Assays UV-reflektierenden Strukturen zu erkennen und zu bestimmen, deren Bedeutung in Mate-Vorlieben der Sailfin Molly mit
14. September 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Spektrophotometrie UV - reflektierenden Strukturen auf Organismen (in diesem Beispiel die sailfin molly Poecilia latipinna) und beschreibt dichotomous - Choice - Tests für die Fische zu erkennen , die Rückschlüsse erlauben , über die Rolle der UV - Signale bei der Partnerwahl getroffen werden.
Das übergeordnete Ziel der Erfassung der UV-Reflexion bei Fischen wie Poecilia latipinna besteht darin, zu verstehen, wie UV-reflektierende Strukturen das Fortpflanzungsverhalten der Art beeinflussen könnten. Diese Methode kann uns helfen, Fortpflanzungspräferenzen zu verstehen, beispielsweise ob UV-Signale wichtig sind und, falls ja, ob beide Geschlechter sie nutzen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, Signale zu erkennen, die für uns unsichtbar sein könnten, für die Fische jedoch sehr wichtig sein könnten.
Kalibrieren Sie für dieses Protokoll zunächst ein Spektrophotometer und eine Lichtquelle an einem bekannten weißen Standard. Die Raumbeleuchtung sollte vor allen Kalibrierungen gedimmt sein. Kalibrieren Sie das Gerät für alle Wellenlängen, die gemessen werden sollen, wozu auch die UV-Wellenlängen zwischen 300 und 400 Nanometern gehören müssen.
Tragen Sie nun Handschuhe und betäuben Sie die Fische in einer 5%igen Lösung von Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäure-Salz, bekannt als MS222, das mit einer gleichen Menge Natriumbicarbonat gepuffert ist. Sobald die Fische nicht mehr ansprechen, überführen Sie sie unverzüglich auf einen schwarzen, nicht reflektierenden Hintergrund. Dämmern Sie vor dem Durchführen der Messungen erneut das Raumlicht.
Um die Reflexionsdaten aufzuzeichnen, verwenden Sie Analysesoftware. Um die hier verwendeten Einstellungen zu übernehmen, stellen Sie die Integrationszeit auf 2000 Sekunden ein. Legen Sie die durchschnittliche Anzahl der Scans auf zwei fest und setzen Sie den Wert für die Pixel-Glättung auf fünf.
Messen Sie nun die Reflektanz des Fisches mithilfe einer faseroptischen Sonde. Halten Sie die Sonde so, dass ein Winkel von 45 Grad zwischen der Faseroptik und dem Körper besteht. Nehmen Sie einen Mittelwert mehrerer Scans pro Körperregion auf.
Überprüfen Sie die Reflexion an mehreren Körperbereichen und achten Sie auf Unterschiede zwischen Individuen. Falls gewünscht, tragen Sie nach Beendigung ein handelsübliches Schutzmittel auf, um die Schleimschicht wiederherzustellen, und setzen Sie den Fisch anschließend in einen gut belüfteten Haltungstank zurück. Nach der Erholung zeigt der Fisch normales Operkelbewegen und Schwimmverhalten.
Dieser Test verwendet einen Aquariumbehälter mit Auswahlkammer, der mit UV- und lichtundurchlässigen Filtern ausgestattet ist. Wenn die Plexiglasscheiben entfernt werden, kann ein Fisch in der neutralen Kammer aufgrund der Filter in verschiedenen Bereichen des Beckens Vollspektrumlicht oder Licht ohne UV-Anteil wahrnehmen. Für P.latipinna verwenden Sie ein 75,7-Liter-Testaquarium.
Vor jedem Test sicherstellen, dass keine Wasser- oder olfaktorischen Hinweise zwischen den drei Beckenabschnitten geteilt werden. Für den Test geschlechtsreife Individuen verwenden. Bei einem Weibchen von P.latipinna Fische innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt auswählen und Männchen verwenden, die mindestens 24 Stunden lang isoliert waren.
Um den Test durchzuführen, überführen Sie zunächst das Testtier in das neutrale Fach. Wählen Sie anschließend zwei potenzielle Fortpflanzungspartner aus, die sich hinsichtlich Größe, Färbung und Anzeigeverhalten so ähnlich wie möglich sind. Die Farbanpassung kann präzise mit Geräten oder grob per Augenmaß erfolgen.
