Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die nanoskalige Verteilung von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Zellplasmamembran mittels Einzelmolekül-Fluoreszenzlokalisationsmikroskopie zu emittieren. Diese Methode hilft, wichtige Fragen zur Phosphoinositid-Signalgebung zu beantworten. Wie ist zum Beispiel die nanoskalige Organisation von Phosphoinositiden unter dem Signalkomplex in der Zellmembran?

Die Hauptvorteile dieser Technik sind die hohe räumliche Auflösung und die Umgehung der Waschmittelbehandlung, die bei morphologischen Untersuchungen von Phospholipiden ein großes Problem darstellt. Dieser Ansatz umfasst drei Hauptschritte. Schritt eins: Die Vorbereitung des Plasmamembranblatts aus lebenden Zellen.

Schritt zwei: Phosphoinositid-Markierung und Einzelmolekül-Floreszenzbildgebung. Schritt drei: Einzelmolekül-Lokalisierung und bildgebende Rekonstruktion. Am Tag des Versuchs wird der Mantelüberzug mit einem halben bis einem Milliliter PDL überzogen.

Ein bis zwei Stunden später nehmen Sie das überschüssige PDL mit Seidenpapier vom Rand des Deckglases auf. Anschließend lagern Sie die Deckgläser auf einer Metallplatte bei vier Grad Celsius. Waschen Sie anschließend voruntersuchte INS-1-Zellen, die auf Deckgläsern gezüchtet wurden, mit einem halben bis einem Milliliter eiskaltem PBS, das ein millimolares EGTA enthält.

Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal und absorbieren Sie das überschüssige PBS. Setzen Sie nun mit einer Pinzette die Deckgläser mit den kultivierten Zellen mit der Zellseite nach unten auf die PDL-beschichteten Deckgläser. Tun Sie dies auf der gekühlten Metallplatte.

Bringen Sie die Platte dann für sieben bis zehn Minuten auf vier Grad Celsius, damit sich die Zellen anheften können. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um das mit Zellen beladene Deckglas vorsichtig abzulösen, wodurch eine dünne Schicht Zellmembran auf dem PDL-beschichteten Deckglas zurückbleibt. Anschließend waschen Sie die Membranplatten vorsichtig mit einem halben bis einem Milliliter eiskaltem PBS.

Fixieren Sie nun jede Membranfolie in ca. 150 Mikrolitern eiskaltem vierprozentigem PFA mit 0,2 Prozent Glutaraldehyd in PBS. Lassen Sie die Membranen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius fixieren. Nach der Fixierung fahren Sie entweder sofort mit der Bildgebung fort oder bedecken Sie die Präparate mit eiskaltem PBS und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Wenn pH-Sonden verwendet werden, wird eine sofortige Bildgebung dringend empfohlen. Für dieses Verfahren wird ein TIRF-mikroskopisches SMLM-System verwendet. Bevor die Membranen abgebildet werden, verdünnen Sie einen Mikroliter fluoreszierende Bead-Lösung in 10 Millilitern PBS mit 50 Millimolar Magnesiumchlorid

Laden Sie dann eine Probe in die Bildgebungskammer, fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lösung hinzu und warten Sie 10 Minuten. Waschen Sie die Probe anschließend dreimal mit PBS. Starten Sie nun das PALM-Imaging-System.

Wählen Sie in der zugehörigen Imaging-Software die Taste iRFP-Kanal aus. Suchen Sie dann die Zellmembran, die die pH-Sonden im iRFP-Kanal exprimiert, und verwenden Sie die fluoreszierenden Kügelchen zur Driftkorrektur. Legen Sie einen normalen TIRF-Winkel auf 2140 fest, der 1,5 tiefer als der kritische TIRF-Winkel ist und der Standardwinkel sein sollte.

Verwenden Sie dann die Capture-Taste, um ein herkömmliches TIRF-Bild im iRFP-Kanal als Referenz zu erfassen. Wechseln Sie anschließend zum PAm-Cherry1-Kanal, indem Sie auf die Schaltfläche RFP-Kanal klicken. Stellen Sie dann die Bildlaufleiste im AOTF-Pad ganz nach rechts ein, um eine vollständige Ausleuchtung zu erzielen, und wenden Sie den Laser etwa 10 bis 20 Sekunden lang an, um die Hintergrundmembranblüte auszubleichen.

Legen Sie als Nächstes die optimale Kameraeinstellung auf der Registerkarte Format auf zwei mal zwei Binning fest. Stellen Sie dann das Schnellerfassungsprotokoll auf der Registerkarte ND-Sequenzerfassung auf 30 000 Bilder bei 20 Hertz ein. Wenden Sie dann während der Bildaufnahme eine Leistung von 0,1 bis einem Prozent an den 405-Nanometer-Laser an, so dass räumlich isolierte Punkte in jedem Bild leicht erkennbar sind.

Erfassen Sie nun PAm-Cherry1-Bilder, indem Sie auf die Schaltfläche Jetzt ausführen klicken. Die Anzahl der Moleküle, die aktiviert werden können, nimmt während der Akquisitionen allmählich ab. Erhöhen Sie als Reaktion darauf die Intensität des 405-Nanometer-Lasers schrittweise, um eine optimale Signaldichte beizubehalten.

Nehmen Sie Bilder auf, bis das gesamte PAm-Cherry1-Signal aktiviert ist. Identifizieren und lokalisieren Sie später bei der Bildverarbeitung und -rekonstruktion die einzelnen molekularen Ereignisse aus jedem Bild. Legen Sie den Schwellenwert für die Filterintensität mit der Schwellenwertnummer im Wavelet fest.

Weitere Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll. Die räumliche Verteilung von PIP2 reagiert empfindlich auf unterschiedliche Fixierungen, wobei die richtige Fixierung im Text beschrieben wird, zeigten PIP2-Sonden eine konsistente Verteilung, wenn sie mit PIP2-Antikörpern oder spezifischen pH-Domänen markiert wurden. Im Vergleich dazu bilden lebende Zellen, die mit EGFP-markierten pH-Domänen markiert sind, nicht viel anders ab.

Alle Proben zeigten eine gleichmäßige Verteilung der Sonden. Im Gegensatz dazu führte eine nicht-optimale Fixierung zu scharf-dichten PIP2-Clustern und einer Abnahme der Signalintensität. Unter optimalen Fixierungsbedingungen zeigten die hochauflösenden Bilder von PIP2 in fixierten Zellen eine homogene Verteilung der Sonden in einem signifikanten Teil der Plasmamembran mit nur begrenzten Konzentrationsgradienten.

Einige mit PIP2-Sonden angereicherte Membranpflaster waren spärlich verteilt und hatten verschiedene Größen. Live-Zellen-PALM-Bilder zeigten eine ähnliche räumliche Verteilung wie fixierte Zellen. Eine detaillierte Analyse der PIP2-Signale zeigte, dass ihre Dynamik in lokalen Gebieten schnell war, was jedoch nicht zu signifikanten Veränderungen in ihrer Gesamthäufigkeit führte.

Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Phospholipide eine neue Möglichkeit, die Verteilung und Aktivität anderer Phosphoinositid-Subtypen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen.