Assays UV-reflektierenden Strukturen zu erkennen und zu bestimmen, deren Bedeutung in Mate-Vorlieben der Sailfin Molly mit Poecilia latipinna
14. September 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Spektrophotometrie UV - reflektierenden Strukturen auf Organismen (in diesem Beispiel die sailfin molly Poecilia latipinna) und beschreibt dichotomous - Choice - Tests für die Fische zu erkennen , die Rückschlüsse erlauben , über die Rolle der UV - Signale bei der Partnerwahl getroffen werden.
Das übergeordnete Ziel des Nachweises der UV-Reflexion bei Fischen wie Poecilia latipinna besteht darin, zu verstehen, wie sich UV-reflektierende Strukturen auf das Paarungsverhalten der Art auswirken könnten. Diese Methode kann uns helfen, Paarungspräferenzen zu verstehen, z. B. ob UV-Signale wichtig sind und wenn ja, ob sie von beiden Geschlechtern verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Hinweise zu erkennen, die für uns vielleicht nicht sichtbar sind, aber für den Fisch sehr wichtig sein könnten.
Für dieses Protokoll kalibrieren Sie zunächst ein Spektralphotometer und eine Lichtquelle auf ein bekanntes weißes Normal. Die Raumbeleuchtung sollte vor allen Kalibrierungen schwach sein. Kalibrieren Sie das Gerät auf alle Wellenlängen, die gemessen werden sollen, einschließlich der UV-Wellenlängen zwischen 300 und 400 Nanometern.
Ziehen Sie nun Handschuhe an und betäuben Sie den Fisch in einer 5%igen Lösung aus Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäuresalz, bekannt als MS222, gepuffert mit einer gleichen Menge Natriumbircarbonat. Wenn der Fisch nicht mehr reagiert, übertragen Sie ihn sofort auf einen schwarzen, nicht reflektierenden Hintergrund. Bevor Sie Messungen vornehmen, dimmen Sie die Raumbeleuchtung erneut.
Um die Reflexionsdaten aufzuzeichnen, verwenden Sie eine Analysesoftware. Um der Einstellung hier zu entsprechen, setzen Sie die Integrationszeit auf 2000 Sekunden. Legen Sie die durchschnittliche Anzahl der Scans auf zwei und den Wert für die Pixelglättung auf fünf fest.
Messen Sie nun den Reflexionsgrad des Fisches mit einer faseroptischen Sonde. Halten Sie die Sonde so, dass ein 45-Grad-Winkel zwischen der Glasfaser und dem Körper entsteht. Machen Sie durchschnittlich mehrere Scans pro Körperregion.
Überprüfen Sie den Reflexionsgrad für mehrere Körperbereiche und suchen Sie nach Unterschieden zwischen Individuen. Wenn Sie fertig sind, tragen Sie optional ein handelsübliches Schutzmittel auf, um den Schleimbelag wiederherzustellen, und bringen Sie den Fisch dann in einen gut sauerstoffreichen Auffangbehälter zurück. Sobald er sich erholt hat, zeigt der Fisch normales Schlagen und Schwimmen des Operculums.
Bei diesem Test wird ein ausgewählter Behälter verwendet, der mit UV- und undurchsichtigen Filtern ausgestattet ist. Wenn die Plexiglastrennwände entfernt werden, kann ein Fisch im neutralen Fach aufgrund von Filtern in verschiedenen Teilen des Tanks das gesamte Spektrum oder Nicht-UV-Licht sehen. Für P.latipinna verwenden Sie ein 75,7 Liter Testaquarium.
Stellen Sie vor jedem Test sicher, dass die drei Tankteile keine Wasser- oder Geruchssignale gemeinsam haben. Verwenden Sie sexuell empfängliche Personen für den Test. Bei einem weiblichen P.latipinna wählen Sie Fische innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt und verwenden Sie männliche Fische, die mindestens 24 Stunden lang isoliert wurden.
Um den Test durchzuführen, bringen Sie das Versuchstier zunächst in das neutrale Fach. Wählen Sie als Nächstes zwei potenzielle Paarungspartner aus, die sich in Größe, Färbung und Darstellungsmerkmalen so ähnlich wie möglich sind. Die Farbabstimmung kann präzise mit Instrumenten oder grob mit dem Auge erfolgen.
Platzieren Sie nun unter Vollspektrumbeleuchtung einen der beiden potentiellen Partner in jedem der beiden Auswahlfächer. Der Undurchsichtigkeits- und UV-Filter sowie die Fachteiler müssen alle an Ort und Stelle sein. Lassen Sie die Tiere 15 Minuten lang an diesen Zustand gewöhnen.
