Name: Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Methode zur Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben mittels hypotonischer Lyse. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die zuverlässige Bewertung der Peroxidaseaktivität bei humanen und nicht-humanen Proben.

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Diese Arbeit wurde ermöglicht durch eine Förderung durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, 1315883) sowie durch das Projekt der Sächsischen Aufbaubank (SAB) 100116526 aus einer Förderung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE).

Alle menschlichen Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen erhalten und die angelegte Leukozyten-Anreicherung Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Versuche mit Rattenblut wurden von der zuständigen örtlichen Ethikkommission (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege und Verwendung zugelassen. 1. Experimenteller Aufbau Hinweis: Da die hypotone Lyse Verfahren zur Abreicherung von Erythrozyten aus den Blutproben eine zeitkritische Verfahren, bereiten alle notwendigen Geräte (zB Puffer) für diesen Teil des Protokolls im Voraus. <ol><li> Beschriften Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen für hypotone Lyse und ein 1,5-ml-Probenröhrchen für die nachfolgende aminophenyl Fluorescein (APF) Färbung pro Blutprobe. <ol><li> Wenn die Leukozyten-Anreicherung wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, führen Sie diese Kennzeichnung unter einem FlussBox. </li></ol></li><li> Bereiten etwa 12 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM) pro Probe. Je nachdem, ob die Leukozyten werden unter sterilen Bedingungen oder nicht isoliert werden, bereiten entweder PBS durch sterile gebrauchsfertige Lösung von einem Anbieter oder durch PBS Tabletten in destilliertem Wasser gelöst. Überprüfen Sie den pH-Wert und bei Bedarf einstellen auf pH 7,4 durch geringe Mengen an 0,1 M HCl und NaOH Lösungen. <ol><li> Löse PBS-Tabletten (siehe Tabelle der Materialien) in 200 ml destilliertem Wasser mit einer nicht-sterilen Pufferlösung für etwa 16 Proben ausreichend zu erhalten. Falls gewünscht, sterilisiert diese Lösung durch Sterilfiltration. </li></ol></li><li> Bereiten etwa 1 ml Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ ergänzt pro Probe. <ol><li> Man löst 970 mg HBSS Salz in 100 ml (Endvolumen) doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Befüllen auf das Endvolumen, überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie es auf pH 7,4. Aufgrund seiner geringen Pufferkapazität, bereiten diese Puffer täglich frisch eind Legen Sie den pH-Einstellung mit besonderer Sorgfalt durch den Einsatz geringer Mengen von 0,1 M HCl und NaOH-Lösungen durchführen. HINWEIS: Die sterile Lösung kann verwendet werden, je nach dem Experiment. Die Lösung kann durch Sterilfiltration sterilisiert werden. </li></ol></li><li> Neben den beiden Puffer, Etikett und bereiten ein Rohr (zB 50 ml Zentrifugenröhrchen) oder Kolben (zB 250 ml Messbecher) mit doppelt destilliertem Wasser für die hypotone Lyse Verfahren im Voraus. Bereiten Sie ca. 10 ml Wasser pro Probe. </li><li> Bereiten Sie einen Behälter mit zerstoßenem Eis für die APF-Färbung (Abschnitt 3), die auf Eis durchgeführt wird. </li><li> Bereiten Sie Teilmengen von APF, im Voraus die schnelle Zubereitung von Arbeitslösungen während der Färbung (Schritt 3.2) und zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen der APF-Lösung verwendet werden kann. HINWEIS: APF wird üblicherweise als 5 mg / ml (11,81 mM) Stammlösung in Methylacetat erhalten. <ol><li> Gefrierteilmengen von 10 bis 100 &amp; mgr; l in 0,5-ml-Röhrchen. Zur