Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik
30. September 2016
RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, spezifische RNA effizient mit Proteinen zu isolieren, die mit der RNA in vivo assoziiert sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im RNA-Stoffwechsel und in der RNA-Regulation zu beantworten, z. B. was ein bestimmter Satz von Fau-Bee-Pees ist, der an ein bestimmtes Transkript gebunden ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Effizienz der Isolierung, die eine nachträgliche Identifizierung von Edel-mRNA-assoziierten Proteinen ermöglicht.
Die schnelle Methode verwendet einen Hefestamm, der MS2-markierte MRNA co-exprimiert, und ein Fusionsprotein aus einem MS2-Bindungsprotein und einem Streptavadin-Bindungsprotein. Züchten Sie 500 Milliliter Hefezellen bei 30 Grad Celsius in synthetischer Dextrose oder SD-selektivem Medium auf eine OD600 von 0,8 bis 1,0. Wenn die Zellen fertig sind, zentrifugieren Sie bei 3000 mal G für 4 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
Waschen Sie die Zellen in PBS und zentrifugieren Sie erneut. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem gleichen Volumen SD ohne Methionin. 45 bis 60 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Expression des Fusionsproteins zu induzieren.
Nach 45 bis 60 Minuten legen Sie 10 Milliliter der Zellen für die RNA-Extraktion beiseite und verwenden Sie die restlichen Zellen für eine schnelle Reinigung. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie den Zellen 1,35 Milliliter 37 % Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.
Um die Vernetzung zu stoppen, fügen Sie 26,5 Milliliter 2,5 molare Glycine zu einer Endkonzentration von 0,125 molar hinzu und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Von hier an halten Sie alles auf Eis und arbeiten schnell, um den RNA-Abbau zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3000 mal G für 4 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Den Überstand verwerfen, 45 Milliliter kaltes PBS hinzufügen und erneut zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 5 Millilitern Schnelllysepuffer, der eine hohe Konzentration an RNASE-Inhibitoren enthält. Die Zellsuspension wird in Mikrofuge-Röhrchen mit Schraubverschluss in Aliquots von 500 Mikrolitern aufgeteilt und jedem Aliquot etwa 400 Milligramm gekühlte Glasperlen zugesetzt.
Lysieren Sie die Zellen in einem Rührbesen drei Minuten lang. Legen Sie das Lysat sofort auf Eis. Übertragen Sie das Lysat auf neue Mikrofugenröhrchen.
Schneiden Sie den Deckel von einer 5-Milliliter-Spritze ab und legen Sie sie auf ein leeres 15-Milliliter-Röhrchen, das als Adapter für Schraubverschlussröhrchen dient. Stechen Sie mit einer heißen Nadel ein kleines Loch in den Boden jedes Röhrchens und legen Sie es auf die angepassten 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Wannenbaugruppen eine Minute lang bei 4 Grad Celsius bei 3000 mal G, um das Lysat auf die 15-Milliliter-Röhrchen zu eluieren.
Übertragen Sie den Durchfluss von jedem 15-Milliliter-Röhrchen auf ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 10.000 Mal G, um die Zelltrümmer zu entfernen. Fassen Sie den Überstand aus allen 1,5-Milliliter-Röhrchen in ein einzelnes 15-Milliliter-Röhrchen zusammen. 1/50 bzw. 1/100 Volumen des Lysats für die RNA- bzw. Proteinisolierung beiseite stellen.
Beginnen Sie das schnelle Verfahren zur Isolierung von RNA-Proteinkomplexen, indem Sie dem Zelllysat 300 Mikrogramm Avidin hinzufügen. 30 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständigem Walzen inkubieren. Während das Zelllysat mit Avidin inkubiert wird, waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen vor, übertragen Sie etwa 300 Mikroliter der Streptavadin-Kügelchenaufschlämmung, um ein Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 Millilitern zu wiegen, zentrifugieren Sie die Zubereitung und entfernen Sie dann den oberen Überstand, was zu 250 Mikrolitern Kügelchen führt.
Geben Sie 1 Milliliter Schnelllysepuffer zu den Kügelchen und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 660-fachem G. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut mit Schnelllysepuffer. Um die Kügelchen zu blockieren, fügen Sie 0,5 Milliliter Schnelllysepuffer, 0,5 Milliliter BSA und 10 Mikroliter Hefe TRNA hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 4 Grad Celsius mit konstanter Rotation.
Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 Milliliter Schnelllysepuffer. Geben Sie 250 Mikroliter der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen zu dem Avidin-haltigen Lysat und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 4 Grad Celsius mit konstanter Rotation. Diese Inkubationszeit ist ein Kompromiss zwischen einer ausreichenden Bindungszeit und der Minimierung der Wahrscheinlichkeit eines RNA-Abbaus.
Nach einer Stunde zentrifugieren Sie bei 660 mal G für 2 Minuten bei 4 Grad Celsius, um die Streptavidin-Kügelchen zu entfernen. Den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. 1/50 bzw. 1/100 Volumen des Lysats für die RNA- bzw. Proteinisolierung beiseite stellen.
Geben Sie 1 Milliliter Schnelllysepuffer zu den Kügelchen. Durch Pipettieren mischen, in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und 2 Minuten bei 4 Grad Celsius bei 660-fachem G zentrifugieren. Noch dreimal mit Schnelllysepuffer waschen.
Entfernen Sie nach der letzten Wäsche mit dem Schnelllysepuffer den Überstand, fügen Sie 1 Milliliter Schnellwaschpuffer hinzu und drehen Sie ihn 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Zentrifugieren und noch 2 Mal mit Schnellwaschpuffer waschen. Die Kügelchen mit 1 Milliliter PBS waschen und wie zuvor zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 120 Mikroliter PBS zu den Kügelchen und drehen Sie sie 5 Minuten lang in einer Rolle. Zentrifugieren Sie wie zuvor und sammeln Sie den gesamten Überstand für die RNA- und Proteinextraktion als Waschprobe. Um RNA und RNA-assoziierte Proteine zu eluieren, fügen Sie den Kügelchen 120 Mikroliter 6 millimolares Biotin in PBS hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit konstanter Rotation.
Zentrifugieren Sie die Kügelchen und geben Sie das ausgewichene Material in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die eluierte Probe erneut und übertragen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, um sicherzustellen, dass keine Kügelchen übergehen. Entnahme von Proben für die RNA- oder Proteinextraktion.
Um die Isolationseffizienz und -qualität der RNA zu bestimmen, wurde die Northern-Analyse für zwei markierte RNAs durchgeführt. PMP1 und FPR1, aus der Gießzelllyse, der schnellen Zelllyse und nach der Elution mit Biotin. Ribosomale RNAs wurden durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen, und das Fehlen ribosomaler RNAs in der Elutionsprobe deutet auf die Strenge der Reinigung hin.
Die Stringenz und Spezifität der Aufreinigung wird auch durch das Fehlen eines Signals einer nicht markierten MRNA in den Elutionsproben demonstriert. Das scheinbare Signal in der FPR1-Spur, das nicht die Größe von ACT1 hat, ist ein Überbleibsel einer früheren Hybridisierung mit der MS2L-Sonde. Obwohl die Eingangs-RNA im Vergleich zu der RNA, die durch das Hot-Phenol-Protokoll gereinigt wurde, etwas stärker abgebaut ist, wird eine signifikante Menge an getaggter RNA in voller Länge spezifisch isoliert, wie das starke Signal in den Elutionsfraktionen zeigt.
Proteinproben können vor der Proteomik-Analyse mittels SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert werden. Das MS2-CP-GFP-SBP-Fusionsprotein, das durch den Pfeil angezeigt wird, weist eine gleichmäßige Proteinbeladung auf. Die Sternchen kennzeichnen Banden mit unterschiedlichen Intensitäten, die später für die massenspektrometrische Analyse aus dem Gel herausgeschnitten wurden.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Handschuhe zu tragen, einen sauberen Arbeitsbereich zu gewährleisten, die Lösung mit RNA-freiem Wasser vorzubereiten und schnell und effizient zu arbeiten, um die Protokollzeit zu verkürzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie Phenol und Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer Chemikalienhaube getroffen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die RNA von Fayn-Tress und dem zugehörigen Körper effizient und effektiv aufreinigen können.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie RNA-Seq durchgeführt werden, um RNAs nachzuweisen, die an das interessierende Transkript binden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine In-vivo-Methode zur Isolierung spezifischer RNA zusammen mit ihren assoziierten Proteinen vor. Diese Technik zielt darauf ab, unser Verständnis der RNA-Regulation in Zellen zu verbessern.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Protein-Interaktionen
- zelluläre Prozesse
- RNA-Stoffwechsel
Hintergrund
- RNA-Protein-Interaktionen sind entscheidend für verschiedene zelluläre Funktionen.
- Das Verständnis dieser Interaktionen kann Einblicke in die RNA-Regulation liefern.
- Bestehende Methoden weisen möglicherweise eine geringe Effizienz bei der Isolierung spezifischer RNA-Protein-Komplexe auf.
- Diese Studie stellt einen neuartigen Ansatz unter Verwendung von Hefestämmen vor.
Zweck der Studie
- Spezifische RNA zu isolieren und assoziierte Proteine in vivo zu identifizieren.
- Fragen zur RNA-Stoffwechselregulation und -regulierung zu beantworten.
