Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik
30. September 2016
RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, spezifische RNA effizient zusammen mit Proteinen zu isolieren, die in vivo mit der RNA assoziiert sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum RNA-Stoffwechsel und zur RNA-Regulation zu beantworten, beispielsweise welche spezifische Menge an Fau-Bee-E-Pees an einen bestimmten Transkript gebunden ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der hohen Effizienz der Isolierung, wodurch eine anschließende Identifizierung neuartiger mit mRNA assoziierter Proteine ermöglicht wird.
Die schnelle Methode nutzt einen Hefestamm, der ein mit MS2 markiertes mRNA-Molekül und ein Fusionsprotein aus einem MS2-Bindeprotein und einem Streptavidin-Bindeprotein gleichzeitig exprimiert. Kultivieren Sie 500 Milliliter Hefezellen bei 30 Grad Celsius in synthetischem Dextrose- oder SD-selektivem Medium bis zu einem OD600 von 0,8 bis 1,0. Sobald die Zellen bereit sind, zentrifugieren Sie bei 3000 × g für 4 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
Die Zellen mit PBS waschen und erneut zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in einem gleichen Volumen SD ohne Methionin resuspendieren. 45 bis 60 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Expression des Fusionsproteins zu induzieren.
Nach 45 bis 60 Minuten 10 Milliliter der Zellen für die RNA-Extraktion beiseite stellen und die restlichen Zellen für die schnelle Reinigung verwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, 1,35 Milliliter 37%igen Formaldehyd zu den Zellen hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erreichen, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Anschließend 10 Minuten bei 30 Grad Celsius weiter inkubieren.
Um die Vernetzung zu stoppen, geben Sie 26,5 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,125 mol/L zu erreichen, und inkubieren Sie 3 Minuten bei 30 Grad Celsius. Ab diesem Punkt halten Sie alles auf Eis und arbeiten Sie schnell, um den RNA-Abbau zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Zellen 4 Minuten bei 4 Grad Celsius mit 3000 × g.
Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 45 Milliliter kalte PBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 Milliliter Schnelllysepuffer, der eine hohe Konzentration an Rnase-Inhibitoren enthält. Verteilen Sie die Zellsuspension auf Aliquote zu je 500 Mikroliter in Schraubverschluss-Mikrofugegefäßen und geben Sie etwa 400 Milligramm gekühlte Glasperlen zu jedem Aliquot hinzu.
Lysieren Sie die Zellen in einem Zellzerreiber für drei Minuten. Stellen Sie das Lysat sofort auf Eis. Überführen Sie das Lysat in neue Mikrozentrifugenröhrchen.
Schneiden Sie die Spitze einer 5-Milliliter-Spritze ab und setzen Sie sie auf ein leeres 15-Milliliter-Röhrchen, um als Adapter für Schraubverschlussröhrchen zu dienen. Durchbohren Sie mit einer heißen Nadel ein kleines Loch in den Boden jedes Röhrchens und stellen Sie sie auf die vorbereiteten 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchenanordnungen bei 3000 × g für eine Minute bei 4 °C, um den Lysat in die 15-Milliliter-Röhrchen zu eluieren.
Überführen Sie das Durchflussvolumen aus jedem 15-Milliliter-Röhrchen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten bei 10.000 × g und 4 °C, um zelluläre Trümmer zu entfernen. Vereinigen Sie das Überstandsvolumen aus allen 1,5-Milliliter-Röhrchen in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen. Heben Sie 1/50 und 1/100 des Lyssatvolumens für die RNA- bzw. Proteinisolierung beiseite.
Beginnen Sie das schnelle Verfahren zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen, indem Sie 300 Mikrogramm Avidin zum Zelllysat hinzufügen. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständigem Rollen. Während das Zelllysat mit Avidin inkubiert wird, waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen vor, überführen etwa 300 Mikroliter der Streptavidin-Kügelchenschlämme in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie die Zubereitung und entfernen Sie anschließend den überstehenden Überstand, sodass 250 Mikroliter Kügelchen übrig bleiben.
Geben Sie 1 Milliliter Puffer für die schnelle Lyse zu den Perlen und zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 660 × g und 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie erneut mit Puffer für die schnelle Lyse. Um die Perlen zu blockieren, geben Sie 0,5 Milliliter Puffer für die schnelle Lyse, 0,5 Milliliter BSA und 10 Mikroliter Hefe-tRNA hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 4 °C unter ständiger Rotation.
Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 Milliliter Schnelllysepuffer. Geben Sie 250 Mikroliter der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen zum Avidin enthaltenden Lysat hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 4 Grad Celsius unter ständiger Rotation. Diese Inkubationszeit stellt einen Kompromiss dar zwischen ausreichender Bindungszeit und der Minimierung der Möglichkeit einer RNA-Degradation.