Färbung der APF eine endgültigeFarbstoffkonzentration von 10 uM verwendet wird (Schritt 3.8). </li></ol></li></ol> 2. hypotonische Lyse der Erythrocyten HINWEIS: Führen Sie die hypotone Lyse Schritte (mit Ausnahme der Zentrifugationsschritte) unter einer Laminar-Flow-Bank Kontamination zu vermeiden. Führen Sie das gesamte Verfahren bei Raumtemperatur. Da die hypotone Lyse ein zeitkritischen Prozess ist, stellen Sie die Pipetten für Wasser (2 ml) und PBS (5 ml) zusätzlich im Voraus und öffnen Sie das Wasser und PBS-Kolben vor Beginn des Verfahrens. Bewahren Sie die PBS-Lösung und das destillierte Wasser bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. <ol><li> Von jeder Blutprobe Transfer 100 ul in die entsprechende 15 ml Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: In unseren Experimenten Blutproben enthalten in der Regel 10 U / ml Heparin, um Koagulation zu vermeiden. Doch aufgrund der unterschiedlichen Quellen des Probenmaterials der Art und Konzentration des Antikoagulans kann unterschiedlich sein. Deren Einfluss auf die APF-Färbung sollte getestet werden comparing die Ergebnisse zu den Ergebnissen aus Blutproben mit anderen Arten oder Konzentrationen von Antikoagulans ergänzt erhalten. </li><li> 2 ml destilliertem Wasser und die Proben mischen mit einem Vortexer auf einen mittleren Wert eingestellt. Inkubieren Sie die Proben für 60 Sekunden, dann fügen Sie 5 ml PBS pro Probe und mischen Sie den Vortexer. HINWEIS: bis zu etwa 5 Proben können parallel hergestellt werden. Halten Sie die Probe, um das gleiche für die Zugabe von Wasser und PBS vergleichbar Inkubationszeiten zu erreichen. </li><li> Nach der Regeneration von isotonischen Bedingungen durch Zugabe PBS (Schritt 2.2) die verbleibenden intakten Zellen in allen Proben durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g pelletieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, indem sie in einer Tabelle Abfallbehälter zu gießen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich durch die Zentrifugationsröhrchens Umkehren und die Öffnung auf einem Papiertuch klopfen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet so trocken wie möglich ist. </li><li> Wiederholen Sie die hypotonischen Lyseverfahren, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.2). NOTE: Im Prinzip dieser hypotonischen Lyseverfahren (Schritte 2,3 bis 2,5) mehr als einmal wiederholt werden kann, von der Reinheit des gemischten Leukozytenfraktion in Abhängigkeit zu erhalten. Nach zwei Lyse der Anteil der verbleibenden Erythrozyten in der erhaltenen gemischten Zellfraktion Schritte ist etwa 25%. </li><li> Pellet die verbleibenden intakten Zellen durch Zentrifugation für 6 Minuten bei Raumtemperatur und 450 x g. Entfernen Sie den Überstand (siehe Schritt 2.4). In 500 ul HBSS zu dem Pellet und vorsichtig lösen, bis eine homogene Lösung erhalten wird. Bringen Sie jede Probe auf den entsprechend markierten 1,5 ml Probenröhrchen. </li><li> Je nach Experiment analysieren direkt erhaltenen Proben (beispielsweise über Durchflusszytometrie) 25, Fleck mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (zur Identifizierung von einzelnen Zelltypen) 32, inkubieren mit Zellreize (für die Zellaktivierungsversuche) 33 oder auf Eis gelagert und Verwendung später. Je nach dem Ziel der Studie, führen unmittelbar nachfolgenden Experimente andie gemischte Leukozytenfraktion da Granulozyten haben eine relativ kurze Halbwertszeit von etwa 20 h. ANMERKUNG: Dies gilt auch für die Peroxidase-Aktivität-Färbung unten beschrieben. </li></ol> 3. Halogenierungs Peroxidaseaktivität Anfärben HINWEIS: HOCl- und HOBr-Produktion durch die Blut abgeleiteten Häm Peroxidasen MPO und EPO wird