Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben
28. Juli 2016
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben für eine anschließende spezifische Bestimmung der halogenierenden Peroxidaseaktivität in den Zellen. Die Methode kann auf menschliches und nicht-menschliches Material angewendet werden und kann zur Bewertung neuer Entzündungsmarker beitragen.
Das übergeordnete Ziel dieser Erythrozyten-Depletionsmethode ist es, eine schnelle und einfache Leukoctye-Anreicherung aus einer kleinen Blutprobe zu erreichen. Viele Vorteile dieser Technik sind, dass sie billig, zuverlässig und schnell ist. Darüber hinaus kann es auf menschliche und nicht-menschliche Blutproben angewendet werden.
Stellen Sie vor Beginn des Lysevorgangs die Pipette für die Wasserverabreichung auf zwei Milliliter und die Pipette für PBS auf fünf Milliliter ein. Stellen Sie dann offene Kolben mit Wasser und PBS unter eine Laminar-Flow-Haube bei Raumtemperatur. Da es sich bei der hypotonen Lyse um einen zeitkritischen Prozess handelt, sollte vorher alles vorbereitet werden.
Darüber hinaus sollte der Lysevorgang immer auf die gleiche Weise durchgeführt werden, um kompatible Ergebnisse zu erzielen. Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter von jeder Blutprobe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Und fügen Sie jeder Probe zwei Milliliter destilliertes Wasser hinzu, wobei Sie bei mittlerer Einstellung vortexen.
Ruhen Sie die Zellen 60 Sekunden lang aus und fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu. Und mischen Sie die Proben durch Vortexen. Sammeln Sie nun die Zellen durch Zentrifugation und dekantieren Sie die Überstände.
Drehen Sie die Schläuche um und klopfen Sie auf die Öffnungen eines Papiertuchs, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Wiederholen Sie dann den hypotonen Lysevorgang, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie zum zweiten Mal ein trockenes Pellet erhalten haben, suspendieren Sie jede Probe in 500 Mikrolitern HBSS, bis eine homogene Lösung erhalten wird.
Und überführen Sie die Zellen in 1,5 Milliliter fassende Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Um die Peroxidase-Spezifität der Proben nach der Aminophenol-Fluorescein- oder APF-Färbung zu überprüfen, geben Sie zunächst fünf Mikroliter des Häm-Peroxidase-Inhibitors 4-ABAH zu den entsprechenden Proben für eine 15-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Geben Sie als Nächstes fünf Mikroliter APF-Arbeitslösung in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Zellen vorsichtig auf der mittleren Stufe.
Inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann fünf Mikroliter Wasserstoffperoxid-Arbeitslösung zu jeder Probe und wirbeln Sie die Röhrchen vorsichtig ein. Nach 60 Minuten bei 37 Grad Celsius zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen vorsichtig den Überstand, ohne die Pellets zu stören.
Zum Schluss suspendieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern HBSS und lagern Sie die Proben bis zu ihrer Analyse im Dunkeln, um Photobleiche zu vermeiden. Hier wird ein repräsentatives Beispiel der soeben gezeigten Leukozytenpopulationen nach hypotoner Lyse und APF-Färbung gezeigt. Durch die Darstellung der Zellgröße im Vergleich zur Granularität kann die robuste Depletion der Erythrozyten beobachtet werden, wobei die Population der roten Blutkörperchen und Trümmer nur 22% der Ereignisse ausmacht.
Des Weiteren ermöglicht die Intensitätsverteilung der APF-abgeleiteten Fluoreszenz eine deutliche Unterscheidung der Peroxidase-negativen Erythrozyten und Lymphozyten, wobei für die Peroxidase-positiven Monozyten und Eosinophilen eine moderate APF-Oxidation und bei den Neutrophilen eine robuste Peroxidaseoxidation beobachtet wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik auf bis zu 50 Blutproben parallel angewendet werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Antikörperfärbung durchgeführt werden, um die interessierenden Zelluntergruppen zu identifizieren.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kleintierstudien, um die Rolle der halogenierenden Aktivität von MPO und EPO in Tiermodellen für chronisch entzündliche Erkrankungen zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben, die sowohl auf menschliches als auch auf nicht-menschliches Material anwendbar ist. Die Technik ist kostengünstig und zuverlässig und erleichtert die Bewertung neuer Entzündungsmarker.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Anreicherung von Leukozyten ist entscheidend für die Untersuchung von Immunantworten.
- Herkömmliche Methoden können zeitaufwendig und komplex sein.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen.
- Es kann sowohl für menschliche als auch für nicht-menschliche Blutproben verwendet werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines schnellen Protokolls zur Anreicherung von Leukozyten.
