen Sie dann das Herz, die Luftröhre und das Bindegewebe. Legen Sie jede Lunge in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml entionisiertem Wasser auf Eis, um die Bakterienlast und die zelluläre Immunantwort nachgelagert zu bestimmen. Im Vergleich zur subkutanen Verabreichung verleiht die intranasale Impfung eine viel größere Schutzwirkung in der Lunge.
Die Analyse einer repräsentativen Anzahl von Kolonien aus der intranasalen BCG-Impfstoffgruppe mittels PCR, die spezifisch für die RD9-Genomregion ist, zeigt, dass alle Kolonien ein Fragment von 0,4 Kilo-Basenpaaren liefern, das H37Rv entspricht. Intranasales BCG löst ein höheres IL17 aus und stört die Gamma-Produktion in der Lunge, was eine Korrelation zwischen der schützenden Wirksamkeit der intranasalen BCG-Impfung und der impfstoffinduzierten Immunantwort in der Lunge vor der Provokation aufzeigt mit einer höheren Konzentration sowohl der Gesamt- als auch der H37Rv-gereinigten Proteinderivat-spezifischen IgA-Konzentration in den Lavage-Proben, die bei den intranasalen Impfstoffempfängern beobachtet wurden. Weitere Analysen von Zytokin-produzierenden Zellen in der Lunge nach der Tuberkulose-Provokation zeigten, dass Interferenzen auf gamma-produzierende Zellen in allen infizierten Gruppen nachgewiesen wurden, während IL17A-produzierende CD4+-Zellen nur in der intranasalen BCG-Gruppe gefunden wurden, was eine signifikante Korrelation zwischen dem Vorhandensein von IL17 und der Verringerung der Lungenbakterienlast zeigt.
Nach diesem Verfahren ist es möglich, die lokalen Immunantworten der Lunge bei der Verwendung von biodiversen Tuberkuloseimpfstoffen sowie verschiedene Verabreichungswege und Zeitpunkte nach der Provokation zu vergleichen. Darüber hinaus kann diese Methodik verwendet werden, um die Immunität bei der durch die Impfung nach Provokation verwendeten zu bewerten. Dies könnte die Identifizierung der Immunantworten ermöglichen, die mit dem Schutz korrelieren.
Wichtig ist, dass die Arbeit mit Mycobacterium Tuberculosis BCL-freie Laboreinrichtungen erfordert, und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Immunantworten in der Lunge nach Tuberkulose-Impfung und vergleicht die Schutzwirkung einer intranasalen und subkutanen BCG-Impfung in einem Mausmodell. Die Ergebnisse verdeutlichen die Vorteile einer pulmonalen Impfung sowie die Rolle von IL17 beim impfinduzierten Schutz.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Impfstoffkunde
- Atemwegsgesundheit
Hintergrund
- Das Verständnis der Immunantworten auf Tuberkulose ist entscheidend für die Entwicklung von Impfstoffen.
- BCG ist ein weit verbreiteter Impfstoff, aber die Verabreichungsroute kann die Wirksamkeit beeinflussen.
- Eine intranasale Impfung könnte lokale Immunantworten in der Lunge verstärken.
- IL17 ist ein Zytokin, das möglicherweise eine Rolle bei der schützenden Immunität spielt.
Zweck der Studie
- Vergleich der Schutzwirkung einer intranasalen versus subkutanen BCG-Impfung.
- Beurteilung der lokalen Immunantworten, die durch eine pulmonale Impfung ausgelöst werden.
- Identifizierung von Immunparametern, die mit der impfstoffinduzierten Schutzwirkung korrelieren.
Verwendete Methoden
- Mausmodell zur Bewertung der Immunantworten verwendet.
- Intranasale und subkutane Verabreichung des BCG-Impfstoffs.
- Beurteilung der Immunantworten in der Lunge parallel zur Schutzwirkung.
- Messung der IL17-vermittelten Reaktionen nach der Impfung.
Hauptergebnisse
- Die intranasale Impfung zeigte eine verbesserte Schutzwirkung im Vergleich zur subkutanen Applikation.
- Es wurden signifikante, IL17-vermittelte Immunantworten in den Lungen beobachtet.
- Spezifische Immunparameter wurden identifiziert, die mit dem Schutz korrelieren.
- Die Methodik ermöglicht die individuelle Beurteilung von Immunantworten.
Schlussfolgerungen
- Die pulmonale Impfung könnte einen überlegenen Schutz gegen Tuberkulose bieten.