durch Verwendung APF quantifiziert, die von den genannten unterhalogenige Säuren Fluorescein oxidiert wird. Deshalb, wenn Zellmarkierung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern in Kombination mit APF-Färbung durchgeführt wird, zu vermeiden Fluorophore, die mit dem Emissionssignal von Fluorescein stören. <ol><li> Führen Sie APF-Färbung bei 4 ° C auf Eis. </li><li> Für eine Arbeitslösung von APF Herstellung auftauen eines geeigneten Aliquots des Farbstoffs (beispielsweise 10 &amp; mgr; l, 11,81 mM) und verdünnt sie mit HBSS auf genau 1 mM (zB 108,1 &amp; mgr; l Puffer in die 10 &amp; mgr; l hinzufügen). <ol><li> Für jede Probe (500 &amp; mgr; l Zelllösung) vorbereiten 5 μl der beschriebenen APF-Arbeitslösung. Dementsprechend verwenden ein 10-ul-Aliquot von APF (11,81 mM), die 118,1 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) ergibt etwa 20 Proben vorzubereiten. Durch Verlust beim Pipettieren etwa 10% mehr APF Arbeitslösung als berechnet vorzubereiten. </li></ol></li><li> Um die Peroxidase Spezifität der APF - Färbung zu prüfen, Kontrollproben mit dem Häm Peroxidasehemmstoff 4-Aminobenzoesäurehydrazid (4-ABAH) 35 vorzubereiten. <ol><li> Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung von 4-ABAH (151,17 g / mol) in Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Verdünnen von 75,6 mg 4-ABAH in 500 &amp; mgr; l Lösungsmittel. Weitere 4-ABAH 1/10 in HBSS verdünnen. </li></ol></li><li> Zur Herstellung einer Lösung , H 2 O 2 Arbeits Etikett zwei 1,5 ml Zentrifugationsröhrchen mit &quot;70 mM H 2 O 2&quot; und &quot;7 mM H 2 O 2&quot; bezeichnet. <ol><li> In dem Rohr mit &quot;70 mM H 2 O 2&quot;, verdünne 10 ul frischeiner 30% Stammlösung (8,8 mM) H 2 O 2 unter Verwendung von 990 &amp; mgr; l destilliertem Wasser mit einer Konzentration von etwa 88 mM zu erhalten. Lagern auf Eis und innerhalb von 4 Stunden. HINWEIS: H 2 O 2 wird in der Regel als 30% ige Stammlösung von den Lieferanten geliefert. Wenn sie bei 4 ° C gelagert, ist es seit etwa 3 Jahren stabil. Führen Verdünnungen von H 2 O 2 in destilliertem Wasser Zersetzung zu vermeiden. H 2 O 2 Verdünnungen könnte auch in 0,1 M NaOH - Lösung hergestellt werden. </li><li> Zur Bestimmung der genauen H 2 O 2 -Konzentration eine weitere 1 bis 10 Verdünnung von dem ersten H 2 O 2 - Stammlösung (etwa 88 mM) durch Zusatz von 100 &amp; mgr; l dieser Lösung zu 900 ul destilliertes Wasser in 1,5 - ml - Röhrchen vorbereitet markiertem &quot;7 mM H 2 O 2&quot;. </li><li> Nehmen Sie ein Spektrum im nahen UV - Bereich (zB 200-300 nm) durch eine UV-Vis - Photospektrometer und verwenden die Absorption bei 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) anhand der H 2 O 2 -Konzentration in der zweiten H 2 O 2 Stammlösung 34 zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Referenz Küvette nur destilliertes Wasser enthält. Für die Messung Verwendung Quartzküvetten als ein Spektrum im UV-Bereich aufgezeichnet. </li><li> Aus diesem Ergebnis errechnen die genauen Konzentrationen beider H 2 O 2 Stammlösungen. Passen Sie die Konzentration der ersten Stammlösung in dem &quot;70 mM H 2 O 2&quot; Probenröhrchen genau 70 mM durch eine entsprechende Menge an destilliertem Wasser zugegeben wird . Speichern Sie die erhaltene Arbeitslösung auf Eis und innerhalb von einer Stunde. </li></ol></li><li> Werden 5 &amp; mgr; l der 4-ABAH-Arbeitslösung (100 mM) auf die entsprechenden Proben auf eine Endkonzentration von 1 mM. Inkubiere die Proben für 15 min bei 37 ° C im Inkubator vor APF hinaus. </li><li> Werden 5 ul APF-Arbeitslösung (1 mM) zu jedem500 &amp; mgr; l Probe, die eine endgültige Farbstoffkonzentration von 10 uM zu erhalten. Mischen Sie die Proben vorsichtig (zB durch Verwendung des Wirbelmischer auf mittlerer Stufe) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l H 2 O 2 Arbeitslösung (70 mM) zu jeder 500 ul Probe für eine Endkonzentration von 700 uM. Vorsichtig mischen die Proben und Inkubation sie für 60 min bei 37 ° C. Führen Sie geeignete Kontrollmessungen parallel. HINWEIS: Kontrollmessungen zeigten , dass 700 &amp; mgr; M H 2 O 2 für die Zellen nicht toxisch sind. Es wurden auch keine signifikanten zellulären Reaktionen beobachtet. HINWEIS: Die APF - Färbung auch durch Weglassen der Zugabe von H 2 O 2 in Abhängigkeit von der wissenschaftlichen Fragestellung durchgeführt werden kann. In Abwesenheit von Wasserstoffperoxid nur der basalen Chlorierungsmittel MPO und EPO - Aktivität bestimmt wird , während die Zugabe von H 2 O 2 die Erfassung des maximalen HOCl und HOBr - Produktion durch die Zellen ermöglicht. Ter Letzteres bedeutet eine deutlich höhere Fluoreszenzsignal. </li><li> Für die Zellen pelletiert, Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 400 x g. Gründlich entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu zerstören und 250 ul HBSS fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren. HINWEIS: Die Proben sind nun bereit für die Analyse über Durchflusszytometrie 25. </li><li> Lagern Sie die Proben im Dunkeln bis zur Analyse Bleichen zu vermeiden. Nach Anregung bei 480-490 nm bei etwa 525 nm 37 die Emission von Fluorescein erkennen. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Als Neutrophile die häufigsten Leukozyten im menschlichen Blut die Isolierung von Peroxidase-positive Zellen sind oft konzentriert sich nur auf diesen Zellen und enthält eine Trennung von Neutrophilen von anderen Leukozyten durch Dichtegradientenzentrifugation 38. Doch wie Neutrophile viel weniger reichlich in murine Blutproben sind 39 für die letztere komplizierteren Methoden müssen 40 verwendet werden. Darüber hinaus auch beide Methoden zur Entfernung von Peroxidase-positive führen Mon...

Polymorphkernigen Leukozyten (PMNs, die auch als Granulozyten) und Monozyten sind wichtige zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems im Blut 1,2. Sie tragen zur primäre Abwehr von Krankheitserregern sowie zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems und die Einleitung einer systemischen Entzündungsreaktion 2-4. Doch vor allem Neutrophile, die am häufigsten vorkommende Art von Granulozyten und Monozyten tragen auch wesentlich zur Regulierung und die Beendigung der akuten entzündlichen Ereignisse 5. Daher können diese Zellen auch eine wichtige Rolle bei chronisch - entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis 6,7 spielen. In der Tat, Asthma, eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege, wird durch eine beeinträchtigte Apoptose von Eosinophilen gekennzeichnet, die zweithäufigste Granulozyten Typ im Blut 8. Doch die Apoptose von Granulozyten und deren schnelle Beseitigung durch Makrophagen sind zwei wesentliche Schritte, die während der zellulären BeendigungEntzündungs ​​11.09. In den genannten Immunzellen zwei eng verwandte Enzyme, nämlich Myeloperoxidase (MPO, Neutrophilen und Monozyten) und eosinophile Peroxidase (EPO, Eosinophilen) können 12,13 gefunden werden. Diese Häm Peroxidasen klassisch sind mit der humoralen Immunantwort , wie sie im Zusammenhang mit zwei elektronisch zu oxidieren (pseudo-) -halogenide zu dem entsprechenden hypo (pseudo) halogenhaltige Säuren , die für ihre bakterizide Eigenschaften 14-16 bekannt sind. Unter physiologischen Bedingungen MPO hauptsächlich Formen Hypochlorsäure (HOCl) und hypothiocyanite (- OSCN) , während die letztere und Hypobromsäure (HOBr) durch EPO 17-19 gebildet werden. Neue Ergebnisse deuten darauf hin , dass diese (pseudo-) Halogenierung Enzymaktivität auch für die Regulierung der Entzündungsreaktionen und zur Beendigung von Immunreaktionen 20,21 beitragen. In der Tat wurden die HOCl Produktion von MPO und daraus abgeleitete Produkte gezeigt T - Zell-basierte adaptive Immunantwort 22-2 zu unterdrücken4. Um weitere Einblicke in die immunologischen Rolle der Leukozyten aus dem angeborenen Immunsystems bei chronischen Entzündungskrankheiten zu gewinnen und den Beitrag von MPO und EPO dieser physiologischen Funktion zu bestimmen, haben wir ein Verfahren, um schnell Leukozyten aus kleinen Blutproben für einen nachfolgenden spezifischen reichern Bestimmung der Halogenierung Peroxidase-Aktivität in diesen Zellen. Für Erythrozyten-Depletion haben wir ein standardisiertes Verfahren mit zwei nachfolgenden hypotone Lyse Schritte mit destilliertem Wasser ausgewählt, die bei niedrigen Materialkosten zu einer schnellen Leukozyten-Anreicherung führt. Für die anschließende Bestimmung der Halogenierung MPO und Aktivität EPO die HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl Fluorescein (APF) wurde 25-27 verwendet. Im Gegensatz zu der Anwendung von unspezifischen Peroxidase Färbemethoden 28,29, ermöglicht dieser Ansatz die selektive Erfassung der Halogenierung Peroxidase - Aktivität, die häufig bei schweren infl beeinträchtigt wirdammation 30,31.

<table><tbody><tr><td>Materialien/Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugationsröhrchen</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451-1,5</td><td></td></tr> <tr><td>ml Probenröhrchen</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE-Pipetten</td><td></td></tr> <tr><td>für Volumina bis 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>z.B. , 3120000070</td><td>Wir verwenden Eppendorf Resarch plus Pipetten mit einstellbaren Volumina im Bereich 1-10 & micro; L, 10-100 &Mikro; L, 100-1.000 &Mikro; l an 500-5.000 &Mikro; l</td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Bank</td><td>Thermo Electron Corperation</td><td>HeraSafe-Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Mischer</td><td>Bender & Hobein AG</td><td>Vortex Genie</td><td></td></tr> 2-Tischzentrifuge <tr><td></td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>Laborfuge 400R</td><td>Die Zentrifuge sollte bei 450 x g verwendet werden</td></tr><tr><td>können Kleine Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Die Zentrifuge sollte bei 400 x g</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus</td><td>Cytoperm 2</td><td>verwendet werden können Einstellungen: 37 &deg; C, 95% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 Gehalt</td></tr><tr><td>UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>Ein Spektrum zwischen 200 und 300 nm muss aufgezeichnet werden. So müssen Quarzküvetten verwendet werden</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>Es kann jedes Durchflusszytometer verwendet werden, das mit einem Laser ausgestattet ist, der für die Anregung von Fluorescein geeignet ist (z.B. , 488 nm Argon-Laser)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Amresco</td><td>K812</td><td>sterile Lösung, gebrauchsfertig</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tabletten zum Lösen in 200 ml Milliporenwasser</td></tr><tr><td>Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) mit Ca2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td>970 mg/100 ml, den pH-Wert sorgfältig prüfen und auf 7,4</td></tr><tr><td>einstellen</td><td>Salzsäure Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M Lösung</td></tr><tr><td>Natronlauge</td><td>Riedel-deHa&euml; n</td><td>30620</td><td>Feste Pellets. Für