Quantitative Messung der relativen Retinsäure Niveaus in E8.5 Embryonen und Neurosphäre Kulturen Mit der F9 RARE-Lacz Zell-basierte Reporter Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, relative Retinsäurespiegel in Gewebeproben, wie zum Beispiel E8,5-Maus-Embryonen oder adulten Neurosphärenkulturen, mithilfe eines zellbasierten Reporterassays quantitativ zu messen. Obwohl der Retinsäure-Signalweg gut charakterisiert ist, ist eine direkte histologische Messung von Retinsäure technisch nicht durchführbar. Dieser Assay kann helfen, zentrale Fragen dazu zu beantworten, wie genetische Mutationen die Retinsäurespiegel beeinflussen können.

Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in ihrer hohen Empfindlichkeit und Vielseitigkeit, da sie die Messung einer breiten Palette von RA-Konzentrationen in verschiedenen Gewebeproben ermöglicht. Obwohl diese Methode direkte Einblicke in die Bestimmung von RA-Spiegeln in unterschiedlichen Gewebeproben liefert, kann sie auch auf andere Untersuchungen angewendet werden, beispielsweise um das Vorhandensein oder Fehlen von RA-stoffwechselnden Enzymen durch die Überwachung von Änderungen der RA-Spiegel zu ermitteln. Bevor mit Experimenten begonnen wird, testen Sie die Reaktion von F9 RARE-LacZ-Zellen auf RA. Geben Sie ein Nanomol all-trans-RA zu F9 RARE-LacZ-Zellen hinzu, die in einer 96-Loch-Platte platziert wurden.

Anschließend die Platte inkubieren und über Nacht bei 37 Grad Celsius kultivieren. Am nächsten Tag LacZ-Färbung durchführen und die Zellen auf ein blaues Präzipitat überprüfen. Falls die Färbung in den Zellen nicht einheitlich ist, die Zellen weiter subklonieren.

Teilen Sie die ausgewählten Kulturen auf 10-Zentimeter-Platten mit 100.000 Zellen pro 10 Milliliter auf. Bereiten Sie nach zwei Tagen Kultivierung eine 24-Loch-Platte vor, indem Sie 500 µL 0,2 % Gelatine pro Loch hinzufügen, und lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie anschließend die Gelatine und spülen Sie die Löcher zweimal mit jeweils 500 µL destilliertem Wasser aus.

Fügen Sie nun 500 µL F9 RARE-LacZ-Zellkulturmedium zu den Vertiefungen hinzu. Danach werden Kolonien von F9-Zellen mit einer sterilen P10-Pipettenspitze aufgenommen und jeweils in eine Vertiefung überführt. Nach drei oder vier Tagen Kultivierung werden die Kolonien auf zwei mit Gelatine beschichtete 24-Loch-Platten aufgeteilt, eine zur Testung und die andere zur Vermehrung.

Nach weiteren zwei Tagen der Kultur, einen Nanomolar RA jedem Brunnen einer 24-Loch-Platte hinzufügen und die Kultur über Nacht weiterführen. Am nächsten Tag einen LacZ-Färbetest durchführen, um hohe Ansprecher zu identifizieren, und die entsprechende Kultur vergrößern. Einen Tag vor der Gewinnung der E8.5-Embryonen oder der Dissoziation der Neurosphären, eine 96-Loch-Platte mit je 100 Mikroliter 0,2 % Gelatine pro Brunnen beschichten und die Platte 30 Minuten ruhen lassen.

Anschließend das Gelatine abpipettieren und die Vertiefungen zweimal mit jeweils 200 µL destilliertem Wasser spülen. Danach die ausgewählten F9 RARE-LacZ-Zellen, die in 10 cm-Dishs kultiviert wurden, mit Trypsin behandeln. Anschließend 100.000 Zellen in jedes Wells einer 96-Well-Platte in Kulturmedium ohne G418 impfieren.

Befüllen Sie ausreichend Wells, um jedes Embryo gemeinsam zu kultivieren, oder bereiten Sie drei Wells pro Genotyp vor, wenn Sie mit Neurosphären arbeiten. Bereiten Sie außerdem 24 Wells für die Standardkurve vor. Inkubieren Sie anschließend die Platte 24 Stunden lang.

Beginnen Sie für die Kultivierung embryonaler Zellen im Co-Kultur-System mit der Dissektion von E8,5-Embryonen. Füllen Sie anschließend ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 10 Mikrolitern Trypsin und überführen Sie mithilfe einer Pipettenspitze mit erweitertem Durchmesser (P20) den gesamten Embryo in das Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen danach auf Eis. Nachdem alle Embryonen isoliert wurden, inkubieren Sie alle Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Gewebe zu dissoziieren.

