Name: Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Isolierung spezifischer RNA mit assoziierten Proteinen in vivo in Hefe. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuer mRNA-bindender Proteine und liefert wertvolle Einblicke in RNA-Regulation und Stoffwechsel.

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Wir danken Prof. Jeff Gerst und Boris Slobodin für ihre hilfreiche Ratschläge bei der schnellen Protokoll der Einrichtung und Bereitstellung der erforderlichen Plasmide. Wir danken auch Dr. Avigail Atir-Lande für ihre Hilfe dieses Protokoll und Dr. Tamar Ziv vom Smoler Proteomics Zentrum für ihre Hilfe bei der LC-MS / MS-Analyse zu etablieren. Wir danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) für den YEF3 Antikörper. Diese Arbeit wurde durch Gewährung 2011013 vom Binationale Science Foundation unterstützt.

Hinweis: eine Sequenz einfügen, bestehend aus 12 MS2-Bindungsstellen (MS2 Schleifen; MS2L) in den genomischen Locus gewünschten, in der Regel zwischen dem offenen Leserahmen (ORF) und der 3&#39;-UTR. Ein detailliertes Protokoll für diese Integration wird an anderer Stelle 22 vorgesehen. Stellen Sie sicher , die richtige Insertion und Expression durch PCR, Northern - Analyse oder RT-PCR 20,23. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die Integration nicht mit der Synthese des 3&#39;-UTR nicht beigetreten sind. Zusätzlich kann ein Plasmid-exprimierenden MS2-CP zu SBP unter der Expression eines induzierbaren Promotors (Methionin Depletion) fusioniert sollte auch in die Zellen 24 eingeführt werden. Ein identischer Stamm, mit Ausnahme der eingeführten MS12 Schleifen sollte als Kontrolle für den Nachweis von nicht-spezifischen Signalen verwendet werden. 1. schnelle Reinigung <ol><li> Wachsen 500 ml Hefezellen (verwenden 250-1,000 ml Hefezellen in Abhängigkeit von dem Expressionsniveau des Gens von Interesse) Exprimieren MS2-markierten mRNA 20 undMS2-CP-GFP-Fusionsprotein SBP 24 bis OD600 von 0,8 bis 1,0 bei 30 o C in dem geeigneten Wachstumsmedium (zB synthetische Dextrose (SD) selektives Medium). </li><li> Centrifuge Zellen bei 3000 × g für 4 min bei RT und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zentrifugieren wie zuvor (Schritt 1.2), Resuspendieren in einem gleichen Volumen (Schritt 1.1) von SD ohne Methionin und Inkubation für 45 - 60 min bei 30 o C Expression der MS2 zu induzieren -CP-GFP-SBP-Fusionsprotein. Hinweis: Längere Induktionszeit-Aggregation von GFP führen kann. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ml Zellen und Extrahieren von RNA aus dieser Probe 25 das einfache &quot;hot Phenol&quot; Methode. Achtung: Phenol ist sehr giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden. Hinweis: Diese RNA für die Qualität der isolierten RNA (1A) eine gute Referenz. </li><li> Für 500 ml Zellen, fügen 1,35 ml 37% Formaldehyd zu einem endgültigen cONZENTRATION von 0,1%, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Weiterhin Inkubation bei 30 o C für 10 min. Vorsicht: Formaldehyd ist hochgiftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitsanweisungen gehandhabt werden. </li><li> Hinzufügen 26,5 ml 2,5 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M und Inkubation für 3 min Vernetzung zu stoppen. Von diesem Schritt auf, alles auf Eis gelegt RNA-Abbau zu minimieren. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 3.000 × g für 4 min bei 4 ° C und Waschen mit 45 ml kaltem 1x PBS. </li><li> Die Zellen in 1 ml Lysis-Puffer RaPID pro 100 ml der ursprünglichen Zellkultur. </li><li> Geteilt in Aliquots von 500 ul in Schraubdeckelröhrchen Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ~ 400 mg gekühlten Glasperlen zu jedem aliquoten Teil (etwa eine volle 0,2 ml PCR-Röhrchen). </li><li> Lyse-Zellen in einem Wulst 3 min Beater. Sofort legte das Lysat auf Eis. Hinweis: Die Zelllyse Releases zelluläre RNasen, die die Hauptursache für RNA-Abbau sind. RaPID Lysis-Puffer enthält eine hohe Konzentration von RNase INHIsteller, wie die unspezifische RNase Inhibitor Heparin und spezifische Inhibitoren. Arbeiten schnell und halten alles kalt wird auch empfohlen. </li><li> Übertragen Sie das Lysat in neue Röhrchen. Pierce ein kleines Loch in der Unterseite jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer heißen Nadel (0,8 mm x 40 mm) und legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf der 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie den Kopf einer 5-ml-Spritze als Adapter zwischen den Mikrozentrifugenröhrchen und den 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen Montage bei 3000 × g für 1 min bei 4 o C </li><li> Übertragung der Durchfluss von der 15 - ml - Röhrchen in ein neues 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 10.000 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Pool Stände aus allen 1,5-ml-Röhrchen in einem einzigen 15-ml-Röhrchen und beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Protein Isolation bzw. eingestellt. Hinweis: Diese als &quot;Input&quot; Proben für die nachfolgende Analyse dienen wird (Abbildung 1). </li><li> In 300 ug Avidin pro 500 ml initial Hefekultur und inkubiere für 30 min (dies auf 10 min reduziert werden können) bei 4 ° C unter konstantem Walzen (10 rpm). Hinweis: Avidin- Blöcke Biotin und biotinylierte Proteine ​​aus den Streptavidin-Kügelchen binden. </li><li> Vorwäsche die Streptavidin-Kügelchen vor der Inkubation mit dem Zelllysat. <ol><li> Übertragen etwa 300 ul der Streptavidin-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Gülle und die obere Überstand zu entfernen. Dies wird in 250 &amp; mgr; l der Kügelchen führen. Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml Lysepuffer RaPID. Zentrifugieren Sie die Streptavidin - Kügelchen bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C zwischen jedem Schritt. </li><li> Blockieren die Perlen durch Inkubation für 1 h mit 0,5 ml RaPID Lysispuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA und 10 ul 10 mg / ml Hefe-tRNA. Perlen können O / N in Blockierungslösung bei 4 ° C unter Rotation bei Bedarf gelassen werden. </li><li> Wasche zweimal mit 1 ml Lysis-Puffer RaPID. Hinweis: Die Magnetkügelchen können auch zur Verringerung der Zeit und backgr verwendet werdenound. Diese haben jedoch geringere Kapazität als Sepharosebeads. </li></ol></li><li> Nach Eintragen von 250 ul der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen mit dem Avidin enthaltenden Lysat (aus Schritt 1.14) und inkubiere 1 h bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). Anmerkung: Diese Inkubationszeit ist ein Kompromiß zwischen einer ausreichenden Bindungszeit Bereitstellung und minimiert die Chancen für die RNA-Abbau. </li><li> Zentrifuge bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C die Streptavidin - Kügelchen zu löschen und den Überstand in ein neues 15 - ml - Röhrchen übertragen. Beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Proteinisolierung sind. Hinweis: Diese werden die &quot;Unbound&quot; Proben sein. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Lysepuffer, leicht schütteln, Transfer in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Waschpuffer, und dieser Zeit drehen (10 Umdrehungen pro Minute) für 5 min bei 4 ° C. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li&gt; <li> Waschen der Kügelchen mit 1 ml 1x PBS und zentrifugiert wie oben beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Perlen wieder mit 120 ul 1x PBS. Zentrifuge nach oben, und nehmen Sie die gesamte Überstand für die RNA-und Proteinextraktion als &quot;Wash&quot; Probe. Hinweis: Diese letzte Waschprobe die Stringenz der Wäschen zeigen werden und sollte als die Elution Probe des gleichen Volumens sein. Dies wird die Verarbeitung und das Laden in den nachfolgenden Tests vereinfachen. </li><li> Zu eluieren, RNA und RNA-assoziierten Proteine ​​aus der Säule, Zugabe von 120 ul 6 mM Biotin in 1x PBS und Inkubation für 45 min bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). </li><li> Zentrifugieren Sie die wie oben Perlen und übertragen das eluierte Material in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Drehen Sie die eluierten Probe erneut und übertragen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen keine Verschleppung von Perlen zu gewährleisten. </li><li> Nehmen Sie Proben für die RNA oder Proteinextraktion. Hinweis: genommen Das Volumen auf dem folgenden Assay und Expressionsniveau des RNA oder Protein von Interesse abhängen. Als Richtwert für die Northern - Analyse 26, nehmen 80% der Probe für Western - Blot 23,27 oder RT-PCR 28, 20% nehmen, und für 29 Massenspektrometrie neue Proteine zu entdecken, die gesamte Probe nehmen. </li></ol> 2. RNA-Extraktion <ol><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Crosslinking Reversal Puffer und Inkubation für 45 min bei 65 ° C. Fahren Sie direkt zur RNA-Extraktion. Hinweis: Das Crosslinking Reversal Puffer enthält Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die deutlich RNA - Extraktion 20 verbessert. </li><li> Verwenden Sie die Standard - Phenol: Chloroform - Methode 26 bis RNA aus dem &quot;Input&quot; zu extrahieren und &quot;ungebunden&quot; Proben (Schritte 1.13 und 1.17). Anmerkung: Diese Proben enthalten eine große Menge des RNase - Inhibitors Heparin, das nachfolgende Rück Transcriptase- (RT) unter Verwendung von Assays inhibieren können (zB RT-PCR), also 30 LiCl Fällung empfohlen wird , sie zu entfernen. Die &quot;wash &quot;und&quot; Elution &quot;Proben (Schritte 1.21 und 1.24) enthalten geringe Mengen an RNA und werden durch die folgenden Schritte gefällt. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) und zwei Volumina 100% Ethanol zum &quot;Waschen&quot; und &quot;Elution&quot; Proben. Inkubieren bei -80 ° C für mindestens 2 Std. Hinweis: Guanidinium effizient Proteine ​​denaturieren und dadurch hemmen RNasen und Proteasen, die in der Probe. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g, 4 ° C für 30 min und den Überstand verwerfen. Waschen des Pellets mit kaltem 80% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 × g, 4 ° C für 15 min. </li><li> Man löst das RNA-Pellet in 400 ul RNase freies Wasser und fallen wieder alle übrig gebliebenen GuHCl oder andere Verunreinigungen zu entfernen. Werden 40 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 800 ul 100% Ethanol, Inkubation bei -20 ° C für mindestens 1 Std. </li><li> Zentrifuge und waschen, wie in Schritt 2.4 und alle Ethanol mit einer 10 &amp; mgr; l Spitze zu entfernen. Resuspendieren RNA Pellet in 10 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. Seien Sie besonders vorsichtig, wie das RNA-Pellet in der Regel nicht sichtbar ist. Hinweis: Die Proben können für Northern - Analyse verwendet werden , wie in 23 (Abbildung 1) beschrieben. </li></ol> 3. Proteinpräparat für Western Blot oder Massenspektrometrie-Analyse <ol><li> Hinzufügen 1/3 Volumen von 4x Laemmli Probenpuffer (LSB) auf Proteinproben und inkubiere 45 min bei 65 ° C die Vernetzung von RNA und Proteine ​​umzukehren. Anmerkung: Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Führen Proteine auf einem SDS - Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Den Prozent des Gels entsprechend der Größe der Proteine ​​analysiert werden. Anmerkung: 10% Acrylamid-Gel gibt eine breite Palette von Trennung und ist gut als erste Näherung. </li><li> Transferproteine an die Membran , wie in dem Standard - Immunoblot - Analyse 27 zur Steuerung der Isolationswirkungsgrad (1C). Fleck mit entweder Coomassie Blau R250 oder Silberfärbung vor der Massenspektrometrie-Analyse. Anmerkung: Silberfärbung die bevorzugte Wahl, da sie empfindlicher ist , und ermöglicht eine bessere