Nach einer Stunde bei 4 Grad Celsius mit 660 × g für 2 Minuten zentrifugieren, um die Streptavidin-Kügelchen zu entfernen. Den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Einen 1/50-Volumenanteil für die RNA-Isolierung und einen 1/100-Volumenanteil für die Proteinisolierung beiseitelegen.
Geben Sie 1 Milliliter Puffer für schnelle Lyse zu den Perlen. Mischen Sie durch Pipettieren, überführen Sie die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 660 × g und 4 °C. Waschen Sie die Probe anschließend dreimal zusätzlich mit Puffer für schnelle Lyse.
Nach der letzten Waschung mit dem schnellen Lysepuffer entfernen Sie den Überstand, geben 1 Milliliter schnellen Waschpuffer hinzu und rotieren 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie und waschen Sie die Probe weitere 2 Mal mit dem schnellen Waschpuffer. Waschen Sie die Kügelchen mit 1 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie wie zuvor.
Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 120 Mikroliter PBS zu den Kügelchen hinzu und rotieren Sie 5 Minuten lang in einem Rollapparat. Zentrifugieren Sie wie zuvor und sammeln Sie den gesamten Überstand zur RNA- und Proteinextraktion als Waschprobe. Zum Eluieren der RNA und der RNA-assoziierten Proteine geben Sie 120 Mikroliter 6 Millimolar Biotin in PBS zu den Kügelchen hinzu und inkubieren 45 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständiger Rotation.
Zentrifugieren Sie die Kügelchen und überführen Sie das eluierte Material in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die eluierte Probe erneut und überführen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine Mitnahme der Kügelchen auszuschließen. Entnehmen Sie Proben zur RNA- oder Proteinisolierung.
Um die Isolationsausbeute und -qualität von RNA zu bestimmen, wurde eine Northern-Analyse für zwei markierte RNAs durchgeführt: PMP1 und FPR1, aus der Zelllyse mittels Cast-Verfahren, der schnellen Zelllyse sowie nach der Elution mit Biotin. Ribosomale RNAs wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen, und das Fehlen ribosomaler RNAs in der Elutionsprobe weist auf die Stringenz der Reinigung hin.
Die Stringenz und Spezifität der Aufreinigung werden weiterhin durch das Fehlen eines Signals eines nicht markierten mRNA-Moleküls in den Elutionsproben belegt. Das sichtbare Signal im FPR1-Lane, das nicht der Größe von ACT1 entspricht, stammt von einer vorherigen Hybridisierung mit der MS2L-Sonde. Obwohl die Input-RNA etwas stärker degradiert ist im Vergleich zur mittels Hot-Phenol-Protokoll aufgereinigten RNA, wird eine signifikante Menge vollständiger, markierter RNA spezifisch isoliert, wie das starke Signal in den Elutionsfraktionen zeigt.
Proteinproben können vor der Proteomanalyse mittels SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert werden. Das durch den Pfeil markierte MS2-CP-GFP-SBP-Fusionsprotein zeigt eine gleichmäßige Proteinbeladung. Die Sternchen kennzeichnen Banden mit unterschiedlichen Intensitäten, die später aus dem Gel ausgeschnitten und der Massenspektrometrie-Analyse unterzogen wurden.
Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Handschuhe zu tragen, einen sauberen Arbeitsbereich sicherzustellen, Lösungen mit RNA-freiem Wasser herzustellen und zügig sowie effizient zu arbeiten, um die Dauer des Protokolls zu verkürzen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Reagenzien wie Phenol und Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einem Abzug, während Sie dieses Verfahren durchführen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA von fayn-tress und ihrem assoziierten Körper effizient und wirksam reinigt.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Seq durchgeführt werden, um RNAs zu detektieren, die an den Transkript von Interesse binden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine In-vivo-Methode zur Isolierung spezifischer RNA zusammen mit ihren assoziierten Proteinen vor. Diese Technik zielt darauf ab, unser Verständnis der RNA-Regulation in Zellen zu verbessern.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Protein-Interaktionen
- zelluläre Prozesse
- RNA-Stoffwechsel
Hintergrund
- RNA-Protein-Interaktionen sind entscheidend für verschiedene zelluläre Funktionen.
- Das Verständnis dieser Interaktionen kann Einblicke in die RNA-Regulation liefern.
- Bestehende Methoden weisen möglicherweise eine geringe Effizienz bei der Isolierung spezifischer RNA-Protein-Komplexe auf.
- Diese Studie stellt einen neuartigen Ansatz unter Verwendung von Hefestämmen vor.
Zweck der Studie
- Spezifische RNA zu isolieren und assoziierte Proteine in vivo zu identifizieren.
- Fragen zur RNA-Stoffwechselregulation und -regulierung zu beantworten.