Nach fünf Minuten vorsichtig den Inhalt jedes Röhrchens mit einer P20-Pipettenspitze auftragen und 10 Mikroliter in ein Vertiefung der vorbereiteten 96-Loch-Platte mit F9 RARE-LacZ-Zellen überführen. Die Platte über Nacht kultivieren. Für Neurosphären-Kokulturen beginnen Sie mit der Übertragung einer Neurosphären-Kultur in 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 g für 10 Minuten und entfernen Sie das Überstandsvolumen bis auf ein Milliliter. Anschließend werden die Inhalte mit einer P1000-Pipette aufgezogen und abgegeben. Bestimmen Sie nun mithilfe eines kleinen Volumens die Dichte der dissoziierten Zellen.

Dann 100.000 dissoziierte Neurosphärenzellen über den F9 RARE-LacZ-Zellen ausplattieren. Drei Vertiefungen mit jeder Neurosphären-Kulturart befüllen. Bereiten Sie nun die Vertiefungen für die Standardkurve vor.

Fügen Sie jeweils 100 Mikroliter der durch serielle Verdünnung hergestellten All-trans-RA-Lösungen in sieben verschiedenen Konzentrationen im F9-RARE-LacZ-Kulturmedium in dreifachen Ansätzen hinzu. Schließen Sie negative Kontrollen unbehandelter Zellen ein. Kultivieren Sie die voll belegte 96-Well-Platte abschließend über Nacht.

Am nächsten Tag das Medium entfernen und die Kulturen mit 100 µL 2,5 % Glutaraldehyd pro Mulde fixieren. Die Platte 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Anschließend das Fixativ entfernen und die Mulden zweimal mit jeweils 200 µL PBS je 10 Minuten waschen.

Waschen Sie die Vertiefungen anschließend dreimal mit jeweils 200 Mikroliter LacZ-Waschlösung, wobei jede Waschung 10 Minuten dauert. Während des dritten Waschschritts bereiten Sie die X-gal-Anfärbungslösung in einem mit Aluminiumfolie umwickelten 15-Milliliter-Röhrchen vor. Stellen Sie außerdem eine befeuchtete Kammer für die 96-Loch-Platte bereit.

Fügen Sie nun 200 µL der X-gal-Anfärbungslösung in jede Vertiefung hinzu. Stellen Sie die Platte in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie sie bei 37 °C. Entfernen Sie nach der Inkubation die LacZ-Anfärbungslösung und ersetzen Sie sie durch 200 µL PBS.

Anschließend die Absorption bei 610 Nanometern messen und die Platte abbilden. Die F9 RARE-LacZ-Reporterzelllinie besteht aus adhärenten embryonalen Karzinomzellen, die quantitativ auf RA mit einer proportionalen Induktion von Beta-Galactosidase reagieren. Zudem weisen sie eine epitheliale Morphologie auf.

Trotz Kultivierung mit G418-Selektion nimmt die Reaktion dieser Zellen auf RA nach mehreren Passagen ab. Daher ist eine periodische Subklonierung erforderlich, um starke und einheitliche Reagierer auf RA sicherzustellen. E8,5-Embryonen, die homozygot für die vl-Mutation in Gpr161 sind, sollten eine verminderte embryonale RA-Signalgebung aufweisen. Mithilfe des hier beschriebenen Ko-Kultur-Assays von dissoziierten Embryonen mit F9 RARE-LacZ-Zellen wurde diese Erwartung bestätigt.

Kokulturen von Wildtyp-Neurosphären aus erwachsenen Tieren mit F9 RARE-LacZ-Zellen wurden ebenfalls verwendet, um die Anwesenheit von RA in Neurosphärenkulturen zu testen. Die stärkere Färbung im Vergleich zu Zellen vom Stadium E8.5 könnte auf die Homogenität der Neurosphärenkulturen zurückzuführen sein. Durch Erstellung einer Standardkurve für RA-Konzentrationen ließ sich der RA-Gehalt in Wildtyp-Neurosphärenkulturen sowie in Embryonen vom Typ E8.5 quantifizieren.

Während Sie dieses Verfahren durchführen, denken Sie daran, durch periodische Subklonierung F9 RARE-LacZ-Zellen aufrechtzuerhalten, die stark auf RA reagieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihre Probe gründlich dissoziiert wird, um eine homogene Verteilung und eine konsistente RA-Messung zu erleichtern. Mit diesem Verfahren können die Auswirkungen genetischer Mutationen auf die RA-Spiegel untersucht werden, und anschließend können weitere Methoden durchgeführt werden, um zu ermitteln, welche Komponenten des RA-Signalwegs direkt betroffen sind.