Erkennung (1B). Die Färbung kann entweder mit manuell hergestellten Lösungen oder kommerziellen Kits durchgeführt werden. Die Inkubationszeit des Gels in der endgültigen Färbelösung sollte experimentell bestimmt werden. Lange Inkubation kann niedrig reichlich Proteine ​​zeigen, kann aber stark exprimierten Proteine ​​wie MS2-CP-SBP-GFP führen über gefärbt sein und kann rund um Proteine ​​in ihrer Umgebung verschleiern. Darüber hinaus könnte ein hoher Hintergrund auftreten. Folgen Sie der Reaktion sorgfältig und fügen Stopplösung zu gegebener Zeit. </li><li> Schneiden Sie Banden aus dem Gel und sie auf 1,5-ml-Röhrchen. Proben bei -20 ° C, oder zur Proteinextraktion und Trypsin - Verdau durch LC-MS / MS - Analyse 32 gefolgt senden. </li><li> Als Alternative Proteom-Ansatz, um die Gel-Trennungsschritt auszuschließen, verdauen eluierte Material aus Schritt 1.24 in solution unter Verwendung von Trypsin und vorbehaltlich der LC-MS / MS - Analyse 33. Hinweis: Das Weglassen des SDS-PAGE-Trennung das Protokoll vereinfacht und erhöht die Ausbeute. Jedoch könnten Proben Spuren des Detergens enthalten, NP-40, der Massenspektrometrieanalyse hemmt. Um dieses Problem zu lösen, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Führen Protein auf SDS-PAGE 31 10 - 15 min. </li><li> Schneiden Sie den gesamten Abschnitt der Spur aus (dh wo die Proteine befinden). Hinweis: Die Proteinprobe kann eine erhebliche Menge des MS2-CP-SBP-Protein umfassen, die Signale mit niedriger Abundanz Proteine ​​verdunkeln kann. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Verschiedene Methoden verwenden , um die Isolierung von spezifischen mRNAs ihre zugehörigen Proteine 11,34 35 zu identifizieren. Diese Verfahren gelten in vitro und in vivo - Strategien RNA-Protein - Wechselwirkungen zu untersuchen. In - vitro - Verfahren inkubieren exogen RNA mit Zelllysat transkribiert RBPs zu erfassen und RNP - Komplexe 36,37 isolieren. Ein wirksames Konzept dieser Art wurde kürzlich vorgestellt, die die Identifizierung neuer Protei...

RNA-bindende Proteine (RBPs) stellen etwa 10% der S. cerevisiae Proteine 1,2 und etwa 15% von Säugetierproteinen 3-5. Sie sind in vielen zellulären Prozessen wie mRNA posttranskriptionales Verarbeitung und Regulation, Übersetzung, Ribosomenbiogenese, tRNA-Aminoacylierung und Modifikation, Chromatin-Remodeling beteiligt, und vieles mehr. Eine wichtige Untergruppe von RBPs ist die mRNA-bindende Proteine (mRNPs) 6,7. Im Zuge der mRNA Reifung, binden verschiedene RBPs das Transkript und vermitteln ihre Kern Verarbeitung, Export aus dem Zellkern, zelluläre Lokalisation, Übersetzung und Abbau 6-8. Somit bestimmt die unterschiedliche Menge von RBPs auf ein bestimmtes Transkript zu jedem Zeitpunkt verpflichtet, ihre Verarbeitung und letztlich sein Schicksal. Die Identifizierung von RBPs mit einer mRNA verbunden sind, könnten unser Verständnis der Prozesse zugrunde liegen, ihre Post-Transkriptionsregulation verbessern. Diverse genetischeWurden in mRNA Regulation beteiligten Proteine zu identifizieren (in 9-11 prüft), mikroskopische, biochemische und bioinformatische Methoden verwendet. Jedoch nur wenige dieser Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Proteinen mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert. Bemerkenswert ist die Hefe-Drei-Hybrid-System (Y3H), die die mRNA von Interesse als Köder verwendet eine Expressionsbibliothek in Hefezellen zu screenen. Positive Klone werden in der Regel durch eine Wachstumsselektion oder Reporterexpression 12-14 beobachtet. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die große Anzahl von Proteinen, die in einer zellulären Umgebung und die Fähigkeit, abgetastet werden kann, die Festigkeit des RNA-Protein-Wechselwirkung zu messen. Nachteile sind die relativ große Anzahl an falsch positiven Ergebnissen aufgrund der unspezifischen Bindung, und das hohe Potenzial für falsch negative Ergebnisse darauf zurückzuführen, zum Teil auf Fehlfaltungen des Fusionsproteins Beute oder der Köder-RNA. Eine Alternative zur genetischen Ansatz ist Affinität purifiKation RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Poly A enthaltenden mRNAs kann durch die Verwendung von Oligo-dT-Säulen isoliert werden, und deren assoziierte Proteine ​​durch Massenspektrometrie detektiert werden. Die RNA-Protein-Wechselwirkung in seinem zellulären Kontext durch Vernetzung erhalten, die Kurzstrecken-kovalente Bindungen macht. Die Verwendung der Oligo - dT - Säule ergibt eine globale Sicht auf die gesamte Proteom , die mit jeder Poly - A-haltige mRNA 3,5,15 zugeordnet ist. Allerdings bedeutet dies nicht eine Liste von Proteinen bereitzustellen, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind. Nur sehr wenige Methoden zur Verfügung, eine solche Identifikation zu erreichen. Das Paar Verfahren beinhaltet die Transfektion von Nukleinsäure mit Komplementarität zum Ziel - mRNA 16,17. Die Nukleinsäure wird auch an ein Peptid gebunden, das in der Nähe des Interaktionsstelle zu RBPs Vernetzung ermöglicht. Nach der Vernetzung kann das RBP-Peptid-Nukleinsäure isoliert und Proteomik-Analyse unterzogen werden. Vor kurzem wurde ein Aptamer-basierte Methodikerfolgreich angewendet 18 aus Säugerzelllinien extrahiert. Ein RNA-Aptamer mit verbesserter Affinität an Streptavidin wurde auf eine Sequenz von Interesse (AU-rich Element (ARE) in diesem Fall) entwickelt und aufgeschmolzen. Das Aptamer-ARE-RNA wurde an Streptavidin-Kügelchen und gemischt mit Zelllysat angebracht. Proteine, die mit der ARE-Sequenz zugeordnet wurden gereinigt und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Obwohl dieses Verfahren Verbände detektiert , die außerhalb der zellulären Einstellungen auftreten (dh in vitro), ist es wahrscheinlich in der Zukunft modifiziert werden , um die Aptamere in das Genom einzuführen und somit die Isolierung von Proteinen mit der mRNA , während in der zugeordneten Freigabe Zellmilieu (dh in vivo). In Hefe, wo genetische Manipulationen gut etabliert sind, bietet die schnelle Methode (entwickelt von Prof. Jeff Gerst Labor) eine Ansicht der in vivo - Vereinigungen 19. RaPID kombiniert die spezifische und starke Bindung des MS2-Hüllprotein (MS2-CP) an die MS2-RNA-Sequenz und der Streptavidin-Bindungsdomäne (SBP) konjugierte Kügelchen an Streptavidin. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von MS2-markierten mRNAs durch Streptavidinkügelchen. Darüber hinaus wird die Expression von 12 Kopien von MS2-Schleifen können bis zu sechs MS2-CPs bis gleichzeitig an die RNA binden und die Effizienz seiner Isolation zu erhöhen. Dieses Protokoll wurde daher vorgeschlagen, die Identifizierung neuer mRNA-assoziierten Proteinen zu ermöglichen, sobald die eluierten Proben Proteomik-Analyse durch Massenspektrometrie unterzogen werden. Wir RaPID kürzlich verwendet , um neue Proteine zu identifizieren mit der Hefe assoziiert PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA wurde zuvor gezeigt , mit der ER - Membran und dessen 3&#39; - untranslatierten Region (UTR) wurde 21 in diesem Verband eine wichtige Determinante erwiesen assoziiert. So RBPs die PMP1 3 &#39;UTR binden , sind wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Lokalisierung zu spielen. RaPID gefolgt von Flüssigkeitschromatographeny-Massenspektrometrie / Massenspektrometrie (LC-MS / MS) führte zur Identifizierung vieler neuer Proteine , die mit PMP1 20 interagieren. Wir berichten hier über ein detailliertes Protokoll der Methodik RaPID bieten, wichtige Kontrollen, die getan werden müssen, und technische Tipps, die Ausbeute und Spezifität verbessern kann.