- Die Effizienz von Methoden zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Hefestamms, der mRNA mit MS2-Markierung gleichzeitig exprimiert.
- Fusionsprotein aus MS2-Bindungsprotein und Streptavidin-Bindungsprotein.
- Züchtung von Hefezellen in synthetischem Dextrosmedium.
- Zentrifugation zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine hohe Effizienz bei der Isolierung von RNA-Protein-Komplexen erzielt.
- Die Identifizierung neuartiger mRNA-assoziierter Proteine wurde erleichtert.
- Die Methode ermöglicht eine schnelle Probenaufarbeitung.
- Durch diesen Ansatz wurden Erkenntnisse über die RNA-Regulation gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von RNA-Protein-Wechselwirkungen dar.
- Sie vertieft unser Verständnis des RNA-Stoffwechsels und der RNA-Regulation.
- Zukünftige Anwendungen könnten zu Entdeckungen in zellulären Prozessen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Identifizierung von an spezifische Transkripte gebundenen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) ist entscheidend für die Zielvalidierung bei RNA-Therapeutika und die Entdeckung von Biomarkern. Die RaPID-Methode ermöglicht die effiziente in-vivo-Isolierung von RNA-Protein-Komplexen und unterstützt die mechanistische Entlastung, indem funktionelle Wechselwirkungen in einem krankheitsrelevanten System geklärt werden. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er quantitative und reproduzierbare Daten zu RBP-mRNA-Assoziationen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem RBPs identifiziert werden, die an krankheitsrelevante mRNAs wie die an das ER assoziierte PMP1 gebunden sind.
- Operationaler Wert: Bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung nativer RNA-Protein-Komplexe aus Hefe und verringert so falsch-positive Ergebnisse von In-vitro-Methoden.
- Prädiktiver Wert: Stärkt das Vertrauen in Zielstrukturen durch spezifische und effiziente Anreicherung von In-vivo-Interaktionen und unterstützt so die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte biologische Systeme (Hefe-Stämme, die MS2-markierte RNA und Fusionsprotein exprimieren) für nachgeschaltete Screening-Anwendungen.
- Operativer Wert: Standardisiert die komplexe Isolierung mittels Strepavidin-Bead-Pulldown und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten.
- Eignung für Assays: Erzeugt gereinigte RNA- und Protein-Fraktionen, die für eine quantitative Analyse mittels Massenspektrometrie oder Northern Blot geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Identifizierung von RBPs mit der präklinischen Validierung, indem Nachuntersuchungen wie RNA-Seq und SDS-PAGE ermöglicht werden.
- Mechanistische Entwederisikung: Zeigt Stringenz und Spezifität durch das Fehlen von ribosomalen RNA- und nicht markierten mRNA-Signalen in den Elutionsproben.
- Krankheitsrelevante Systeme: Anwendbar auf Hefe-Modelle des RNA-Stoffwechsels, mit möglicher Anpassung an Säugetiersysteme zur Zielvalidierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die RaPID-Methode ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die biologische Risikominimierung vor der Identifizierung von Leitstrukturen und der präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch die Isolierung spezifischer RNA-Protein-Komplexe aus lebenden Bedingungen und klärt funktionelle Assoziationen auf.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays durch standardisierte Isolierung von RNA-Protein-Komplexen und unterstützt reproduzierbare Wirkstoff- oder genetische Screenings.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse mittels Massenspektrometrie und Northern-Blot-Analyse und ermöglicht den Vergleich der RBP-Menge unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die klinische Vorbereitung, indem sie gereinigte Komplexe für die nachgeschaltete Validierung in Krankheitsmodellen bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Identifizierung von RBPs über mehrere Transkripte hinweg und reduziert redundante Methodenentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der RNA-Regulation verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit durch definierte Vernetzungs-, Lysierungs- und bead-basierte Reinigungsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige Daten zu RBP-mRNA-Interaktionen bereitgestellt werden, wodurch biologische Risiken in späteren Stadien reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf validierten RBP-Assoziationen in krankheitsrelevanten Kontexten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie, Hefekultur und Methoden zur Untersuchung von RNA-Protein-Wechselwirkungen.
- Benötigt Instrumente für die Vernetzung (Formaldehyd), die abei basierende Trennung und die Zentrifugation bei mehreren Geschwindigkeiten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Zusammensetzung des Lysepuffers und des Einsatzes von RNase-Inhibitoren, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang von Hefe auf andere Modellsysteme, insbesondere bezüglich der Markierung und Expression von Fusionsproteinen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie das Risiko des RNA-Abbaus während der Probenvorbereitung sowie die Notwendigkeit einer schnellen und kalten Handhabung, um die Integrität der Komplexe zu bewahren.