- IL17 spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort auf den BCG-Impfstoff.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um Impfstrategien für die Lungenimmunität zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Studie zeigt, dass pulmonale Impfrouten die Schutzwirkung gegen Atemwegserreger verbessern können, indem sie lokalisierte Immunantworten hervorrufen, darunter Th1-, Th17- und Schleimhaut-IgA-Antworten, die für die Entwicklung von Tuberkuloseimpfstoffen entscheidend sind. Die Korrelation zwischen IL17-produzierenden Zellen in der Lunge und einer verringerten bakteriellen Belastung nach der Infektion liefert einen mechanistischen Biomarker zur Vorhersage der Impfstoffwirksamkeit in präklinischen Modellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Evaluierung von Schleimhautimmunisierungsstrategien in der frühen Entdeckungsphase, um die Zielvalidierung zu entrisiken und die translationale Kohärenz für pulmonale Impfstoffkandidaten zu verbessern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Vergleich von Impfstoffapplikationswegen und deren Auswirkungen auf die lungenspezifische Immunprotektion.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten Workflow zur parallelen Beurteilung des Schutzwirkungsgrades und der Immunantworten und verringert so die Variabilität in Studien zur Zielvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Identifiziert IL17-produzierende CD4+-Zellen in der Lunge als korrelativen Biomarker des Schutzes und unterstützt dadurch die mechanistische Risikominimierung von Impfstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte wie die bakterielle Belastung der Lunge, Zytokinformen und IgA-Konzentrationen in der bronchoalveolären Lavage zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Etabliert reproduzierbare Verfahren zur immunologischen Profilierung der Lunge und für Herausforderungsmodelle, die auf andere Tuberkuloseimpfstoffe oder pulmonale Abgabesysteme anwendbar sind.
- Plattformnutzung: Unterstützt die Skalierbarkeit über verschiedene Impfstoffkandidaten hinweg, die auf die Schleimhautimmunität über intranasale, intratracheale oder aerosolisierte Applikationswege abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die translationale Kontinuität, indem pulmonale Immunantworten (Th1, Th17, IgA) mit dem Schutz vor einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion verknüpft werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem lokale Immunparameter mit Wirksamkeitsausgängen korreliert werden.
- Predictive Confidence: Unterstützt die Bewertung der durch Impfstoffe induzierten Immunität über verschiedene Zeitpunkte und Infektionsmodelle hinweg, um die präklinische Kontinuität zu beurteilen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Bewertung, indem sie die wegeabhängige Beurteilung der vaccineinduzierten Lungenimmunität und des Schutzes ermöglicht.
- Entdeckungsforschung: Unterstützt die Hypothesenprüfung dazu, wie der Verabreichungsweg die Immunantwort in der Lunge und den Schutzeffekt gegen Tuberkulose beeinflusst.
- Screening: Stellt biologische Systeme, die bereit für Assays sind, mit standardisierten Messgrößen für die bakterielle Belastung, Zytokinproduktion und mucosales IgA bereit, um Impfstoffformulierungen zu vergleichen.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen von IL17, IFN-Gamma und antigenspezifischem IgA im Lungengewebe und in der Lungenlavage, um vergleichende Analysen zwischen experimentellen Gruppen durchzuführen.
- Translationale Forschung: Verbindet lokale Immunantworten in der Lunge mit Schutzwirkungen und unterstützt so die biomarkerbasierte Weiterentwicklung von der Entdeckungsforschung zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung pulmonaler Impfstoffe gegen Atemwegspatogene, die auch auf andere Verabreichungswege über BCG hinaus anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit durch die Identifizierung immunologischer Korrelate des Schutzes und verringert mechanistische Unschärfen in der Impfstoffentwicklung.
- Operationaler Wert: Fördert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Verfahren für Impfung, Infektionschallenge und immunologische Profilierung der Lunge.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühe immunologische Biomarker mit Wirksamkeit verknüpft werden, wodurch biologische Risiken in späten Entwicklungsphasen bei Tuberkulose-Impfstoffprogrammen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikobasierte Priorisierung von Impfstoffkandidaten anhand ihrer Fähigkeit zur Induktion mukosaler Immunantworten und ihres Lungenprotektionsprofils.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in murinen Tuberkulosemodellen, pulmonaler Impfstoffverabreichung und der Aufarbeitung von Lungengewebe.
- Setzt eine BSL-3-Infrastruktur voraus, um Mycobacterium tuberculosis-Stämme für die Infektionsauslösung sicher handhaben zu können.
- Erfordert standardisierte Schulung in intranasalen und subkutanen Inokulationstechniken, um die Genauigkeit der Dosisverabreichung sicherzustellen.
- Benötigt validierte Assays zur Detektion von Zytokinen (z. B. IL17, IFN-Gamma) und zur Quantifizierung von Immunglobulinen in der bronchoalveolären Lavage.
- Die Anpassung an alternative pulmonale Applikationswege (intratracheal, Aerosol) kann eine Optimierung von Applikationsvolumen und Tierpositionierung erfordern.