Platzieren Sie nun unter Vollspektrumbeleuchtung einen der beiden potenziellen Partner in jedem der beiden Wahlkammern. Die opaken und UV-Filter sowie die Kammertrennwände müssen alle angebracht sein. Lassen Sie die Tiere 15 Minuten lang an diese Bedingungen akklimatisieren.
Weisen Sie für jeden Versuch zufällig zu, in welchem Kompartiment der UV-Filter angebracht ist. Entfernen Sie anschließend die lichtundurchlässigen Abdeckungen von den Trennwänden. Beginnen Sie nach 15 Minuten mit der Zeitaufnahme, die das untersuchte Individuum in bestimmten Präferenzbereichen verbringt, mithilfe einer Stoppuhr.
Der Bereich innerhalb von zwei Körperlängen eines Wahlkompartiments stellt eine Präferenzzone dar. Alternativ verwenden Sie eine Ereigniserfassungssoftware. Zeichnen Sie die Aktivität der Fische 15 Minuten lang auf.
Falls der Fisch jede Präferenzzone nicht mindestens einmal aufsucht, gilt er als nicht reagierend und wird von den Versuchsdaten ausgeschlossen. Die Messung der UV-Reflexion von P. latipinna zeigt, dass beide Geschlechter UV-Eigenschaften aufweisen, die zwischen Individuen variieren. Die Merkmale sind am stärksten an den Seiten ihrer Körper ausgeprägt.
Nachdem UV-Eigenschaften identifiziert worden waren, zeigte der Diskriminierungstest, dass Weibchen, nicht jedoch Männchen, diese Merkmale bei ihren Fortpflanzungsentscheidungen nutzten. Da beide Geschlechter über UV-Eigenschaften verfügen, könnten diese in anderen sozialen Interaktionen wie Schwarmbildung oder Nahrungssuche eine Rolle spielen. Sobald die UV-Messtechniken beherrscht sind, können sie in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden.
Die Partnerpräferenztests können bei jedem Fisch in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die Fische reproduktiv empfänglich sind. Nach Abschluss dieses Verfahrens könnten zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um die Rolle von UV-Eigenschaften bei der individuellen oder artlichen Erkennung zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Spektrophotometrie zur Detektion ultraviolettreflektierender Strukturen an Organismen, insbesondere am Segelkärpfling Poecilia latipinna. Es erläutert dichotome Wahltests an Fischen, die Rückschlüsse auf die Rolle von ultravioletten Signalen während der Partnerwahl ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensökologie
- Tierkommunikation
Hintergrund
- Das Verständnis der UV-Reflexion bei Fischen kann Einblicke in Fortpflanzungsverhalten geben.
- UV-Signale könnten eine bedeutende Rolle bei der Partnerwahl spielen.
- Die Detektion von UV-Reflexion erfordert spezialisierte Techniken.
- Fische könnten Signale wahrnehmen, die für den Menschen unsichtbar sind.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen von UV-Reflexionsstrukturen auf das Paarungsverhalten.
- Bestimmung, ob UV-Signale für die Partnerwahl bei Poecilia latipinna wichtig sind.
- Beurteilung der Nutzung von UV-Signalen durch beide Geschlechter während der Paarung.
Verwendete Methoden
- Kalibrierung eines Spektrophotometers und einer Lichtquelle an einem bekannten weißen Standard.
- Messung von UV-Wellenlängen zwischen 300 und 400 Nanometern.
- Durchführung von dichotomen Wahltests mit Fischen.
- Beobachtung von Paarungspräferenzen basierend auf UV-Signalen.
Hauptergebnisse
- Nachweis von UV-reflectierenden Strukturen bei Poecilia latipinna.
- Hinweise darauf, dass UV-Signale die Partnerwahl beeinflussen.
- Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Geschlechter UV-Signale nutzen könnten.
- Veranschaulichung der Wirksamkeit der Spektrophotometrie in der biologischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Die UV-Reflexion spielt eine entscheidende Rolle beim Fortpflanzungsverhalten von Poecilia latipinna.
- Das Verständnis dieser Signale kann das Wissen über die Kommunikation bei Fischen erweitern.
