Name: Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die lasergestützte zytoplasmatische Mikroinjektion in Nutztierzygoten zur effizienten Zufuhr von Lösungen und Genom-Editing-Tools. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung transgener Tiere mit hoher Präzision.

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Arbeiten im Zusammenhang mit dieser Technik werden von NIH/NICHD RO1 HD070044 und USDA/NIFA Hatch-Projekten W-3171 und W-2112 unterstützt.

1. Mikropipette Produktion <ol><li> Injection Mikro <ol><li> Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position. </li><li> Bringen Sie die gezogen Pipette und die Mikroschmiede Heizwendel mit seiner Glasperle in den Fokus. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis die Heizwendel das Ziel erreicht Innendurchmesser (5 &amp; mgr; m) zu messen. </li><li> Stellen Sie die Hitze auf etwa 45% und vorsichtig auf die Pipette bringen, so dass es den Faden berührt. Aktivieren Sie kurz die Heizung. Dies wkrank schmelzen leicht die Pipette, so dass es auf den Faden und beim Abkühlen haftet, wird die Pipette an der Kontaktstelle brechen einen geraden Schnitt zu erzeugen. Hinweis: Die entsprechende Temperatureinstellung in diesem Schritt Schlüssel ist , da die Temperaturen zu hoch wird die Pipette Biegung machen und damit ein gerader Schnitt wird nicht möglich sein und die Temperaturen zu niedrig wird nicht ausreichen , um die Pipette (1A) zu schmelzen. </li><li> Machen Sie einen ungefähren Winkel von 30 ° in der Nähe der Pipettenspitze durch etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von der Heizwendel zu positionieren. Stellen Sie die Temperatur auf 60%, und aktivieren Sie die Heizung. Hinweis: Dies wird die Pipette über das Filament biegen. Dieser Winkel ist erwünscht , so dass die Spitze der Nadel an der Oberfläche der Einspritzplatte ist parallel , wenn in den Injektor (1B) montiert ist . </li><li> Griff Mikroinjektionspipette mit Vorsicht , da sie extrem scharf und zerbrechlich sind. </li></ol></li><li> Halten Mikro <ol><li> Legen Sie eine borosilicaß Glaskapillare (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und sperren. </li><li> Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es mit einem langen, selbst in einer dünnen Spitze führt verjüngen und parallele Wände (Beispiel: Wärme: 815; Ziehen: 20; Geschwindigkeit: 140; Zeit: 175; Druck: 200). </li><li> die gezogener Pipette aus dem Abzieher Gerät und legen Sie es auf der Mikroschmiede Halter in horizontaler Lage vorsichtig entfernen. Stellen Sie den Fokus auf die Heizwendel und Pipette. </li><li> Verwenden Sie die Okularstrichplatte die Pipette Durchmesser und bewegen Sie die Pipette bis zu seinem Durchmesser über dem Glühfaden erreicht 180 &amp; mgr; m zu messen. </li><li> Bei der angegebenen Größe, markieren Sie die Glaskapillare mit einer Diamantspitze Stift und drücken Sie dann vorsichtig an der Spitze zog das Glas zu brechen. Dies sollte in einem geraden Schnitt (1C) zur Folge haben . </li><li> Bewegen der Pipette in eine vertikale Position mit ihrer Spitze nahe des Filaments. Stellen Sie die Temperatur<html> der Mikroschmiede bis 60%. </li><li> Feuerpolitur der Spitze der Pipette mit Standardtechniken 7 , bis sie eine ID von 40 &amp; mgr; m erreicht. Verwenden Sie das Okularstrichplatte die ID (1D) zu überprüfen. </li><li> Stellen Sie sich einen Winkel auf der Pipette. <ol><li> Bringen der Pipette zurück in eine horizontale Position etwa 10 &amp; mgr; m entfernt von dem Filament und 5 mm von seiner Spitze. Stellen Sie die Temperatur auf etwa 60% und aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen , bis ein gewünschter Winkel (von etwa 30 o) erreicht wird. Überprüfen Sie den Winkel visuell (Abbildung 1E). Hinweis: Die Pipette ist gewöhnlich angebracht an den Mikroinjektor bei einem ungefähren Winkel von 60 o gegenüber dem Boden des Einspritzschale. Die Spitze der Pipette gebogen ist, so dass es an den Boden der Schale parallel ist, die für die korrekte Einspritzung des Embryos in seinem mittleren Ebene notwendig ist. