Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Ferrichlorid induzierte Thrombosen in einem Mausmodell der Arteria carotis zu erzeugen, um mittels intravitale Mikroskopie analysierte hochreproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Diese Mäuse können helfen, zentrale Fragen zu verschiedenen Erkrankungen oder genetischen Störungen im Zusammenhang mit der Thrombozytenaktivierung und der Aggregation im geschlossenen Gefäßsystem zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach ist und sowohl auf Antikoagulanzien als auch auf Thrombozytenaggregationshemmer empfindlich reagiert, und dass sie mit anderen Techniken kombiniert werden kann.

Diese Methode kann genutzt werden, um wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie der Thrombose zu gewinnen, neue Mechanismen und Therapien zu entdecken sowie die Wirkungen neuartiger Arzneimittel, einschließlich gezielter Nanomedizin, auf die Thrombose zu bewerten. Die Visualisierung dieser Methode ist entscheidend, um die Strategien zum Erhalt einer genauen Blutflussstillstandszeit zu erlernen. Nachdem das Fehlen einer Reaktion auf das Zupinnen der Zehe bestätigt wurde, verwenden Sie kleine elektrische Tierhaarschneider, um das Fell vom Hals und der oberen Brust eines acht bis zwölf Wochen alten Mäuschen zu entfernen.

Tragen Sie einen neutralen Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit Klebeband auf dem Deckel einer 15 cm großen Zellkulturschale. Führen Sie einen 4-0-Nahtfaden um die Schneidezähne und kleben Sie die Enden des Fadens auf dem Deckel fest, um den Hals gerade zu halten. Bringen Sie dann das Tier unter eine chirurgische Lichtquelle und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Alkoholtupfer.

Verwenden Sie anschließend Mikro-Adson-Debaken, um die Haut zu fassen, und chirurgische Scheren, um einen zwei bis drei Millimeter langen Schnitt zu machen. Halten Sie den Schnitt mit den Debaken und führen Sie die Schere mit geschlossenen Klingen ein, wobei Sie die Schere subkutan in Richtung des Manubriums voranschieben. Öffnen Sie dann die Klingen, um die Haut von der subkutanen Schicht zu lösen.

Führen Sie nun einen medianen Schnitt vom Manubrium bis zum Zungenbein durch und verwenden Sie eine feine Hämostaseklemme und Graefe-Stopfer, um die dünne Faszie zwischen den Unterkieferdrüsen stumpf zu dissezieren. Sobald die Luftröhre sichtbar ist, halten Sie mit der Pinzette das Weichgewebe rechts des Manubriums fest und führen Sie die Hämostaseklemme unter der Faszie in Richtung der Zwei-Uhr-Position ein. Öffnen Sie die Backen der Hämostaseklemme, um die Vena jugularis vom umgebenden Gewebe zu lösen.

Fahren Sie dann mit dem Schnitt durch die Faszie, das Bindegewebe und die Haut in Richtung der Zwei-Uhr-Position fort, bis die rechte Vena jugularis freigelegt ist. Befestigen Sie nun eine 30-Gauge-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze, die 100 Mikroliter Rhodamin-6G-Lösung enthält, und biegen Sie mit einer Nadelhalterzange zwei bis drei Millimeter der Nadelspitze um 90 Grad ab. Halten Sie anschließend die Spritze mit einer Hand und das Bindegewebe am distalen Ende der Vena jugularis mit der Graefe-Zange in der anderen Hand und führen Sie die Nadel in das Gefäß ein.

Stabilisieren Sie die Nadel mit der Pinzette und injizieren Sie das Rhodamin. Sobald die gesamte Lösung zur Thrombozytenmarkierung verabreicht wurde, klemmen Sie die Injektionsstelle mit der Pinzette ab, um Blutungen zu verhindern, indem Sie den Hämostaten öffnen und das Instrument unter der Pinzette platzieren, um die Gefäßwand an der Injektionsstelle abzuklemmen. Anschließend ligieren Sie die Injektionsstelle mit einer 6-0-Naht.

Lösen Sie das Weichteilgewebe und die Faszie um die linke Submandibulardrüse stumpf und ziehen Sie die Drüse in Richtung der Sieben-Uhr-Position, um den linken Musculus sternocleidomastoideus freizulegen. Lösen Sie dann die Faszie zwischen dem linken Musculus sternocleidomastoideus und den Muskeln omohyoideus und sternohyoideus stumpf bis zur linken Seite der Trachea. Sobald die Faszie verlagert ist, führen Sie eine Nadel mit einem 15 cm langen, 6-0-seidenen Faden unter der Mitte des Musculus sternocleidomastoideus hindurch und ziehen Sie die beiden Fadenenden seitlich in Richtung der Zehn-Uhr-Position.

Trennen Sie die Muskeln Musculus sternohyoideus und Musculus omohyoideus stumpf, um die Arteria carotis zu exponieren. Verwenden Sie dann die Hämostaseklemme, um das Weichgewebe von der Arteria carotis zu lösen, ohne die Arterie selbst zu berühren. Heben Sie mithilfe einer feinspitzigen Pinzette die laterale Faszie um die Arteria carotis an, wobei Sie den Nervus vagus und die Arterie vermeiden.

Verwenden Sie dann eine weitere feine Pinzette, um die Faszie zwischen der Arteria carotis und dem Nervus vagus zu durchstechen. Führen Sie nun einen stumpfen Haken durch das Loch, um die Arteria carotis vorsichtig anzuheben, und schieben Sie die feine Pinzette unter die Arterie. Bewegen Sie den Haken und die Pinzette entlang der Arterie in entgegengesetzte Richtungen, um etwa fünf Millimeter perivaskuläres Weichgewebe vom Gefäß abzulösen.