- Die Effizienz von Methoden zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Hefestamms, der mRNA mit MS2-Markierung gleichzeitig exprimiert.
- Fusionsprotein aus MS2-Bindungsprotein und Streptavidin-Bindungsprotein.
- Züchtung von Hefezellen in synthetischem Dextrosmedium.
- Zentrifugation zur Isolierung von RNA-Protein-Komplexen.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine hohe Effizienz bei der Isolierung von RNA-Protein-Komplexen erzielt.
- Die Identifizierung neuartiger mRNA-assoziierter Proteine wurde erleichtert.
- Die Methode ermöglicht eine schnelle Probenaufarbeitung.
- Durch diesen Ansatz wurden Erkenntnisse über die RNA-Regulation gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von RNA-Protein-Wechselwirkungen dar.
- Sie vertieft unser Verständnis des RNA-Stoffwechsels und der RNA-Regulation.
- Zukünftige Anwendungen könnten zu Entdeckungen in zellulären Prozessen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Identifizierung von an spezifische Transkripte gebundenen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) ist entscheidend für die Zielvalidierung bei RNA-Therapeutika und die Entdeckung von Biomarkern. Die RaPID-Methode ermöglicht die effiziente in-vivo-Isolierung von RNA-Protein-Komplexen und unterstützt die mechanistische Entlastung, indem funktionelle Wechselwirkungen in einem krankheitsrelevanten System geklärt werden. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er quantitative und reproduzierbare Daten zu RBP-mRNA-Assoziationen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem RBPs identifiziert werden, die an krankheitsrelevante mRNAs wie die an das ER assoziierte PMP1 gebunden sind.
- Operationaler Wert: Bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung nativer RNA-Protein-Komplexe aus Hefe und verringert so falsch-positive Ergebnisse von In-vitro-Methoden.
- Prädiktiver Wert: Stärkt das Vertrauen in Zielstrukturen durch spezifische und effiziente Anreicherung von In-vivo-Interaktionen und unterstützt so die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte biologische Systeme (Hefe-Stämme, die MS2-markierte RNA und Fusionsprotein exprimieren) für nachgeschaltete Screening-Anwendungen.
- Operativer Wert: Standardisiert die komplexe Isolierung mittels Strepavidin-Bead-Pulldown und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten.
- Eignung für Assays: Erzeugt gereinigte RNA- und Protein-Fraktionen, die für eine quantitative Analyse mittels Massenspektrometrie oder Northern Blot geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Identifizierung von RBPs mit der präklinischen Validierung, indem Nachuntersuchungen wie RNA-Seq und SDS-PAGE ermöglicht werden.
- Mechanistische Entwederisikung: Zeigt Stringenz und Spezifität durch das Fehlen von ribosomalen RNA- und nicht markierten mRNA-Signalen in den Elutionsproben.
- Krankheitsrelevante Systeme: Anwendbar auf Hefe-Modelle des RNA-Stoffwechsels, mit möglicher Anpassung an Säugetiersysteme zur Zielvalidierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die RaPID-Methode ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die biologische Risikominimierung vor der Identifizierung von Leitstrukturen und der präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch die Isolierung spezifischer RNA-Protein-Komplexe aus lebenden Bedingungen und klärt funktionelle Assoziationen auf.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays durch standardisierte Isolierung von RNA-Protein-Komplexen und unterstützt reproduzierbare Wirkstoff- oder genetische Screenings.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse mittels Massenspektrometrie und Northern-Blot-Analyse und ermöglicht den Vergleich der RBP-Menge unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die klinische Vorbereitung, indem sie gereinigte Komplexe für die nachgeschaltete Validierung in Krankheitsmodellen bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Identifizierung von RBPs über mehrere Transkripte hinweg und reduziert redundante Methodenentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der RNA-Regulation verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit durch definierte Vernetzungs-, Lysierungs- und bead-basierte Reinigungsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige Daten zu RBP-mRNA-Interaktionen bereitgestellt werden, wodurch biologische Risiken in späteren Stadien reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf validierten RBP-Assoziationen in krankheitsrelevanten Kontexten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie, Hefekultur und Methoden zur Untersuchung von RNA-Protein-Wechselwirkungen.
- Benötigt Instrumente für die Vernetzung (Formaldehyd), die abei basierende Trennung und die Zentrifugation bei mehreren Geschwindigkeiten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Zusammensetzung des Lysepuffers und des Einsatzes von RNase-Inhibitoren, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang von Hefe auf andere Modellsysteme, insbesondere bezüglich der Markierung und Expression von Fusionsproteinen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie das Risiko des RNA-Abbaus während der Probenvorbereitung sowie die Notwendigkeit einer schnellen und kalten Handhabung, um die Integrität der Komplexe zu bewahren.