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Setup-Mikromanipulator <ol><li> Überprüfen Sie, ob die Mikroinjektoren voll mit Öl beladen sind und dass es keine Luftblasen im System (Blasen im Mikroinjektors verhindern feine Steuerung der Einspritzung). </li><li> Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatoren in der Mittelstellung sind. Dies wird für eine breite Palette von Bewegung der Pipetten ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulator Halter und den Injektionspipette in die richtige Mikromanipulationshalter. </li><li> Lassen Sie das Öl in die Pipetten durch Kapillarität eingeben und prüfen, ob das System richtig, indem Öl nach oben und unten in der Pipette arbeitet die Mikroinjektors Kontrollen verwenden. Hinweis: Wenn es keine Bewegung von Öl in den Nadeln ist, könnte es eine Verstopfung sein. In diesem Fall verwenden Sie eine neue Nadel. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Pipetten in die Mitte des Mikroskops Blickfeld zu bringen. Mit 4-fache Vergrößerung, überprüfen Sie, dass die Mikropipettenspitzen im richtigen Winkel sind (S.arallel an den Boden der Schale). Hinweis: Eine korrekte Einstellung der Nadeln für eine erfolgreiche Injektion Schlüssel ist, und für die Ergebnisse Konsistenz. </li><li> Kalibrieren Sie das Lasersystem im Anschluss an die Kalibrierung Handbuch des Herstellers. </li></ol> 3. Herstellung von Injektions Dish (Abbildung 2) <ol><li> Ein 50 &amp; mgr; l Tropfen erwärmt (37 ° C) SOF-HEPES (Zusammensetzung detailliert in dem Abschnitt Materialien), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) auf der Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale. Legen Sie 1 - 2 ul Tropfen der Lösung auf die Injektion Tropfen injiziert nahe zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen kühlen nicht unter RT unten. Hinweis: In diesem Protokoll werden wir die Dextran-Red-Farbstoff in die Injektionslösung hinzufügen zu können, die Stelle der Injektion zu visualisieren und sie verfolgen später. </li><li> Decken die Tropfen in der Einspritzplatte mit etwa 10 ml Mineralöl. </li><li> Setzen Sie die Injektion Schale auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die pipettes in die Injektions Tropfens. Überprüfen Sie, ob die Nadeln innerhalb des Tropfens im Fokus sind. Passen Sie ihre Höhe der Mikromanipulator Kontrollen nach Bedarf verwenden. </li><li> Verwendung eines Mikrodispenser laden etwa 20 - 30 Zygoten (17-20 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) in der oberen Seite des Injektions Tropfens. Führen Injektion bei Raumtemperatur, so dass die Anzahl von Embryonen in der Injektionsabfall durch die Geschwindigkeit bestimmt, bei der die Person, die sie zu injizieren. Nicht mehr Embryonen als die Last, die in 30 Minuten injiziert werden kann. <ol><li> Um die Embryonen in die Mikrodispenser laden, drücken Sie den Kolben vollständig und tauchen Sie die Spitze in die Lösung, um die Embryonen enthalten. Berühren Sie die Embryonen werden mit der Spitze der Glaskapillare (einer zu der Zeit) aufgenommen