Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse
19. September 2016
Wir beschreiben hier die Methodik, die zum Vergleich der schützenden Wirksamkeit und der Immunantwort der Lunge, die durch intranasale und subkutane Immunisierung mit BCG im Mausmodell induziert wird. Unsere Ergebnisse zeigen die Vorteile der Lungenimpfung und deuten auf eine Rolle der IL17-vermittelten Reaktion beim impfinduzierten Schutz hin.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Immunantworten in der Lunge nach einer Tuberkulose-Impfung zu untersuchen, einschließlich der Schutzwirkung des Impfstoffs gegen eine intranasale Herausforderung und der lokalen, durch den Impfstoff ausgelösten Immunantwort in der Lunge. Diese Methodik kann dabei helfen, unsere zentralen Fragen im Bereich der Tuberkulose-Impfstoffforschung zu beantworten, insbesondere die Identifizierung der von pulmonalen Impfstoffen hervorgerufenen schützenden Immunantworten in der Lunge, die eine optimale Immunprotektion gewährleisten. Ein Vorteil dieser Methodik liegt darin, dass die Immunantwort in der Lunge jedes einzelnen Versuchstiers parallel zur Schutzwirkung individuell bewertet wird.
was die Identifizierung der spezifischen immunologischen Parameter ermöglicht, die mit Schutz korrelieren. Für die subkutane Verabreichung des BCG-Impfstoffs füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit einem Milliliter der BCG-Impfstoffsuspension und entfernen Sie die Luftblasen. Danach platzieren Sie eine anästhesierte Maus in Bauchlage innerhalb eines Laminar-Flow-Geräts und impfen subkutan 100 Mikroliter Bakterien in eine Hinterflanke des Tieres ein.
Für die intranasale Applikation laden Sie eine Mikropipette mit 20 Mikrolitern der BCG-Suspension und platzieren die anästhetisierte Maus in Rückenlage innerhalb des Sicherheitswerks. Geben Sie das Inokulum tropfenweise zwischen die beiden Nasenlöcher, bis das gesamte Volumen von 20 Mikrolitern appliziert ist, und lassen Sie zwischen den Tropfen jeweils ausreichend Zeit, damit die Maus die Suspension einatmen kann. Danach befüllen Sie die Mikropipette erneut mit weiteren 20 Mikrolitern Bakterien und wiederholen die Applikation.
Für die intranasale Infektion mit dem Mycobacterium-tuberculosis-Stamm H37Rv impfen Sie die Tiere zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt nach der Impfung durch intranasale Verabreichung von 40 Mikrolitern der H37Rv-Bakteriensuspension, wie gerade gezeigt. Um die bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Probe zu gewinnen, exponieren Sie zunächst mit sterilen Pinzetten und einer Schere die Luftröhre. Anschließend führen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre ein, wobei darauf geachtet werden muss, das Gewebe nicht vollständig zu durchtrennen, und setzen eine Kanüle ein, die mit einer sterilen 1-mL-Spritze verbunden ist, die 800 Mikroliter eiskaltes PBS enthält.
Wenn die Kanüle korrekt positioniert ist, füllen Sie die Lungen vorsichtig mit PBS und ziehen Sie dann langsam den Kolben zurück, um mindestens 500 bis 600 Mikroliter Lavageflüssigkeit zu gewinnen. Geben Sie die Probe in ein 1,5-mL-Röhrchen auf Eis und überprüfen Sie, ob die Suspension farblos ist, was auf das Fehlen einer Blutkontamination hinweist. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis.
Um die bakterielle Belastung und die Immunantwort in der Lunge zu bestimmen, fixieren Sie die Maus mit Nadeln in Rückenlage auf einer flachen und desinfizierten Oberfläche innerhalb des laminaren Luftstroms, und führen Sie einen Schnitt in der oberen Haut über dem Brustkorb durch. Anschließend ziehen Sie die Haut zurück, um den Brustkorb freizulegen, und öffnen Sie die Lunge. Entnehmen Sie mithilfe steriler Scheren und Pinzetten Lunge und Herz und legen Sie die Organe auf eine saubere Oberfläche.
Entfernen Sie anschließend das Herz, die Luftröhre und das Bindegewebe. Geben Sie jede Lunge in ein separates 1,5-mL-Röhrchen mit 1 mL entionisiertem Wasser auf Eis zur nachfolgenden Bestimmung der bakteriellen Belastung und der zellulären Immunantworten. Im Vergleich zur subkutanen Applikation verleiht die intranasale Impfungsroute eine deutlich höhere Schutzwirkung in den Lungen.