- Beurteilung der halogenierenden Peroxidaseaktivität in Leukozyten.
- Beitrag zur Identifizierung von Entzündungsmarkern.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der Pipetten zur Verabreichung von Wasser und PBS.
- Verwendung einer laminarer Luftstrom-Werkbank für die Probenaufbereitung.
- Hypotonische Lyse zur Erythrozytendepletion.
- Zeitkritische Durchführung des Lyseschritts.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben.
- Zuverlässige Beurteilung der Peroxidase-Aktivität.
- Durchführbarkeit sowohl mit menschlichen als auch nicht-menschlichen Proben.
- Potenzial zur Bewertung neuer entzündlicher Marker.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist effizient und kostengünstig.
- Sie verbessert die Untersuchung von Immunantworten.
- Weitere Forschungsarbeiten können auf diesem Protokoll aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, standardisierte Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Blutproben und unterstützt damit frühe Entdeckungsarbeiten in der Forschung zu entzündlichen Erkrankungen. Durch die Quantifizierung der halogenierenden Peroxidaseaktivität von MPO und EPO liefert es einen mechanistischen Endpunkt für die Zielvalidierung und die Absicherung von Signalwegen. Die Verträglichkeit der Methode mit der Durchflusszytometrie und Antikörperfärbung erleichtert ihre Integration in Screening- und translationsmedizinische Arbeitsabläufe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der leukozytenspezifischen Peroxidaseaktivität, um MPO und EPO als therapeutische Zielstrukturen bei chronischer Entzündung zu validieren.
- Operativer Wert: Verwendet ein geringes Probenvolumen (50–100 µL), wodurch wiederholte Probenahmen an kleinen Tiermodellen für longitudinale Target-Engagement-Studien möglich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Kombiniert die APF-Färbung mit der Durchflusszytometrie, um quantitative, fluoreszenzbasierte Messungen der HOCl/HOBr-Produktion für die Assay-Standardisierung zu erhalten.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Hochdurchsatzverarbeitung von bis zu 50 Proben parallel und unterstützt skalierbare Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Peroxidase-Aktivität von Leukozyten mit krankheitsrelevanten entzündlichen Prozessen und unterstützt so die Biomarker-Abstimmung in präklinischen Modellen.
- Operativer Wert: Funktioniert sowohl mit menschlichem als auch mit Nagetierblut und ermöglicht so eine translationsmedizinische Kontinuität über Spezies hinweg bei der Zielvalidierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Hypothese bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere in Programmen zur Immunologie und zu entzündlichen Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung der enzymespezifischen Peroxidaseaktivität in gereinigten Leukozytenpopulationen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse mittels APF-Fluoreszenz und Durchflusszytometrie und ermöglicht so die Bewertung des Einflusses von Substanzen auf die Peroxidaseaktivität.
- Analytik: Erzeugt messbare Fluoreszenzintensitätsdaten, die den Vergleich von peroxidasepositiven Zellsubpopulationen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophile) unter experimentellen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet die Peroxidaseaktivität mit den Mechanismen entzündlicher Erkrankungen und unterstützt so die präklinische Kontinuität, wenn sie mit der Färbung von Zelloberflächenmarkern kombiniert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Standardisierte Leukozytenanreicherung und die auf APF basierende Detektion bilden eine wiederverwendbare Plattform für mehrere inflammatorische Zielprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem die Peroxidase-Aktivität auf spezifische Leukozyten-Linien beschränkt wird.
- Operativer Wert: Bietet ein kostengünstiges, schnelles Protokoll, das nur minimale Instrumentierung erfordert (Zentrifuge, Vortexer, Durchflusszytometer).
- Strategischer Wert: Verkürzt die biologischen Entwicklungsrisiken, indem eine schnelle, iterative Beurteilung der Zielmodulation in Leukozytenproben ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von MPO/EPO-Hemmstoffen, indem frühe funktionelle Aktivitätsdaten aus physiologisch relevanten Zellen bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Leukozyten, der Durchflusszytometrie und der Chemie fluoreszierender Sonden.
- Setzt den Zugang zu Zentrifugen, Vortexgeräten, laminarer Luftströmung und Durchflusszytometern mit geeigneten Fluoreszenzkanälen voraus.
- Benötigt eine Standardisierung der Arbeitslösungen von APF und Wasserstoffperoxid über verschiedene Labore hinweg, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Die Anpassung an nicht-menschliche Arten erfordert die Validierung der Peroxidase-Expression und der Färbeeffizienz von APF in den Ziel-Leukozyten-Subpopulationen.
- Auf die Detektion halogenierender Peroxidase-Aktivität beschränkt; misst keine anderen Leukozytenfunktionen, es sei denn, sie wird mit zusätzlichen Assays kombiniert.