und langsam loslassen der Kolben, so dass jeder Embryo in die Kapillare gelangt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen aufgenommen oder der Mikrodispenser Kapazität voll ist. </li><li> Zum Lösen der geladenen Embryonen, drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis das gesamte Volumen containing die Embryonen aus der Kapillare freigesetzt. </li></ol></li></ol> 4. Mikroinjektions <ol><li> Mit dem 4X Ziel, laden Sie die Lösung in die Injektionspipette injiziert werden durch Unterdruck Anwendung (Absaugen). Laden ausreichende Lösung einzuspritzen 2 - 3 Zygoten. Gehen Sie dann auf die Injektion Tropfen. </li><li> Innerhalb der Injektion Tropfen, bewegen Sie die Haltepipette so die Spitze zu einer Zygote nahe kommt. Bewerben Unterdruck (absaugen) mit dem Halte Mikroinjektors so die Zygote in die Haltepipette und Wechsel zu einem 20x-Objektiv befestigt wird. </li><li> Sobald der Zygote an die Haltepipette befestigt ist, überprüfen Sie die Qualität der Injektion Pipette vorsichtig auf die Embryo bewegen, ohne sie zu lösen. Eine gute Qualität Zygote sollten die beiden Polkörper (wenn auch manchmal nur einer zu sehen ist) und ein homogenes Zytoplasma. Nicht abnormal Zygoten (3A) zu injizieren. </li><li> Falls notwendig, die Position des Embryos für eine korrekte EinspritzungLage. Eine gute Positionierung wäre, dass in der es etwas Platz zwischen dem ZP und dem PM, so dass die PM nicht durch den Laser beschädigt werden. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Injektionspipette auf den Embryo Mittelebene angeordnet ist, indem Sie an der Zygote an der Injektionsstelle zu berühren. Wenn es nicht auf seine Mittelebene ist, wird die Nadel dazu neigen, den Embryo zu machen, anstatt Einstich drehen. Stellen Sie die Höhe der Injektionspipette nach Bedarf. </li><li> Machen Sie ein Loch in der ZP mit einem Laser (3B). <ol><li> Mit Hilfe der Software statt des Lasers die Laser Absehen in der ZP, wo das Loch wird (auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Embryo in die Haltepipette angebracht ist) hergestellt werden. Mit dem Laser-Steuerungsfenster klicken Sie auf den Feuerknopf. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs groß genug ist, um eine Öffnung in der ZP für die Nadel zu schaffen passieren, ohne die Uhr zu beschädigen (Beispiel: 0,662 ms Pulsbreite / 6,9 um Lochgröße). </li></ol></li><li> Übergeben Sie die Injektionsnadeldurch das Loch in dem ZP und kontaktieren den PM. Weiter die Pipette nach vorne schieben , bis die Nadel ¾ der Weg in den Embryo (3C) ist. </li><li> Beobachten der Position des Meniskus an der lösungs Öl Interphase, wie dies konsequent verwendet wird, um Injektionsvolumens steuern. </li><li> Bewerben Unterdruck (absaugen) an der Injektionspipette, die in PM und dem Zytoplasma in die Injektionsnadel abgesaugt führen wird. Fortfahren, bis die Bewegung des Zytoplasma in die Nadel beschleunigt oder wenn Zytoplasma Inhalt mit Injektionslösung vermischen gesehen werden kann. Dies zeigt an Bruch des PM (Figur 3D). </li><li> Injizieren Sie die Cytoplasma-Gehalt durch die Lösung in das Zytoplasma der Zygote durch Anlegen positiver Druck (Injektion), bis der Meniskus an der Lösung Öl Interphase folgte wieder ein Durchmesser von Zygote Äquivalent hinter dem Ausgangspunkt fortgeschritten ist. Hinweis: Unter unseren Bedingungen, diese Vertresentiert etwa 7 pl der injizierten Lösung (Abbildung 3E). </li><li> Wechseln Sie in ein 4X Ziel und bewegen Sie den injizierten Embryo / s an der unteren Seite des Injektions Tropfens. Lassen Sie den Embryo durch Anlegen positiver Druck auf die Halte Mikroinjektors. Halten Sie die nicht injizierten Embryonen auf der Oberseite und die injizierten, die auf der unteren Seite des Tropfens zu helfen, den Überblick über die injizierten / nicht injizierten Embryonen und effizienter zu arbeiten. </li></ol> 5. Embryo Recovery and Injection Ergebnisse <ol><li> Machen Sie 3 Tropfen von ca. 200 &amp; mgr; l in einer neuen Schale mit vorgewärmten SOF-HEPES. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mit dem Mikrodispenser (wie oben beschrieben). Waschen Sie die injizierten Embryonen, indem sie durch die 3 SOF-HEPES bewegenden Tropfen. </li><li> Zählen Sie die Embryonen während der Mikroinjektions lysiert und verwerfen sie. Hinweis: Ein lysiert Zygote von einem intakten ein leicht unterschieden werden kann, da die erste durchscheinend erscheint, die ganze ZP ausfüllen, und es hat in der Regel zytoplasmatischeGehalt an der Außenseite des Embryos undicht. </li><li> Überprüfen Sie optional die Mikroinjektionseffizienz eines Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie, dass UV-Licht Exposition Embryo Schäden hervorrufen kann, die weitere Entwicklung auswirken können. </li><li> Kulturgruppen von 25 injizierten Embryonen in 50 ul Tropfen Kalium simplex Optimierungsmedium (KSOM) , ergänzt mit 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) unter Mineralöl bei 38,5 ° C, 5% CO 2 in Luft und Feuchtigkeit bis zur Sättigung. </li><li> Ergänzen Sie die Kulturmedien mit 5% FBS zwei Tage nach der Injektion. </li><li> Prüfen Blastozyste (BL) Raten von 7 Tagen nach der Injektion. Berechnen BL Raten als Gesamtzahl der Blastozyste Embryonen / Gesamtzahl der Embryonen kultiviert in diesem Tropfen. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der Injektions...

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel 1 macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet. Zytoplasmatischen Mikroinjektions hat Vorteile gegenüber pronukleären Mikroinjektions da es einfacher ist , durchzuführen und verursacht auch weniger Schaden an den injizierten Embryos, in höheren Lebensfähigkeit resultierende 2. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine erfolgreiche Methode für die Bereitstellung von Lösungen in das Zytoplasma von landwirtschaftlichen Nutztieren Zygoten zu demonstrieren. Zu können auszuführenzytoplasmatischen Mikroinjektions mit hoher Effizienz auf Nutztieren Embryonen wird ein Laser zur Erzeugung eines Lochs in der Zona pellucida (ZP) und dann eine blunt-end Glasnadel für die Mikroinjektion verwendet. Diese Strategie zielt darauf ab, die mechanische Schäden am Embryo während der Injektion eingeprägt zu reduzieren. Dann Aspiration von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionsnadel erlaubt, effizient und sicher ein Bruch des PM zu gewährleisten, dass die Lösung in das Cytoplasma des Embryos geliefert wird. Diese Technik wurde in Rinderembryonen zu liefern siRNA in die zygotic Zytoplasma 3,4 und erzeugen Mutationen mit Hilfe der Cluster regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR zugehörige System 9 (Cas9) System 5 bereits erfolgreich eingesetzt. Es ist auch geeignet (mit geringfügigen Modifikationen) bovine Cumulus-umschlossenen Oozyten 6 einzuspritzen. Hier haben wir unsere Injektionsprotokoll liefert einen Farbstoff beschreiben kann, dass anwendbar sein, jede des zu injizierendenired Lösung in die Zygote, und zeigen, dass diese Technik unter Verwendung minimaler Lyse verursacht und beeinflusst nicht die frühe Embryoentwicklung.