Die Analyse einer repräsentativen Anzahl von Kolonien aus der intranasalen BCG-Impfgruppe mittels PCR, spezifisch für den RD9-Genomabschnitt, zeigt, dass alle Kolonien ein Fragment von 0,4 Kilobasenpaaren liefern, das dem von H37Rv entspricht. Die intranasale BCG-Impfung löst eine stärkere Produktion von IL-17 und Interferon-gamma in der Lunge aus und zeigt eine Korrelation zwischen der Schutzwirkung der intranasalen BCG-Impfung und der vaccineinduzierten Immunantwort in der Lunge vor der Herausforderung, wobei eine höhere Konzentration sowohl der gesamten als auch der H37Rv-spezifischen gereinigten Proteinderivat-spezifischen IgA-Konzentration in den Lavageproben der intranasal Geimpften beobachtet wurde. Eine weitere Analyse der zytokinproduzierenden Zellen in der Lunge nach der Tuberkulose-Herausforderung ergab, dass zwar Interferon-gamma-produzierende Zellen in allen infizierten Gruppen nachgewiesen wurden, IL-17A-produzierende CD4+-Zellen jedoch ausschließlich in der intranasalen BCG-Gruppe gefunden wurden, was eine signifikante Korrelation zwischen dem Vorhandensein von IL-17 und der Verringerung der bakteriellen Belastung in der Lunge belegt.
Mit dieser Methode ist es möglich, die lokalen immunologischen Reaktionen in der Lunge bei der Verwendung biodiverser Tuberkuloseimpfstoffe sowie unterschiedlicher Applikationswege und Zeitpunkte nach der Infektion zu vergleichen. Darüber hinaus kann diese Methodik verwendet werden, um die Immunität nach Impfung und Infektion zu bewerten, was die Identifizierung der immunologischen Reaktionen ermöglichen könnte, die mit Schutz korrelieren.
Wichtig ist, dass die Arbeit mit Mycobacterium Tuberculosis BCL-freie Laborräume erfordert, und es sollten stets die geeigneten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Immunantworten in der Lunge nach Tuberkulose-Impfung und vergleicht die Schutzwirkung einer intranasalen und subkutanen BCG-Impfung in einem Mausmodell. Die Ergebnisse verdeutlichen die Vorteile einer pulmonalen Impfung sowie die Rolle von IL17 beim impfinduzierten Schutz.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Impfstoffkunde
- Atemwegsgesundheit
Hintergrund
- Das Verständnis der Immunantworten auf Tuberkulose ist entscheidend für die Entwicklung von Impfstoffen.
- BCG ist ein weit verbreiteter Impfstoff, aber die Verabreichungsroute kann die Wirksamkeit beeinflussen.
- Eine intranasale Impfung könnte lokale Immunantworten in der Lunge verstärken.
- IL17 ist ein Zytokin, das möglicherweise eine Rolle bei der schützenden Immunität spielt.
Zweck der Studie
- Vergleich der Schutzwirkung einer intranasalen versus subkutanen BCG-Impfung.
- Beurteilung der lokalen Immunantworten, die durch eine pulmonale Impfung ausgelöst werden.
- Identifizierung von Immunparametern, die mit der impfstoffinduzierten Schutzwirkung korrelieren.
Verwendete Methoden
- Mausmodell zur Bewertung der Immunantworten verwendet.
- Intranasale und subkutane Verabreichung des BCG-Impfstoffs.
- Beurteilung der Immunantworten in der Lunge parallel zur Schutzwirkung.
- Messung der IL17-vermittelten Reaktionen nach der Impfung.
Hauptergebnisse
- Die intranasale Impfung zeigte eine verbesserte Schutzwirkung im Vergleich zur subkutanen Applikation.
- Es wurden signifikante, IL17-vermittelte Immunantworten in den Lungen beobachtet.
- Spezifische Immunparameter wurden identifiziert, die mit dem Schutz korrelieren.
- Die Methodik ermöglicht die individuelle Beurteilung von Immunantworten.
Schlussfolgerungen
- Die pulmonale Impfung könnte einen überlegenen Schutz gegen Tuberkulose bieten.