eine 1 M Lösung lösen Sie 4 g/100 ml Millipore Wasser</td></tr><tr><td>Aminophenylfluorescein</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>5 mg/ml Lösung (11,81 mM) in Methylacetat, Aliquoten (z. B. 100 &; Mikro; l) sollte bei -20 Grad zubereitet und gelagert werden; C</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Diese 30%ige Stammlösung entspricht einer Konzentration von etwa 8,8 M. Weitere Verdünnungen müssen unmittelbar vor der Verwendung in destilliertem Wasser frisch hergestellt und durch Absorptionsmessungen quantifiziert werden</td></tr>: <tr><td>4-Aminobenzoesäurehydrazid (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td><td>Eine erste Stammlösung von 1 M sollte in DMSO, eine zweite von 100 mM durch 1:10 Verdünnung in HBSS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR Chemikalien</td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

schnelle und spezifische bewertung der halogenierungsagentien peroxidaseaktivität in leukozyten angereicherte blutproben

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die schnelle und standardisierte Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Vollblut-Proben beschrieben. Dieses Verfahren wird auf der hypotonischen Lyse der Erythrozyten basieren und kann als an Blut von nicht-menschlichen Ursprungs sowie für die menschliche Proben angewendet werden. Die geringe anfängliche Probenvolumen von etwa 50 bis 100 &amp; mgr; l macht dieses Verfahren für wiederkehrende Blutentnahme von kleinen Labortieren. Darüber hinaus wird Leukozyten Anreicherung innerhalb von Minuten und mit geringem Material Anstrengungen in Bezug auf Chemikalien und Instrumentierung erreicht, ist dieses Verfahren anwendbar in mehreren Laborumgebungen. Standardisierte Reinigung von Leukozyten wird mit einem hochselektiven Färbeverfahren kombiniert Halogenierung Peroxidaseaktivität von Häm - Peroxidasen, Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO), dh die Bildung von unterchloriger und hypobromige Säure (HOCl und HOBr) auszuwerten. Während MPO stark in neut ausgedrücktrophils, die häufigste Immunzelltyp im menschlichen Blut sowie in Monozyten, die verwandten Enzym EPO wird ausschließlich in Eosinophilen exprimiert wird. Die Halogenierung Aktivität dieser Enzyme wird unter Verwendung der fast HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl fluorescein (APF) und den primären Peroxidasesubstrat Wasserstoffperoxid behandelt. Bei der anschließenden Durchflusscytometrieanalyse alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophilen) unterscheidbar und ihre Halogenierung Peroxidase-Aktivität quantifiziert werden können. Da APF Färbung kann mit der Anwendung von Zelloberflächenmarkern kombiniert werden, kann dieses Protokoll speziell verlängert werden, um Leukozyten-Unterfraktionen adressieren. Das Verfahren ist für HOCl und HOBr Produktion sowohl in der Human- und in Nagetier Leukozyten zu erkennen. Angesichts der breiten und mannigfaltig diskutiert immunologische Rolle dieser enzymatischen Produkte in chronisch-entzündlichen Erkrankungen kann dieses Protokoll zu einem besseren Verständnis des beitragenimmunologischer Relevanz von Leucocyten abgeleitetes Häm Peroxidasen.

Wie zuvor berichtet , oben gedreht beschriebene Verfahren geführt anwendbar sowohl für die menschliche zu sein und nicht menschlichen Material 32. Außerdem, wie für die Mäuse, die mit asthmatischen Symptomen der Färbung APF gezeigt ist, kann ein geeignetes Werkzeug sein, um Unterschiede in der systemische proinflammatorische Zustand erkennen. Deshalb wird in einer anschließenden Studie , die wir dieses Protokoll zur Bewertung wiederholt die Halogenierung Aktivität von MPO (und...