<table><tbody><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Sutter Instrumente</td><td>B100-75-10</td><td>Diese Kapillaren werden für die Herstellung von Halte- und Injektionspipetten verwendet. Es können alle dicken/standardwandigen Borosilikatschläuche ohne Filament verwendet werden.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Ausgestattet mit einer Linse mit 10-facher Vergrößerung.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Ausgestattet mit 4X, 20X Objektiven und mit einem Lasersystem.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Aktiver Laser.</td></tr><tr><td>Mikrodispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>Der Mikrodispenser wird verwendet, um die Embryonen zu bewegen. Es kann auch eine p10-Pipette verwendet werden, die jedoch so wenig Volumen wie möglich lädt.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Kulturschale</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Verwenden Sie den Deckel der Schale, um die Injektionsplatte herzustellen, da sie niedrigere Wände haben und das Positionieren und Bewegen des Mikromanipulators erleichtern. Auch der Deckel einer 60 mm Kulturschale kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>35 mm Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Diese Schalen werden für die Kultivierung der Embryonen in 50 μm verwendet. L Tropfen mit Mineralöl bedeckt. Alternativ kann auch eine 4-Well-Schale verwendet werden. Unabhängig davon, welches Gericht für die Kultivierung der Embryonen gewählt wurde, müssen sie immer mindestens 4 Stunden lang im Inkubator äquilibriert werden, bevor die Embryonen zu ihnen übertragen werden.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Jeder Inkubator, der auf 38,5 μGrad eingestellt werden kann; C, 5% CO2 Bedingungen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Wird zur Visualisierung der Embryonen in den Kulturtropfen und während der Wäsche verwendet. Es kann jedes Stereomikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Steuereinheit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heizsystem am Stereomikroskop angebracht.</td></tr><tr><td>Beheizter Mikroskoptisch</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heizsystem, das am Stereomikroskop befestigt ist.</td></tr><tr>Zur Injektion wird <td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Eine sterile 10 mg/ml Lösung verwendet.</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Bewahren Sie das Mineralöl bei Raumtemperatur auf und schützen Sie es mit Folienpapier vor Licht.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Ergänzt mit 4 mg/ml BSA. KSOM-Platten für die Embryokultur sollten vor der Verwendung mindestens 4 Stunden lang in einem Inkubator äquilibriert werden.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Verwenden Sie ein für Stammzellen qualifiziertes FBS.</td></tr><tr><td>Zygoten</td><td></td><td></td><td>Zygoten werden mit 17 - 20 hpf injiziert und können in-vitro- oder in-vivo-abgeleitet sein.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Endkonzentration: 107,7 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Endkonzentration: 7,16 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Endkonzentration: 1,19 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Endkonzentration: 0,49 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>Natrium DL-Lactat</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Endkonzentration: 5,3 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Endkonzentration: 1,71 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>D-(&minus;)-Fruktose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Endkonzentration: 0,5 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Endkonzentration: 21 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Endkonzentration: 4 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Endkonzentration: 0,33 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Endkonzentration: 1 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Endkonzentration: 1 mg/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Endkonzentration: 5 &mu; g/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>Wasser für den Embryotransfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES-Medium</td><td>Hergestellt im Labor</td><td></td><td>pH 7,3 - 7,4, 280 &plusmn; 10 mOs. Filter sterilisiert durch einen 22 μ; M Filter kann im Kühlschrank bei 4 & Grad gelagert werden; C für 1 Monat. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr></tbody></table>

lasergestützte zytoplasmatischen mikroinjektions in vieh zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Zytoplasmatische Mikroinjektion in einzellige Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Zum Beispiel ermöglicht es die Bereitstellung von Genom-Editing-Tools, die genetische Modifikationen erzeugen können, die in jeder Zelle eines erwachsenen Organismus vorhanden sind. Es kann auch verwendet werden, um siRNAs, mRNAs oder blockierende Antikörper zu verabreichen, um die Genfunktion in Präimplantationsembryonen zu untersuchen. Die herkömmliche Technik zur Mikroinjektion von Embryonen, die bei Nagetieren verwendet wird, besteht aus einer sehr dünnen Mikropipette, die direkt in die Plasmamembran eindringt, wenn sie in den Embryo vordringt. Wenn diese Technik auf Nutztiere angewendet wird, führt sie in der Regel zu einer geringen Effizienz. Dies liegt vor allem daran, dass Rinder-, Schaf- und Schweinezygoten im Gegensatz zu Mäusen und Ratten ein sehr dunkles Zytoplasma und eine hochelastische Plasmamembran aufweisen, die eine Visualisierung während der Injektion und Penetration der Plasmamembran erschwert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine geeignete Mikroinjektionsmethode zur Abgabe von Lösungen in das Zytoplasma von Rinderzygoten, die sich auch bei Schaf- und Schweineembryonen als erfolgreich erwiesen hat. Zuerst wird mit einem Laser ein Loch in die Zona pellucida gebohrt. Dann wird eine Mikropipette mit stumpfem Ende durch das Loch eingeführt und vorgeschoben, bis die Spitze der Nadel etwa 3/4 in den Embryo hineinreicht. Dann wird die Plasmamembran durch Aspiration des zytoplasmatischen Inhalts in der Nadel durchbrochen. Schließlich wird der aspirierte zytoplasmatische Inhalt, gefolgt von der interessierenden Lösung, wieder in das embryonale Zytoplasma injiziert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die Verabreichung verschiedener Lösungen in Rinder- und Schafzygoten mit 100%iger Effizienz, minimaler Lyse und normaler Blastozystenentwicklungsrate eingesetzt.