- IL17 spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort auf den BCG-Impfstoff.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um Impfstrategien für die Lungenimmunität zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Studie zeigt, dass pulmonale Impfrouten die Schutzwirkung gegen Atemwegserreger verbessern können, indem sie lokalisierte Immunantworten hervorrufen, darunter Th1-, Th17- und Schleimhaut-IgA-Antworten, die für die Entwicklung von Tuberkuloseimpfstoffen entscheidend sind. Die Korrelation zwischen IL17-produzierenden Zellen in der Lunge und einer verringerten bakteriellen Belastung nach der Infektion liefert einen mechanistischen Biomarker zur Vorhersage der Impfstoffwirksamkeit in präklinischen Modellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Evaluierung von Schleimhautimmunisierungsstrategien in der frühen Entdeckungsphase, um die Zielvalidierung zu entrisiken und die translationale Kohärenz für pulmonale Impfstoffkandidaten zu verbessern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Vergleich von Impfstoffapplikationswegen und deren Auswirkungen auf die lungenspezifische Immunprotektion.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten Workflow zur parallelen Beurteilung des Schutzwirkungsgrades und der Immunantworten und verringert so die Variabilität in Studien zur Zielvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Identifiziert IL17-produzierende CD4+-Zellen in der Lunge als korrelativen Biomarker des Schutzes und unterstützt dadurch die mechanistische Risikominimierung von Impfstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte wie die bakterielle Belastung der Lunge, Zytokinformen und IgA-Konzentrationen in der bronchoalveolären Lavage zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Etabliert reproduzierbare Verfahren zur immunologischen Profilierung der Lunge und für Herausforderungsmodelle, die auf andere Tuberkuloseimpfstoffe oder pulmonale Abgabesysteme anwendbar sind.
- Plattformnutzung: Unterstützt die Skalierbarkeit über verschiedene Impfstoffkandidaten hinweg, die auf die Schleimhautimmunität über intranasale, intratracheale oder aerosolisierte Applikationswege abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die translationale Kontinuität, indem pulmonale Immunantworten (Th1, Th17, IgA) mit dem Schutz vor einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion verknüpft werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem lokale Immunparameter mit Wirksamkeitsausgängen korreliert werden.
- Predictive Confidence: Unterstützt die Bewertung der durch Impfstoffe induzierten Immunität über verschiedene Zeitpunkte und Infektionsmodelle hinweg, um die präklinische Kontinuität zu beurteilen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Bewertung, indem sie die wegeabhängige Beurteilung der vaccineinduzierten Lungenimmunität und des Schutzes ermöglicht.
- Entdeckungsforschung: Unterstützt die Hypothesenprüfung dazu, wie der Verabreichungsweg die Immunantwort in der Lunge und den Schutzeffekt gegen Tuberkulose beeinflusst.
- Screening: Stellt biologische Systeme, die bereit für Assays sind, mit standardisierten Messgrößen für die bakterielle Belastung, Zytokinproduktion und mucosales IgA bereit, um Impfstoffformulierungen zu vergleichen.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen von IL17, IFN-Gamma und antigenspezifischem IgA im Lungengewebe und in der Lungenlavage, um vergleichende Analysen zwischen experimentellen Gruppen durchzuführen.
- Translationale Forschung: Verbindet lokale Immunantworten in der Lunge mit Schutzwirkungen und unterstützt so die biomarkerbasierte Weiterentwicklung von der Entdeckungsforschung zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung pulmonaler Impfstoffe gegen Atemwegspatogene, die auch auf andere Verabreichungswege über BCG hinaus anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit durch die Identifizierung immunologischer Korrelate des Schutzes und verringert mechanistische Unschärfen in der Impfstoffentwicklung.
- Operationaler Wert: Fördert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Verfahren für Impfung, Infektionschallenge und immunologische Profilierung der Lunge.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühe immunologische Biomarker mit Wirksamkeit verknüpft werden, wodurch biologische Risiken in späten Entwicklungsphasen bei Tuberkulose-Impfstoffprogrammen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikobasierte Priorisierung von Impfstoffkandidaten anhand ihrer Fähigkeit zur Induktion mukosaler Immunantworten und ihres Lungenprotektionsprofils.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in murinen Tuberkulosemodellen, pulmonaler Impfstoffverabreichung und der Aufarbeitung von Lungengewebe.
- Setzt eine BSL-3-Infrastruktur voraus, um Mycobacterium tuberculosis-Stämme für die Infektionsauslösung sicher handhaben zu können.
- Erfordert standardisierte Schulung in intranasalen und subkutanen Inokulationstechniken, um die Genauigkeit der Dosisverabreichung sicherzustellen.
- Benötigt validierte Assays zur Detektion von Zytokinen (z. B. IL17, IFN-Gamma) und zur Quantifizierung von Immunglobulinen in der bronchoalveolären Lavage.
- Die Anpassung an alternative pulmonale Applikationswege (intratracheal, Aerosol) kann eine Optimierung von Applikationsvolumen und Tierpositionierung erfordern.