Weisen Sie für jeden Versuch nach dem Zufallsprinzip zu, welches Kompartiment über die UV-Filterung verfügt. Entfernen Sie dann die undurchsichtigen Abdeckungen von den Trennwänden. Beginnen Sie nach 15 Minuten mit der Aufzeichnung der Zeit, die die zentrale Person mit einer Stoppuhr in bestimmten Präferenzzonen verbringt.
Der Bereich innerhalb von zwei Körperlängen eines Auswahlkompartiments stellt eine Präferenzzone dar. Alternativ können Sie eine Ereignisaufzeichnungssoftware verwenden. Zeichnen Sie die Aktivität des Fisches 15 Minuten lang auf.
Wenn der Fisch nicht jede Präferenzzone mindestens einmal besucht, behandeln Sie ihn als nicht reagierend und schließen Sie ihn aus den Versuchsdaten aus. Die Messung des UV-Reflexionsgrads von P.latipinna zeigt, dass beide Geschlechter UV-Eigenschaften aufweisen, die von Individuum zu Individuum unterschiedlich sind. Die Merkmale sind an den Seiten ihres Körpers am deutlichsten.
Nachdem UV-Merkmale gefunden worden waren, zeigte der Diskriminierungstest, dass Weibchen, aber nicht Männchen, diese Merkmale bei ihren Paarungsentscheidungen nutzten. Da beide Geschlechter UV-Merkmale besitzen, ist es möglich, dass sie an anderen sozialen Interaktionen wie Schwarmbildung oder Nahrungssuche beteiligt sind. Einmal gemeistert, können die UV-Messtechniken in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden.
Die Versuche zur Partnerpräferenz können für jeden Fisch in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Beim Versuch des Eingriffs ist es wichtig sicherzustellen, dass die Fische reproduktiv empfänglich sind. Im Anschluss an dieses Verfahren könnten weitere Experimente getestet werden, um die Rolle von UV-Merkmalen bei der Erkennung von Individuen oder Spezies zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Spektrophotometrie zur Detektion ultraviolettreflektierender Strukturen an Organismen, insbesondere am Segelkärpfling Poecilia latipinna. Es erläutert dichotome Wahltests an Fischen, die Rückschlüsse auf die Rolle von ultravioletten Signalen während der Partnerwahl ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensökologie
- Tierkommunikation
Hintergrund
- Das Verständnis der UV-Reflexion bei Fischen kann Einblicke in Fortpflanzungsverhalten geben.
- UV-Signale könnten eine bedeutende Rolle bei der Partnerwahl spielen.
- Die Detektion von UV-Reflexion erfordert spezialisierte Techniken.
- Fische könnten Signale wahrnehmen, die für den Menschen unsichtbar sind.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen von UV-Reflexionsstrukturen auf das Paarungsverhalten.
- Bestimmung, ob UV-Signale für die Partnerwahl bei Poecilia latipinna wichtig sind.
- Beurteilung der Nutzung von UV-Signalen durch beide Geschlechter während der Paarung.
Verwendete Methoden
- Kalibrierung eines Spektrophotometers und einer Lichtquelle an einem bekannten weißen Standard.
- Messung von UV-Wellenlängen zwischen 300 und 400 Nanometern.
- Durchführung von dichotomen Wahltests mit Fischen.
- Beobachtung von Paarungspräferenzen basierend auf UV-Signalen.
Hauptergebnisse
- Nachweis von UV-reflectierenden Strukturen bei Poecilia latipinna.
- Hinweise darauf, dass UV-Signale die Partnerwahl beeinflussen.
- Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Geschlechter UV-Signale nutzen könnten.
- Veranschaulichung der Wirksamkeit der Spektrophotometrie in der biologischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Die UV-Reflexion spielt eine entscheidende Rolle beim Fortpflanzungsverhalten von Poecilia latipinna.
- Das Verständnis dieser Signale kann das Wissen über die Kommunikation bei Fischen erweitern.