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 veranscha...

Dieses Protokoll zeigt, wie zytoplasmatische Mikroinjektionen in Nutztierzygoten durchgeführt werden. Diese Technik kann verwendet werden, um jede Lösung in den einzelligen Embryo zu bringen, wie z. B. Genom-Editing-Tools zur Erzeugung von Knockout-Tieren.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lösungen mithilfe einer stumpfen Nadel und mit Unterstützung eines Lasers effektiv in das Zytoplasma von Nutztiereizellen einzubringen. Diese Methode wird in der Forschung und im Bereich der Tiertransgenese eingesetzt; wenn sie beispielsweise mit einem Genom-Editierwerkzeug wie einem CRISPR-Cas9-System kombiniert wird, ermöglicht sie die Erzeugung neuer Rinder zur Untersuchung der Genfunktion sowie die Herstellung transgener Tiere auf sehr einfache und zuverlässige Weise. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Abgabe beliebiger Lösungen in das Zytoplasma von Zygote großer Tierarten verwendet werden kann.Mit einer geschickten Person wird die Injektionseffizienz minimiert und die Raten von Lomotil in der Leber von Tieren verringert. Bereiten Sie zunächst die Injektions-Mikropipette vor, indem Sie eine Borosilikatglas-Kapillare in einen Mikropipettenzuggerät einsetzen und sie festklemmen. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Kapillare zu ziehen, sodass eine dünne Spitze mit langem Übergang entsteht.Entfernen Sie die gezogenen Pipetten anschließend vorsichtig vom Gerät und platzieren Sie sie waagerecht auf einem Mikroschleifer. Bringen Sie die gezogene Pipette und den Heizfaden des Mikroschleifers mit seiner Glasperle in den Fokus. Messen Sie mithilfe des Okular-Netzgitters die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis der Heizfaden den Ziel-Innendurchmesser von fünf Mikrometern erreicht.Stellen Sie die Heizleistung auf etwa 45 % ein und senken Sie die Pipette vorsichtig ab, bis sie das Filament berührt. Aktivieren Sie dann kurzzeitig die Heizung. Dadurch schmilzt die Pipette leicht und verbindet sich mit dem Filament. Beim Abkühlen bricht die Pipette an der Kontaktstelle ab, wodurch ein gerader Schnitt entsteht.Die richtige Temperaturwahl ist bei diesem Schritt entscheidend. Zu hohe Temperaturen verformen die Pipette, während zu niedrige Temperaturen nicht ausreichen, um die Pipette zu schneiden. Erzeugen Sie anschließend in der Nähe der Pipettenspitze einen Winkel von etwa 30 Grad, indem Sie die Spitze etwa 10 Mikrometer vom Heizfaden entfernt positionieren.Stellen Sie die Temperatur auf 60 % ein und aktivieren Sie die Heizung, sodass sich die Pipette über dem Filament in den gewünschten Winkel verbiegt. Ziehen Sie unter Verwendung der hier gezeigten Einstellungen eine Glas-Kapillare, sodass eine Mikropipette mit einer dünnen Spitze, einer langen gleichmäßigen Abschrägung und parallelen Wänden entsteht. Entfernen Sie die gezogene Pipette vorsichtig vom Ziehgerät und platzieren Sie sie waagerecht im Halter der Mikroschmiede.Verwenden Sie das Okularmikrometer, um den Pipettendurchmesser zu messen, und bewegen Sie die Pipette, bis ihr Durchmesser über dem Filament 180 Mikrometer beträgt. Markieren Sie die Glaskapillare mit einem Stift mit Diamantspitze und drücken Sie dann vorsichtig auf die gezogene Spitze, um das Glas zu brechen. Dies sollte