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben für eine anschließende spezifische Bestimmung der halogenierenden Peroxidaseaktivität in den Zellen. Die Methode kann auf menschliches und nicht-menschliches Material angewendet werden und kann zur Bewertung neuer Entzündungsmarker beitragen.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Das allgemeine Ziel dieser Methode zur Erythrozytendepletion besteht darin, eine schnelle und einfache Leukozytenanreicherung aus einer kleinen Blutprobe zu erreichen. Zu den vielen Vorteilen dieser Technik gehören ihre Kostengünstigkeit, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit. Darüber hinaus kann sie sowohl bei menschlichen als auch bei nicht-menschlichen Blutproben angewendet werden.Bevor Sie mit dem Lyseverfahren beginnen, stellen Sie die Pipette für die Wassergabe auf zwei Milliliter und die Pipette für PBS auf fünf Milliliter ein. Stellen Sie anschließend offene Kolben mit Wasser und PBS unter einer laminarer Luftstromhaube bei Raumtemperatur bereit. Da die hypotonische Lyse ein zeitempfindlicher Prozess ist, sollte alles zuvor vorbereitet werden.Außerdem sollte die Lyse immer auf die gleiche Weise durchgeführt werden, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Danach 100 Mikroliter von jeder Blutprobe in ein 15-Milliliter-Kegelrohr überführen. Anschließend zwei Milliliter destilliertes Wasser zu jeder Probe geben und bei mittlerer Stufe vortexen.Die Zellen 60 Sekunden ruhen lassen, dann fünf Milliliter PBS hinzufügen und die Proben durch Vortexen mischen. Anschließend die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Überstände abgießen.Drehen Sie die Röhrchen um und klopfen Sie die Öffnungen auf ein Papiertuch, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Wiederholen Sie dann den hypotonischen Lysevorgang, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie ein zweites Mal ein trockenes Pellet erhalten haben, resuspendieren Sie jede Probe in 500 µL HBSS, bis eine homogene Lösung vorliegt.Und überführen Sie die Zellen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Um die Peroxidase-Spezifität der Proben nach der Färbung mit Amino-Phenol-Fluorescein (APF) zu überprüfen, geben Sie zunächst fünf Mikroliter des Häm-Peroxidase-Inhibitors 4-ABAH zu den entsprechenden Proben hinzu und inkubieren diese 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend fügen Sie fünf Mikroliter der APF-Arbeitslösung zu jedem Röhrchen hinzu und wirbeln die Zellen vorsichtig auf mittlerer Stufe mit einem Vortex-Mischer um. Alle Proben 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann fünf Mikroliter der gebrauchsfertigen Wasserstoffperoxidlösung zu jeder Probe hinzufügen und die Röhrchen vorsichtig verwirbeln. Nach 60 Minuten bei 37 Grad Celsius die Zellen zentrifugieren und das Überstandsvolumen vorsichtig entfernen, ohne die Pellets zu stören.Schließlich die Zellen in 250 Mikrolitern HBSS resuspendieren und die Proben zur Vermeidung einer Photobleiche im Dunkeln lagern, bis sie analysiert werden. Hier wird ein repräsentatives Beispiel der Leukozytenpopulationen nach hypotonischer Lyse und Färbung mit APF wie gerade gezeigt dargestellt. Durch Auftragung der Zellgröße gegen die Granularität ist die effektive Depletion der Erythrozyten erkennbar, wobei die Population aus roten Blutkörperchen und Zelltrümmern nur 22 % der Ereignisse ausmacht.Außerdem ermöglicht die Intensitätsverteilung der von APF stammenden Fluoreszenz eine klare Unterscheidung zwischen peroxidase-negativen Erythrozyten und Lymphozyten mit moderater APF-Oxidation einerseits und peroxidase-positiven Monozyten und Eosinophilen sowie Neutrophilen mit ausgeprägter Peroxidase-Oxidation andererseits. Wenn man die Technik einmal beherrscht, können bis zu 50 Blutproben parallel bearbeitet werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Antikörperfärbungen durchgeführt werden, um die gewünschten Zellsubpopulationen zu identifizieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Kleintierstudien den Weg, um die Rolle der halogenierenden Aktivität von MPO und EPO in Tiermodellen für chronisch entzündliche Erkrankungen zu untersuchen.

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Die Bildung von Superoxid-Anionen ist essentiell für die Stimulation von Blutplättchen und, wenn sie dysreguliert ist, entscheidend für thrombotische Erkrankungen. In diesem Artikel stellen wir drei Protokolle für den selektiven Nachweis von Superoxid-Anionen und die Untersuchung der redoxabhängigen Thrombozytenregulation vor.

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen 

Lernen Sie eine schnelle Methode zur Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben mittels hypotonischer Lyse. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die zuverlässige Bewertung der Peroxidaseaktivität bei humanen und nicht-humanen Proben.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

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