- Die beschriebenen Methoden können auf andere Arten für ähnliche Untersuchungen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis nicht-visueller sensorischer Reize wie der UV-Reflexion erweitert die Zielvalidierung in der Verhaltensneurowissenschaft, indem mechanistisch relevante Signalwege bei sozialen Entscheidungsprozessen aufgedeckt werden. Dieser Test ermöglicht die phänotypische Untersuchung verhaltensweisen, reizabhängigen Verhaltensweisen und unterstützt die mechanistische Risikominderung in präklinischen Modellen, bei denen die sensorische Wahrnehmung die therapeutische Wirkung beeinflusst. Die Methode liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse, die das Vorhersagevertrauen in Studien zur Zielinteraktion verbessern, die neuronale Schaltkreise untersuchen, die die Partnerwahl und soziale Bindung steuern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen zu sensorisch gesteuerten Verhaltensweisen, indem die UV-Reflexion als messbare biologische Variable isoliert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch standardisierte Detektion UV-reflektierender Strukturen über Individuen und Geschlechter hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem geklärt wird, ob UV-Signale den Fortpflanzungsentscheidungen weiblicher Segelflosserkärpflinge signifikant beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem das Vorhandensein und die Variabilität von UV-Eigenschaften entlang der Körperregionen bestätigt werden.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung des Assays durch Kalibrierung des Spektrophotometers auf UV-Wellenlängen (300–400 nm) und eine konsistente Positionierung der faseroptischen Sonde in einem Winkel von 45 Grad.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform, wobei die UV-Messung pro Fisch innerhalb von weniger als zwei Stunden abgeschlossen ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die UV-vermittelte Partnerwahl mit umfassenderen sozialen Interaktionen wie Schwarmbildung oder Nahrungssuche verknüpft wird, was auf mögliche Funktionen bei der Artenerkennung hindeutet.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem gezeigt wird, dass UV-Merkmale bei beiden Geschlechtern vorhanden sind, aber nur bei Weibchen verhaltensrelevant sind, was die Modellierung geschlechtsspezifischer Reaktionen unterstützt.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Konzentriert sich auf den prädiktiven Wert der Risikominderung, indem demonstriert wird, wie die Manipulation sensorischer Reize (UV-blockierende Filter) das Verhalten in binären Entscheidungstests verändert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Positioniert die Methode innerhalb der Entdeckungskontinuums von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die Hypothesenprüfung sensorischer Signalwege sowie die Verhaltensphänotypisierung vor der Verbindungsscreening.
- Entdeckungsbiologie: Erklärt, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie die Variation der UV-Reflexion quantifiziert und mit den als innerhalb von zwei Körperlängen eines Auswahlkompartiments definierten Präferenzbereichen verknüpft.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand eines dichotomen Auswahltestdesigns unter Verwendung von UV- und lichtundurchlässigen Filtern in einem 75,7-Liter-Aquarium, wodurch eine zuverlässige Bewertung von sensorisch modulierenden Substanzen ermöglicht wird.
- Analytik: Betont Messgrößen wie die mit einer Stoppuhr oder Ereigniserfassungssoftware erfasste Verweildauer in Präferenzbereichen und liefert quantitative Auswertungen zum Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem gezeigt wird, dass UV-Merkmale der individuellen oder artenspezifischen Erkennung zugrunde liegen könnten, was auf ein mögliches Potenzial für Biomarker in Modellen sozialen Verhaltens hindeutet.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar und nicht als Einmalverfahren, anwendbar über verschiedene Fischarten hinweg zur Detektion von UV-Signalen und zur Standardisierung verhaltensbiologischer Assays.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei sensorisch gesteuerten Verhaltensweisen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Messung der UV-Reflexion sowie der Partnerpräferenztests.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen durch frühzeitige Identifizierung der geschlechtsspezifischen Nutzung von Signalen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend darauf, ob UV-Signale die Partnerwahl in Zielpopulationen signifikant beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Spektrophotometrie, im Umgang mit Fischen und in Verhaltensbeobachtungsprotokollen.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich eines auf den Bereich 300–400 nm kalibrierten Spektrophotometers, einer Glasfaser-Sonde, MS222-Anästhetikum und eines Wahlkompartment-Behälters mit UV- und lichtundurchlässigen Filtern.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich Anästhesieprotokollen (5 % MS222 gepuffert mit Natriumbikarbonat), Lichtverhältnissen und Definitionen der Präferenzbereiche.
- Überlegungen zur Anpassung auf verschiedene Modellsysteme, einschließlich artenspezifischer Lokalisation von UV-Merkmalen und Auswahl geschlechtsreifer Individuen (Weibchen innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt, Männchen 24 Stunden isoliert).
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Die Fische müssen reproduktiv reagieren; das Ausbleiben eines Besuchs in jedem Präferenzbereich mindestens einmal führt zum Ausschluss aus den Versuchsdaten.
