Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Immunantworten in der Lunge nach einer Tuberkulose-Immunisierung zu untersuchen, einschließlich der schützenden Wirksamkeit des Impfstoffs gegen eine intranasale Herausforderung und der lokalen impfstoffinduzierten Lungenimmunantwort. Diese Methodik kann dazu beitragen, unsere Schlüsselfragen zum Tuberkulose-Impfstoff zu beantworten, einschließlich der Identifizierung der defensiven Lungenimmunreaktionen, die durch Lungenimpfstoffe für einen optimalen Immunschutz der Lunge ausgelöst werden. Ein Vorteil dieser Methodik besteht darin, dass die Immunantwort der Lunge des Tieres parallel zur protektiven Wirksamkeit individuell bewertet wird.

Dies ermöglicht die Identifizierung der spezifischen Immunparameter, die mit dem Schutz korrelieren. Für die subkutane Verabreichung des BCG-Impfstoffs füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel mit einem Milliliter der BCG-Impfstoffsuspension und entfernen Sie die Luftblasen. Platzieren Sie dann eine betäubte Maus in Bauchlage in einer Laminar-Flow-Haube und impfen Sie das Tier subkutan mit 100 Mikrolitern Bakterien in einer hinteren Flanke.

Für die intranasale Verabreichung beladen Sie eine Mikropipette mit 20 Mikrolitern der BCG-Suspension und platzieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage in der Haube. Verabreichen Sie das Inokulum tropfenweise zwischen den beiden Nasenlöchern, bis sich das gesamte Volumen von 20 Mikrolitern abgelagert hat, wobei zwischen den Tropfen Zeit bleibt, damit die Maus die Suspension einatmen kann. Befüllen Sie dann die Mikropipette erneut mit weiteren 20 Mikrolitern Bakterien und wiederholen Sie die Verabreichung.

Bei intranasaler Provokation mit dem H37Rv-Mikrobakterium tuberculosis-Stamm werden die Tiere zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt nach der Impfung mit intranasaler Verabreichung von 40 Mikrolitern der H37Rv-Bakteriensuspension geimpft, wie gerade gezeigt. Um die bronchoalveoläre Lavage- oder Kugelprobe zu entnehmen, verwenden Sie zunächst eine sterile Pinzette und eine Schere, um die Luftröhre freizulegen. Machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Luftröhre, achten Sie darauf, das Gewebe nicht vollständig zu entfernen, und führen Sie eine Kanüle ein, die mit einer sterilen 1-ml-Spritze verbunden ist, die 800 Mikroliter eiskaltes PBS enthält.

Wenn die Kanüle an Ort und Stelle ist, füllen Sie vorsichtig die Lunge mit dem PBS und ziehen Sie dann langsam den Kolben zurück, um mindestens 500 bis 600 Mikroliter Spülflüssigkeit zu gewinnen. Geben Sie die Kugel in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und vergewissern Sie sich, dass die Suspension farblos ist, was auf eine fehlende Blutkontamination hinweist. Lagern Sie die Proben bis zur Verarbeitung der Kugel auf Eis.

Um die bakterielle Belastung und Immunantwort in der Lunge zu bestimmen, fixieren Sie die Maus mit Nadeln in Rückenlage auf einer ebenen und desinfizierten Oberfläche in der Laminar-Flow-Haube und machen Sie einen Schnitt in der Oberhaut über der Brust. Schälen Sie dann die Haut ab, um den Brustbereich freizulegen, und schneiden Sie die Lunge auf. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um die Lunge und das Herz zu entnehmen, und legen Sie die Organe auf eine saubere Oberfläche.

Entfernen Sie dann das Herz, die Luftröhre und das Bindegewebe. Legen Sie jede Lunge in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml entionisiertem Wasser auf Eis, um die Bakterienlast und die zelluläre Immunantwort nachgelagert zu bestimmen. Im Vergleich zur subkutanen Verabreichung verleiht die intranasale Impfung eine viel größere Schutzwirkung in der Lunge.

Die Analyse einer repräsentativen Anzahl von Kolonien aus der intranasalen BCG-Impfstoffgruppe mittels PCR, die spezifisch für die RD9-Genomregion ist, zeigt, dass alle Kolonien ein Fragment von 0,4 Kilo-Basenpaaren liefern, das H37Rv entspricht. Intranasales BCG löst ein höheres IL17 aus und stört die Gamma-Produktion in der Lunge, was eine Korrelation zwischen der schützenden Wirksamkeit der intranasalen BCG-Impfung und der impfstoffinduzierten Immunantwort in der Lunge vor der Provokation aufzeigt mit einer höheren Konzentration sowohl der Gesamt- als auch der H37Rv-gereinigten Proteinderivat-spezifischen IgA-Konzentration in den Lavage-Proben, die bei den intranasalen Impfstoffempfängern beobachtet wurden. Weitere Analysen von Zytokin-produzierenden Zellen in der Lunge nach der Tuberkulose-Provokation zeigten, dass Interferenzen auf gamma-produzierende Zellen in allen infizierten Gruppen nachgewiesen wurden, während IL17A-produzierende CD4+-Zellen nur in der intranasalen BCG-Gruppe gefunden wurden, was eine signifikante Korrelation zwischen dem Vorhandensein von IL17 und der Verringerung der Lungenbakterienlast zeigt.

Nach diesem Verfahren ist es möglich, die lokalen Immunantworten der Lunge bei der Verwendung von biodiversen Tuberkuloseimpfstoffen sowie verschiedene Verabreichungswege und Zeitpunkte nach der Provokation zu vergleichen. Darüber hinaus kann diese Methodik verwendet werden, um die Immunität bei der durch die Impfung nach Provokation verwendeten zu bewerten. Dies könnte die Identifizierung der Immunantworten ermöglichen, die mit dem Schutz korrelieren.

Wichtig ist, dass die Arbeit mit Mycobacterium Tuberculosis BCL-freie Laboreinrichtungen erfordert, und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.