Anschließend spülen Sie ein U-förmiges Kunststoffstück mit Kochsalzlösung ab und heben mit dem Haken vorsichtig die Arterie an, um das Kunststoffstück unter der Arterie zu platzieren. Der Kunststoff blockiert die Hintergrundfluoreszenz, verhindert die Diffusion der Eisen(III)-chlorid-Lösung in das umgebende Gewebe und stellt sicher, dass nur die Arteria carotis unter dem Mikroskop sichtbar ist. Befeuchten Sie die Arteria carotis unverzüglich mit zwei bis drei Tropfen Kochsalzlösung.

Überführen Sie dann die Maus auf den Objekttisch eines Fluoreszenzmikroskops unter dem 10X-Wasserobjektiv und füllen Sie den Raum zwischen Objektiv und Arterie mit Kochsalzlösung auf. Starten Sie nun die Softwareanwendung zur digitalen Videodokumentation und nehmen Sie Bilder des normalen Gefäßes auf. Falls die Gefäßwand intakt und unverletzt ist, überführen Sie die Maus auf die Gibraltar-Plattform und verwenden Sie die Ecke eines Papiertuchs, um vorsichtig die Kochsalzlösung im Operationsfeld um die Arteria carotis herum abzutupfen, ohne die Arterie selbst zu berühren.

Verwenden Sie anschließend feine Pinzette, um ein Stück filterpapier, das mit Eisen(III)-chlorid gesättigt ist, direkt auf die A. carotis in der Nähe des distalen Endes der exponierten Arterie zu legen. Achten Sie darauf, das Filterpapier nahe dem distalen Ende der freigelegten A. carotis zu platzieren, sodass ein kurzes Segment an der proximalen Seite übrig bleibt, um den Blutfluss in der späteren Phase der Verletzung beobachten zu können. Nach einer Minute entfernen Sie das Filterpapier und spülen die Arterie mit mindestens zwei Milliliter Kochsalzlösung ab.

Bringen Sie die Maus zurück auf den Mikroskopstapel und nehmen Sie Bilder des Gefäßes auf. Die Bildung des Thrombus kann an der Ansammlung der fluoreszierenden Thrombozyten erkannt werden. Nehmen Sie das Gefäß in den ersten 10 Minuten jede Minute 10 Sekunden lang auf, danach jeweils 10 Sekunden alle zwei Minuten, bis zum Ende des Experiments.

Fünf Minuten nach der Verletzung durch Eisen(III)-chlorid zeigt die Profusion des Gewebe-Plasminogen-Aktivators den Beginn der Thrombolyse etwa vier Minuten nach der Behandlung an. Während des 30-minütigen Beobachtungszeitraums zeigten die gebildeten Thromben wiederholte Größenschwankungen, jedoch keine vollständige Ablation des thrombozytenvermittelten Thrombus. Die Behandlung mit einem polyklonalen PAR4-Antikörper, der die Spaltung von PAR4 verzögert, verlängert signifikant die Zeit bis zur okklusiven Thrombusbildung im Eisen(III)-chlorid-induzierten Modell der Karottenthrombose.

Experimente zur Markierung von roten Blutkörperchen ohne Thrombozyten zeigen, dass, obwohl durch Eisen(III)-chloridinduzierte Thromben ausschließlich aus wandadhärenten Thrombozyten bestehen, rote Blutkörperchen im Thrombus eingefangen werden und im Laufe der Zeit zur Form und Verschlussfähigkeit des Gerinnsels beitragen. Interessanterweise wird das anfängliche Thrombus bereits etwa 15 Sekunden nach der Verletzung der Mesenterialarterie und -vene sichtbar, die Bildung des Thrombus in den Mesenterialgefäßen jedoch deutlich verzögert, und zwar auf etwa 17 Minuten in der Mesenterialvene und nahezu 24 Minuten in der Mesenterialarterie, was zumindest teilweise auf die Diffusion des Eisen(III)-chlorids durch das Fettgewebe zurückzuführen ist, das die Mesenterialgefäße umgibt.

Wenn man einmal Erfahrung mit diesem Modell der durch Eisen(III)-chlorid-induzierten Thromboseerzeugung gesammelt hat, kann es je nach Fähigkeiten in etwa 30 bis 60 Minuten durchgeführt werden, sofern es ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass die gemessene Größe die verstrichene Zeit vom Zeitpunkt der Verletzung bis zur vollständigen Okklusion ist und eine genaue Beobachtung des Blutflusses entscheidend für die Erzielung präziser Ergebnisse ist. Dieses Modell kann mit einer Transfusion von ex vivo behandelten Wildtyp-Plättchen kombiniert werden, um plättchenspezifische Knockouts nachzuahmen und die Funktion regulatorischer Signalwege und von Thrombozyten zu bestimmen.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Gefäßbiologie, nicht nur die Rolle von Thrombozyten bei der Thrombose, sondern auch unter verschiedenen anderen entzündlichen Bedingungen des Endothels zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein durch Eisen(III)-chlorid induziertes Modell der Karotis-Thrombose bei Mäusen einrichtet, um mit dem intravitalem Mikroskop hochreproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Vergessen Sie nicht, dass Eisen(III)-chlorid äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten, wenn dieses Modell durchgeführt wird.