einen geraden Schnitt ergeben.Als Nächstes bringen Sie die Pipette in eine vertikale Position, wobei die Spitze nahe am Filament ist. Stellen Sie die Temperatur des Mikroschmelzofens auf 60 % ein und polieren Sie die Pipettenspitze mit Standardtechniken, bis der Innendurchmesser die Zielgröße erreicht hat. Messen Sie den Innendurchmesser der Pipette, der 40 Mikrometer betragen sollte.Verwenden Sie das gleiche Verfahren wie zuvor, um die Spitze in einem Winkel von 30 Grad zu biegen. Führen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulatorhalter und die Injektionspipette in den rechten Mikromanipulatorhalter ein. Danach füllen Sie die Injektionspipette mit Öl.Verwenden Sie die Steuerelemente des Mikromanipulators, um die Pipetten in die Mitte des mikroskopischen Sichtfeldes zu bringen. Überprüfen Sie bei 4facher Vergr&ouml;&szlig;erung, ob die Spitzen der Mikropipetten den richtigen Winkel aufweisen, sodass sie parallel zum Boden der Schale liegen. Geben Sie einen 50 &micro;L gro&szlig;en Tropfen einer SOF-HEPES-L&ouml;sung mit 37 &deg;C, die mit 20 % FBS erg&auml;nzt ist, in die Mitte des Deckels einer 100 mm gro&szlig;en Petrischale.Danach einen Tropfen mit einem Volumen von ein bis zwei Mikrolitern der zu injizierenden Lösung in die Nähe des Injektionstropfens geben. Anschließend die Tropfen und die Injektionsplatte mit etwa 10 Milliliter Mineralöl bedecken. Die Platte auf den Mikroskopständer stellen und mithilfe eines Mikrodispensers etwa 20 bis 30 Zygoten in den oberen Bereich des Injektionstropfens einbringen.Unter Verwendung des 4X-Objektivs die zu injizierende Lösung durch Anlegen von Unterdruck am Mikroinjektor in die Injektionspipette aufziehen. Eine ausreichende Menge der Lösung aufziehen, um zwei bis drei Zygote injizieren zu können, und anschließend zur Injektionstropfen wechseln. Im Injektionstropfen die Haltepipette so bewegen, dass ihre Spitze einer Zygote nahekommt.Üben Sie mit dem Haltemikroinjektor Unterdruck aus, sodass die Zygote an der Haltepipette fixiert wird. Sobald die Zygote sicher befestigt ist, wechseln Sie zu einem 20X-Objektiv. Überprüfen Sie, dass die Injektionspipette in der mittleren Ebene des Embryos positioniert ist, indem Sie die Zygote an der Injektionsstelle vorsichtig berühren.Befindet sich die Nadel nicht in ihrer Mittelposition, neigt sie dazu, den Embryo zu drehen, anstatt ihn zu durchstechen. Verwenden Sie anschließend eine Software, um den Laser senkrecht in der Zona pellucida zu positionieren, wo das Loch angelegt werden soll. Sobald die korrekte Position erreicht ist, nutzen Sie das Laser-Steuerungsfenster und klicken Sie auf die SCHIESSEN-Taste.Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs ausreicht, um eine Öffnung in der Zona pellucida zu schaffen, durch die die Nadel hindurchtreten kann, ohne die Plasmamembran zu beschädigen. Führen Sie die Injektionsnadel durch das Loch in der Zona pellucida und bringen Sie sie mit der Plasmamembran in Kontakt. Drücken Sie die Pipette weiter vor, bis die Nadel zu drei Vierteln in den Embryo eingedrungen ist.Beobachten Sie die Position des Meniskus an der Grenzfläche zwischen Lösung und Öl. Dies wird verwendet, um das Injektionsvolumen konsistent zu steuern. Wenden Sie Unterdruck auf die Injektionspipette an, um die Plasmamembran und das Zytoplasma in