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biolabor</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Saures Phenol (pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Saures Phenol: Chloroform (5:1, pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biolabor</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease&nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0,4-0,6 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)0,2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-HCl pH 6,8, 8 % SDS, 0,4 M DTT, 40 % Glycerin, 0,04 % Bromphenolblau.</td></tr><tr><td>Heißer Phenol-Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS & nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % und 70 % Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID-Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5 % NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 & micro; g/ml Leupeptin, 10 &Mikro; g/ml Aprotinin, 10 & Mikro; g/ml Sojabohnen-Trypsin-Hemmer, 10 &Mikro; g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuklease&nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Vernetzungspuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0,5% NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silberfleck Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Zum Nachweis von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen</td></tr><tr><td>SD-Selektivmedium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 5 g/l Ammoniumsulfat, 2% Glukose, 350 mg/l Threonin, 40 mg/l Methionin, 40 mg/l Adenin, 50 mg/l Lysin, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidin, 80 mg/l Leucin, 30 mg/l Tyrosin, 40 mg/l Arginin</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td><td>Geschenk von Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medizinische Fakultät)</td><td>1:5.000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti Kaninchen IgG-HRP konjugiert</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10.000</td></tr></tbody></table>

neuartige rna-bindende proteine ​​isolation durch die rasche methodik

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-bindende Proteine (RBPs) spielen eine wichtige Rolle in jedem Aspekt des RNA-Stoffwechsels und der Regulierung. Ihre Identifizierung ist eine große Herausforderung in der modernen Biologie. Nur wenige in vitro und in vivo Methoden ermöglichen die Identifizierung von RBPs, die mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert sind. Ihre Haupteinschränkungen sind jedoch die Identifizierung von RBPs in einer nicht-zellulären Umgebung (in vitro) oder die Isolierung von RNA von Interesse mit geringer Effizienz (in vivo). Eine RNA-bindende Proteinreinigungs- und -identifizierungsmethode (RaPID) wurde entwickelt, um diese Einschränkungen in Hefe zu überwinden und eine effiziente Isolierung von Proteinen zu ermöglichen, die in vivo assoziiert sind. Um dies zu erreichen, wird die RNA von Interesse mit MS2-Schleifen markiert und mit einem Fusionsprotein aus einem MS2-bindenden Protein und einem Streptavidin-bindenden Protein (SBP) koexprimiert. Die Zellen werden dann vernetzt und lysiert, und die Komplexe werden durch Streptavidin-Kügelchen isoliert. Die Proteine, die mit der getaggten RNA co-aufreinigen, können dann durch Massenspektrometrie bestimmt werden. Wir haben dieses Protokoll kürzlich verwendet, um neue Proteine zu identifizieren, die mit der ER-assoziierten PMP1-mRNA assoziiert sind. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll von RaPID zur Verfügung und diskutieren einige seiner Einschränkungen und Vorteile.

RaPID ermöglicht die Isolierung einer spezifischen Ziel-RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Kritisch für den Erfolg hält die RNA intakt, so viel wie möglich, wodurch eine ausreichende Menge der Proteine ​​zu erhalten. Um die Isolation Effizienz und Qualität der RNA, Northern - Analyse durchgeführt (Abbildung 1A) bestimmen. Die Northern-Analyse hat den Vorteil, unmittelbar auf die Effizienz und die Qualität der raschen Meldung. Somit können die relativen Mengen von in ...

