Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Anteile und absoluten Konzentrationen von STAT3-Spleißvariantentranskripten in Eosinophilen zu quantifizieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Spleißregulierung beantworten, wie z. B. die Koassoziation distaler Spleißereignisse und die Identifizierung von Bedingungen, die zu unterschiedlichen Tandem-Spleißverhältnissen führen können. Der Hauptvorteil dieser Technik sind die Plasmidstandards, die die Erfassung absoluter und relativer qPCR-Daten ermöglichen, so dass wir die Anteile und Gesamtspiegel von vier STAT3-Transkripten bestimmen können.

In unserem Fall möchten wir erfahren, wie sich die vier STAT3-Varianten S alpha, S beta, Delta S alpha und Delta S beta verändern, wenn Eosinophile durch Zytokine stimuliert werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Zusammensetzung von eosinophilem STAT3 geben kann, kann sie auch auf andere Zelltypen angewendet werden, für die cDNA gewonnen werden kann. Da S und delta S nur in drei Nukleotiden variieren, mussten wir die Effizienz opfern, um Spezifität in beiden Standardstandards für jede Variante zu erreichen.

In diesem Protokoll wird cDNA, die aus humanen Eosinophilen hergestellt wurde, als Template für die Amplifikation der STAT3-Spleißvarianten verwendet. Nach der Erzeugung der Plasmide, wie im Textprotokoll beschrieben, Sequenzierungsreaktionen für die Sequenzierung von Plasmiden aus mehreren Kolonien vorbereiten. Jede 20-Mikroliter-Reaktion sollte drei Mikroliter Sequenzierreaktionspuffer, zwei Mikroliter Sequenzierreaktionsgemisch, 12 Mikroliter Reinstwasser, einen Mikroliter Plasmid und zwei Mikroliter Sequenzierprimer enthalten.

Wenn die Sequenzierungsergebnisse vorliegen, werden die Elektrophoretogramme der Plasmide, die für jede Variante kodieren, bewertet. S alpha, S beta, delta S alpha und delta S beta. Messen Sie die Konzentration von reiner Plasmid-DNA in Nanogramm pro Mikroliter und berechnen Sie die Kopienzahl pro Mikroliter. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Verdünnungsreihe von eins zu 10 der STAT3-Plasmide mit Reinstwasser herstellen.

Mit ca. 10 bis zum achten bis 10 bis zum dritten Exemplar pro Mikroliter. Messen Sie die Konzentration der am stärksten konzentrierten Probe. Verwenden Sie die verdünnten Plasmide, um vier Nicht-Zielmischungen als Negativkontrollen für jede Spleißvariante mit 10 bis sechs Kopien pro Mikroliter für jede Variante herzustellen.

Bereiten Sie eine Zielmischung mit gleichen Konzentrationen aller vier Matrizen vor, jeweils mit 10 bis sechs Kopien pro Mikroliter. Bereiten Sie Primerpaarlösungen für jede Spleißvariante mit 60 Mikrolitern Primern mit einer Konzentration von jeweils sieben Mikromolaren vor, um eine Endkonzentration von 560 Nanomolar in der Probe zu erreichen. Verdünnen Sie die DNA-Polymerase, eine doppelsträngige DNA-Bindungsfarbstoffmischung, sieben bis fünf mit reinem Wasser.

Richten Sie den Assay in einer 96-Well-PCR-Platte gemäß dieser Vorlage ein. Zuerst werden in jede Vertiefung 21 Mikroliter der verdünnten DNA-Polymerase, einer doppelsträngigen DNA-Bindungsfarbstoffmischung, gegeben. Fügen Sie dann zwei Mikroliter Grundiermischung und zwei Mikroliter Schablone hinzu.

Zu jeder Kontrollvertiefung ohne Schablone fügen Sie zwei Mikroliter gefiltertes Wasser anstelle der Schablone hinzu. Richten Sie die Reaktionen in Duplikaten ein, um die Wiederholbarkeit zu bewerten. Verschließen Sie die qPCR-Platte mit einer Klebeabdeckung und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1.200 g bei 12 Grad Celsius.

Schalten Sie das qPCR-Gerät ein und setzen Sie die versiegelte qPCR-Platte ein. Wenn Sie das ABI-Real-Time-PCR-System verwenden, richten Sie das Experiment wie gezeigt ein. Klicken Sie auf Datei, Neu, Weiter, wählen Sie Neuer Detektor aus, geben Sie einen Namen ein und wählen Sie einen Reporter und einen Quencher aus.

Richten Sie für jede Spleißvariante einen neuen Detektor ein. Wählen Sie Weiter aus und richten Sie die Standards wie auf der Seite Probenplatte einrichten entsprechend ein, wobei Sie sicherstellen, dass die Mengen in die Tabelle eingegeben und die entsprechenden Detektoren ausgewählt sind. Klicken Sie auf Fertig stellen.

Richten Sie das passende PCR-Cycling-Programm ein. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmessung zur Bestimmung der Schwellenwerte des Zyklus während des 72-Grad-Celsius-Schritts jedes Zyklus erfolgt. Wählen Sie Ausführen aus.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse, Registerkarte Verstärkungsdiagramm. Werten Sie das Ausgabeverstärkungsdiagramm aus, um die Datenqualität zu bewerten. Ein Exponentialdiagramm zeigt eine zuverlässige Verstärkung an.

Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulationssoftware. Die Analyse der Daten, wie sie im Textprotokoll beschrieben ist, ist der Schlüssel, um zu wissen, ob der Assay im Interesse der Reproduzierbarkeit weiter optimiert werden muss. Die cDNA für diesen Assay wird aus Eosinophilen hergestellt, die mit Zytokinen behandelt wurden, um die Transkription zu fördern.

Bereiten Sie serielle Verdünnungen von zwei cDNA-Aliquoten für Proben mit einem Verdünnungsbereich von eins bis eins zu 1.024 vor. Richten Sie den Assay in einer 96-Well-Platte mit 25-Mikroliter-Reaktionen ein, wie für die Analyse der Primerspezifität demonstriert, jedoch mit mehreren Primerkonzentrationen für pan STAT3 und ein Housekeeping-Gen GUSB. In dieser Tabelle wird eine Vorlage angezeigt.

Setzen Sie die versiegelte PCR-Platte in die qPCR-Maschine ein. Richten Sie das Experiment mit der Software ein, fügen Sie einen neuen Detektor für GUSB hinzu und verwenden Sie das entsprechende PCR-Cycling-Programm. Anschließend werden die Ergebnisse verwendet, um den Schwellenwert für jede Probe zu berechnen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um dieses Verfahren zu beginnen, vergleichen Sie die Schwellenwerte des Zyklus, die in der relativen qPCR für das Housekeeping-Gen GUSB erhalten wurden, und verdünnen Sie die cDNA entsprechend mit Reinstwasser, um sicherzustellen, dass alle Konzentrationen innerhalb einer Größenordnung liegen. Richten Sie die absoluten qPCR-Assays der Proben in 96-Well-Platten ein. Befolgen Sie diese Vorlage für S alpha und S beta und diese Vorlage für Delta S alpha und delta S beta.

Führen Sie die Assays wie zuvor gezeigt durch und wiederholen Sie die Assays mindestens einmal. Als Nächstes richten Sie eine absolute qPCR-96-Well-Platte mit 25-Mikroliter-Reaktionen unter Verwendung von pan STAT3-Primern bei 400 Mikromolar und einer Mischung aus allen vier Plasmiden oder einem einzelnen Plasmid gemäß diesem Template ein. Verschließen Sie die qPCR-Platte mit einer Klebeabdeckung und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1.200 g bei 12 Grad Celsius.

Setzen Sie die versiegelte PCR-Platte in die qPCR-Maschine ein und richten Sie das Experiment wie zuvor gezeigt ein, indem Sie einen neuen Detektor für Pan STAT3 hinzufügen. Richten Sie die gleichen Zyklusparameter wie für die relative qPCR ein. Nachdem Sie den Assay mindestens einmal wiederholt haben, analysieren Sie die Ergebnisse, wie im Textprotokoll beschrieben.

qPCR-Daten von guter Qualität erzeugen ein sigmoidales Amplikationsdiagramm, das einen exponentiellen Anstieg der Transkripte im Verlauf des Zyklus anzeigt. Diese Daten wurden aus der qPCR von zwei seriellen Verdünnungen von Plasmiden, die STAT3 S alpha enthalten, gewonnen. Jedes Paar farbiger Linien stellt die Fluoreszenzwerte doppelt verdünnter Proben im Laufe von 40 Zyklen dar.

Standardkurven, die für die Plasmide des Template-Kalibrators erstellt wurden, zeigen die Effizienz der Amplifikation an. In dieser Kurve für STAT3 S alpha betrug die Verstärkungseffizienz 83,9 %Um die Kongruenz der STAT3-Niveaus zu bewerten, wurden die absoluten Werte jeder der vier Spleißvarianten sowie der Pegel des Gesamt-STAT3 gemessen. Im Idealfall sollten sowohl die lineare Regression als auch die Steigung nahe bei eins liegen.

Die absoluten qPCR-Daten werden als Tortendiagramme dargestellt, um ihre Anteile der vier STAT3-Spleißvarianten im Verlauf der Zytokinbehandlung zu zeigen. Die Zusammenführung von absoluten und relativen qPCR-Daten zeigte, dass die Spiegel aller STAT3-Spleißvarianten nach der Stimulation mit den Zytokinen IL3 und TNF alpha anstiegen, wobei die Spiegel nach sechs Stunden ihren Höhepunkt erreichten. Die Bündelung der Daten aus allen Zeitpunkten ergab eine kleine, aber signifikante Verzerrung für die Koassoziation der Beta- und Delta-Spleißereignisse

Einmal optimiert, können Assays, die auf dieser Technik basieren, bei richtiger Durchführung in vier Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Spleißentscheidungen, die ein Codon ein- oder ausschließen, machen 20 % der Spleißvariation im Frame aus.

Unser Protokoll sollte leicht an die Quantifizierung solcher Schwankungen anpassbar sein. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik Mao Zhang, mit meiner Gruppe in der Gruppe von Li-Shan Rue zusammenzuarbeiten, um Knockdown-Reexpressionsexperimente von STAT3-Varianten in ABC-Lymphomzellen zu kontrollieren. Diese Experimente zeigten, dass eine Mischung aus S- und Delta-S-Varianten für das Überleben der Zellen in Kultur erforderlich ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man absolute und relative qPCR durchführt und welche Bedingungen für die Unterscheidung und Quantifizierung subtiler Spleißunterschiede geeignet sind.