die Injektionsnadel aufzusaugen.Fortfahren, bis sich die Bewegung des Zytoplasmas in der Nadel beschleunigt oder bis sichtbar ist, dass Zytoplasma-Inhalte mit der Injektionslösung vermengt werden. Beides deutet auf einen Bruch der Plasmamembran hin. Drücken Sie den zytoplasmatischen Inhalt zurück, gefolgt von der Lösung, in das Zytoplasma der Zygote, indem Sie positiven Druck ausüben, bis der Meniskus an der Phasengrenze zwischen Lösung und Öl um das Äquivalent eines Zygote-Durchmessers gegenüber dem Ausgangspunkt vorgerückt ist.Ändern Sie dann auf ein 4X-Objektiv und bewegen Sie das injizierte Embryo auf die Unterseite des Injektionstropfens. Lassen Sie das Embryo los, indem Sie positiven Druck auf den Halte-Mikroinjektor ausüben. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mithilfe eines Mikrodispensers.Die injizierten Embryonen werden durch die drei Tropfen SOF-HEPES bewegt, um sie zu waschen, und anschließend wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben kultiviert. Eine erfolgreiche Applikation der Lösung ist auf dem fluoreszierenden Bild erkennbar, wobei Dexion-rot verwendet wird, um die Injektionsstelle sowie Effizienz und Genauigkeit der Injektion zu verfolgen. Hier ist der Farbstoff homogen im Zytoplasma verteilt, was typisch ist, wenn diese Technik angewendet wird.Dieses Protokoll weist minimale Lyseraten in bovinen und ovinen Zygote auf. Nur wenige der injizierten Embryonen wurden bei Rind oder Schaf infolge der Mikroinjektion lysiert. Außerdem bestehen keine statistisch signifikanten Unterschiede in den Blastozystenentwicklungsquoten zwischen der Kontrollgruppe und den injizierten Gruppen für bovine und ovine Embryonen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie mit einer Geschwindigkeit von zwei Embryonen pro Minute durchgeführt werden. Bei geschickter Handhabung minimiert die Injektion die Blastozystenraten der Tiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man die laserunterstützte intrazytoplasmatische Mikroinjektion bei Nutztierzellen durchführt.Sowie wie man positiven und negativen Saugdruck verwendet, um die Ruptur der Plasmamembran für eine effiziente Abgabe sicherzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Dieses Video beschreibt eine Technik der Embryo-Mikroinjektion, um Verbindungen in den Dottersack des Zebrafisches zu bringen.

Mikroinjektion von Embryonen: Eine Technik, um eine Verbindung in das Eigelb des Zebrafisches zu bringen

In diesem Video demonstrieren wir die lasergestützte Permeation der Schutzschicht der Zona pellucida in Mäuseeiern, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern. Das Lentivirus ermöglicht die Erzeugung transgener Tiere mit einem Gen von Interesse, das stabil in ihr Genom integriert ist.

Lasergestützte lentivirale Genabgabe: Eine Technik zur Permeabilisierung von befruchteten Eiern von Mäusen, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern

Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Erfahren Sie die lasergestützte zytoplasmatische Mikroinjektion in Nutztierzygoten zur effizienten Zufuhr von Lösungen und Genom-Editing-Tools. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung transgener Tiere mit hoher Präzision.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

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