- Die beschriebenen Methoden können auf andere Arten für ähnliche Untersuchungen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis nicht-visueller sensorischer Reize wie der UV-Reflexion erweitert die Zielvalidierung in der Verhaltensneurowissenschaft, indem mechanistisch relevante Signalwege bei sozialen Entscheidungsprozessen aufgedeckt werden. Dieser Test ermöglicht die phänotypische Untersuchung verhaltensweisen, reizabhängigen Verhaltensweisen und unterstützt die mechanistische Risikominderung in präklinischen Modellen, bei denen die sensorische Wahrnehmung die therapeutische Wirkung beeinflusst. Die Methode liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse, die das Vorhersagevertrauen in Studien zur Zielinteraktion verbessern, die neuronale Schaltkreise untersuchen, die die Partnerwahl und soziale Bindung steuern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen zu sensorisch gesteuerten Verhaltensweisen, indem die UV-Reflexion als messbare biologische Variable isoliert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch standardisierte Detektion UV-reflektierender Strukturen über Individuen und Geschlechter hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem geklärt wird, ob UV-Signale den Fortpflanzungsentscheidungen weiblicher Segelflosserkärpflinge signifikant beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem das Vorhandensein und die Variabilität von UV-Eigenschaften entlang der Körperregionen bestätigt werden.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung des Assays durch Kalibrierung des Spektrophotometers auf UV-Wellenlängen (300–400 nm) und eine konsistente Positionierung der faseroptischen Sonde in einem Winkel von 45 Grad.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform, wobei die UV-Messung pro Fisch innerhalb von weniger als zwei Stunden abgeschlossen ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die UV-vermittelte Partnerwahl mit umfassenderen sozialen Interaktionen wie Schwarmbildung oder Nahrungssuche verknüpft wird, was auf mögliche Funktionen bei der Artenerkennung hindeutet.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem gezeigt wird, dass UV-Merkmale bei beiden Geschlechtern vorhanden sind, aber nur bei Weibchen verhaltensrelevant sind, was die Modellierung geschlechtsspezifischer Reaktionen unterstützt.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Konzentriert sich auf den prädiktiven Wert der Risikominderung, indem demonstriert wird, wie die Manipulation sensorischer Reize (UV-blockierende Filter) das Verhalten in binären Entscheidungstests verändert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Positioniert die Methode innerhalb der Entdeckungskontinuums von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die Hypothesenprüfung sensorischer Signalwege sowie die Verhaltensphänotypisierung vor der Verbindungsscreening.
- Entdeckungsbiologie: Erklärt, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie die Variation der UV-Reflexion quantifiziert und mit den als innerhalb von zwei Körperlängen eines Auswahlkompartiments definierten Präferenzbereichen verknüpft.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand eines dichotomen Auswahltestdesigns unter Verwendung von UV- und lichtundurchlässigen Filtern in einem 75,7-Liter-Aquarium, wodurch eine zuverlässige Bewertung von sensorisch modulierenden Substanzen ermöglicht wird.
- Analytik: Betont Messgrößen wie die mit einer Stoppuhr oder Ereigniserfassungssoftware erfasste Verweildauer in Präferenzbereichen und liefert quantitative Auswertungen zum Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem gezeigt wird, dass UV-Merkmale der individuellen oder artenspezifischen Erkennung zugrunde liegen könnten, was auf ein mögliches Potenzial für Biomarker in Modellen sozialen Verhaltens hindeutet.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar und nicht als Einmalverfahren, anwendbar über verschiedene Fischarten hinweg zur Detektion von UV-Signalen und zur Standardisierung verhaltensbiologischer Assays.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei sensorisch gesteuerten Verhaltensweisen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Messung der UV-Reflexion sowie der Partnerpräferenztests.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen durch frühzeitige Identifizierung der geschlechtsspezifischen Nutzung von Signalen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend darauf, ob UV-Signale die Partnerwahl in Zielpopulationen signifikant beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Spektrophotometrie, im Umgang mit Fischen und in Verhaltensbeobachtungsprotokollen.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich eines auf den Bereich 300–400 nm kalibrierten Spektrophotometers, einer Glasfaser-Sonde, MS222-Anästhetikum und eines Wahlkompartment-Behälters mit UV- und lichtundurchlässigen Filtern.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich Anästhesieprotokollen (5 % MS222 gepuffert mit Natriumbikarbonat), Lichtverhältnissen und Definitionen der Präferenzbereiche.
- Überlegungen zur Anpassung auf verschiedene Modellsysteme, einschließlich artenspezifischer Lokalisation von UV-Merkmalen und Auswahl geschlechtsreifer Individuen (Weibchen innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt, Männchen 24 Stunden isoliert).
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Die Fische müssen reproduktiv reagieren; das Ausbleiben eines Besuchs in jedem Präferenzbereich mindestens einmal führt zum Ausschluss aus den Versuchsdaten.