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, spezifische RNA effizient zusammen mit Proteinen zu isolieren, die in vivo mit der RNA assoziiert sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum RNA-Stoffwechsel und zur RNA-Regulation zu beantworten, beispielsweise welche spezifische Menge an Fau-Bee-E-Pees an einen bestimmten Transkript gebunden ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der hohen Effizienz der Isolierung, wodurch eine anschließende Identifizierung neuartiger mit mRNA assoziierter Proteine ermöglicht wird.Die schnelle Methode nutzt einen Hefestamm, der ein mit MS2 markiertes mRNA-Molekül und ein Fusionsprotein aus einem MS2-Bindeprotein und einem Streptavidin-Bindeprotein gleichzeitig exprimiert. Kultivieren Sie 500 Milliliter Hefezellen bei 30 Grad Celsius in synthetischem Dextrose- oder SD-selektivem Medium bis zu einem OD600 von 0,8 bis 1,0. Sobald die Zellen bereit sind, zentrifugieren Sie bei 3000 × g für 4 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.Die Zellen mit PBS waschen und erneut zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in einem gleichen Volumen SD ohne Methionin resuspendieren. 45 bis 60 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Expression des Fusionsproteins zu induzieren.Nach 45 bis 60 Minuten 10 Milliliter der Zellen für die RNA-Extraktion beiseite stellen und die restlichen Zellen für die schnelle Reinigung verwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, 1,35 Milliliter 37%igen Formaldehyd zu den Zellen hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erreichen, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Anschließend 10 Minuten bei 30 Grad Celsius weiter inkubieren.Um die Vernetzung zu stoppen, geben Sie 26,5 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,125 mol/L zu erreichen, und inkubieren Sie 3 Minuten bei 30 Grad Celsius. Ab diesem Punkt halten Sie alles auf Eis und arbeiten Sie schnell, um den RNA-Abbau zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Zellen 4 Minuten bei 4 Grad Celsius mit 3000 × g.Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 45 Milliliter kalte PBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 Milliliter Schnelllysepuffer, der eine hohe Konzentration an Rnase-Inhibitoren enthält. Verteilen Sie die Zellsuspension auf Aliquote zu je 500 Mikroliter in Schraubverschluss-Mikrofugegefäßen und geben Sie etwa 400 Milligramm gekühlte Glasperlen zu jedem Aliquot hinzu.Lysieren Sie die Zellen in einem Zellzerreiber für drei Minuten. Stellen Sie das Lysat sofort auf Eis. Überführen Sie das Lysat in neue Mikrozentrifugenröhrchen.Schneiden Sie die Spitze einer 5-Milliliter-Spritze ab und setzen Sie sie auf ein leeres 15-Milliliter-Röhrchen, um als Adapter für Schraubverschlussröhrchen zu dienen. Durchbohren Sie mit einer heißen Nadel ein kleines Loch in den Boden jedes Röhrchens und stellen Sie sie auf die vorbereiteten 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchenanordnungen bei 3000 × g für eine Minute bei 4 °C, um den Lysat in die 15-Milliliter-Röhrchen zu eluieren.Überführen Sie das Durchflussvolumen aus jedem 15-Milliliter-Röhrchen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten bei 10.000 × g und 4 °C, um zelluläre Trümmer zu entfernen. Vereinigen Sie das Überstandsvolumen aus allen 1,5-Milliliter-Röhrchen in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen. Heben Sie 1/50 und 1/100 des Lyssatvolumens für die RNA- bzw. Proteinisolierung beiseite.Beginnen Sie das schnelle Verfahren zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen, indem Sie 300 Mikrogramm Avidin zum Zelllysat hinzufügen. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständigem Rollen. Während das Zelllysat mit Avidin inkubiert wird, waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen vor, überführen etwa 300 Mikroliter der Streptavidin-Kügelchenschlämme in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie die Zubereitung und entfernen Sie anschließend den überstehenden Überstand, sodass 250 Mikroliter Kügelchen übrig bleiben.Geben Sie 1 Milliliter Puffer für die schnelle Lyse zu den Perlen und zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 660 × g und 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie erneut mit Puffer für die schnelle Lyse. Um die Perlen zu blockieren, geben Sie 0,5 Milliliter Puffer für die schnelle Lyse, 0,5 Milliliter BSA und 10 Mikroliter Hefe-tRNA hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 4 °C unter ständiger Rotation.Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 Milliliter Schnelllysepuffer. Geben Sie 250 Mikroliter der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen zum Avidin enthaltenden Lysat hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 4 Grad Celsius unter ständiger Rotation. Diese Inkubationszeit stellt einen Kompromiss dar zwischen ausreichender Bindungszeit und der Minimierung der Möglichkeit einer RNA-Degradation.Nach einer Stunde bei 4 Grad Celsius mit 660 × g für 2 Minuten zentrifugieren, um die Streptavidin-Kügelchen zu entfernen. Den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Einen 1/50-Volumenanteil für die RNA-Isolierung und einen 1/100-Volumenanteil für die Proteinisolierung beiseitelegen.Geben Sie 1 Milliliter Puffer für schnelle Lyse zu den Perlen. Mischen Sie durch Pipettieren, überführen Sie die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 660 × g und 4 °C. Waschen Sie die Probe anschließend dreimal zusätzlich mit Puffer für schnelle Lyse.Nach der letzten Waschung mit dem schnellen Lysepuffer entfernen Sie den Überstand, geben 1 Milliliter schnellen Waschpuffer hinzu und rotieren 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie und waschen Sie die Probe weitere 2 Mal mit dem schnellen Waschpuffer. Waschen Sie die Kügelchen mit 1 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie wie zuvor.Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 120 Mikroliter PBS zu den Kügelchen hinzu und rotieren Sie 5 Minuten lang in einem Rollapparat. Zentrifugieren Sie wie zuvor und sammeln Sie den gesamten Überstand zur RNA- und Proteinextraktion als Waschprobe. Zum Eluieren der RNA und der RNA-assoziierten Proteine geben Sie 120 Mikroliter 6 Millimolar Biotin in PBS zu den Kügelchen hinzu und inkubieren 45 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständiger Rotation.Zentrifugieren Sie die Kügelchen und überführen Sie das eluierte Material in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die eluierte Probe erneut und überführen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine Mitnahme der Kügelchen auszuschließen. Entnehmen Sie Proben zur RNA- oder Proteinisolierung.Um die Isolationsausbeute und -qualität von RNA zu bestimmen, wurde eine Northern-Analyse für zwei markierte RNAs durchgeführt: PMP1 und FPR1, aus der Zelllyse mittels Cast-Verfahren, der schnellen Zelllyse sowie nach der Elution mit Biotin. Ribosomale RNAs wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen, und das Fehlen ribosomaler RNAs in der Elutionsprobe weist auf die Stringenz der Reinigung hin.Die Stringenz und Spezifität der Aufreinigung werden weiterhin durch das Fehlen eines Signals eines nicht markierten mRNA-Moleküls in den Elutionsproben belegt. Das sichtbare Signal im FPR1-Lane, das nicht der Größe von ACT1 entspricht, stammt von einer vorherigen Hybridisierung mit der MS2L-Sonde. Obwohl die Input-RNA etwas stärker degradiert ist im Vergleich zur mittels Hot-Phenol-Protokoll aufgereinigten RNA, wird eine signifikante Menge vollständiger, markierter RNA spezifisch isoliert, wie das starke Signal in den Elutionsfraktionen zeigt.Proteinproben können vor der Proteomanalyse mittels SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert werden. Das durch den Pfeil markierte MS2-CP-GFP-SBP-Fusionsprotein zeigt eine gleichmäßige Proteinbeladung. Die Sternchen kennzeichnen Banden mit unterschiedlichen Intensitäten, die später aus dem Gel ausgeschnitten und der Massenspektrometrie-Analyse unterzogen wurden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Handschuhe zu tragen, einen sauberen Arbeitsbereich sicherzustellen, Lösungen mit RNA-freiem Wasser herzustellen und zügig sowie effizient zu arbeiten, um die Dauer des Protokolls zu verkürzen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Reagenzien wie Phenol und Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einem Abzug, während Sie dieses Verfahren durchführen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA von fayn-tress und ihrem assoziierten Körper effizient und wirksam reinigt.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Seq durchgeführt werden, um RNAs zu detektieren, die an den Transkript von Interesse binden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

In diesem Video beschreiben wir die systematische Evolution von Liganden mit der Exponentialanreicherungsmethode (SELEX), um spezifische RNA-Bindungssequenzen für ein Zielprotein von Interesse zu identifizieren. Das Protein wird mit einem großen Pool randomisierter RNA-Sequenzen inkubiert, und die proteinbindenden RNA-Sequenzen werden isoliert, PCR-amplifiziert und sequenziert, um ihre Proteinbindungsstellen zu identifizieren.

SELEX-basierter In-vitro-Bindungsassay zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Isolierung spezifischer RNA mit assoziierten Proteinen in vivo in Hefe. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuer mRNA-bindender Proteine und liefert wertvolle Einblicke in RNA-Regulation und Stoffwechsel.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

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