Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die schnelle Synthese und Reinigung von Trehalose-Analoga, deren Anwendungsmöglichkeiten vom Nachweis pathogener Bakterien bis zur Konservierung von Biomaterialien reichen. Dies ist eine schnelle und ertragreiche Methode, die den Zugang zu Analoga des Disaccharids Trehase ermöglicht. Diese Verbindungen haben verschiedene etablierte und aufstrebende Anwendungen in der biomedizinischen und biotechnologischen Forschung.

Diese Methode besteht aus einer einstufigen enzymatischen Synthese und einer rein wässrigen Reinigung. Zusammen tragen diese Verfahren dazu bei, einige der Nachteile traditioneller chemischer Synthesen von Trehalose-Analoga zu beheben, die langwierig, ertragsarm und umweltschädlich sein können. Die Implikationen dieser Methode können sich auf die Untersuchung und Diagnose von Tuberkulose erstrecken, da modifizierte Trehalose-Analoga zur Bildgebung des Mikrobakteriums tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verwendet wurden.

Diese Methode kann auch dazu beitragen, die Synthese und Bewertung von Trehalose-Analoga für andere mögliche Anwendungen wie die Konservierung biologischer Produkte und die Verwendung als kalorienfreie Süßstoffe zu beschleunigen. Bereiten Sie vor Beginn des Eingriffs eine Übernachtkultur mit TreT-exprimierenden E.coli vor. Um mit der TreT-Expression zu beginnen, geben Sie 750 Milliliter TB-Wachstumsmedium in einen 2.800-Milliliter-Fernbach-Kulturkolben und autoklavieren Sie ihn.

Geben Sie Ampicillin in die Brühe, um eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Küvetten für die UV-Vis-Spektroskopie besorgen und eine Küvette als Rohling mit Brühe aus dem Kolben füllen. Anschließend werden drei Milliliter der vorbereiteten TreT-exprimierenden E.coli-Nachtkultur in den Kolben gegeben.

Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie ihn bei 200 U/min. Überprüfen Sie regelmäßig die Absorption der Bouillon bei 600 Nanometern gegen den Bouillonrohling. Wenn der Absorptionswert bei 600 Nanometern zwischen 0,5 und 1,0 liegt, werden 750 Mikroliter Arabinose in den Kolben gegeben, um die TreT-Expression zu induzieren.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Als nächstes geben Sie die Kultur in eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche aus Polypropylen und zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 Mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 15 Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Übertragen Sie die Suspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie unter den gleichen Bedingungen. Entsorgen Sie dann den Überstand und lagern Sie das Pellet gegebenenfalls bei minus 80 Grad Celsius. Lösen Sie eine Proteasehemmer-Minitablette in 20 Millilitern Waschpuffer auf.

Geben Sie die Proteaseinhibitorlösung zum Pellet und wirbeln Sie die Mischung ein, um das Pellet wieder zu suspendieren. Die Suspension wird in ein 100-Milliliter-Becherglas gegeben. Als nächstes beschallen Sie die Suspension, um die Zellen zu lysieren, und positionieren Sie die Sonde etwa einen Zentimeter vom Boden des Becherglases entfernt.

Geben Sie das Lysat in ein konisches Metallröhrchen und zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 mal G bei vier Grad Celsius für 60 Minuten. Filtrieren Sie das Lysat mit einem Spritzenfilter. Isolierung von TreT durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie und Beurteilung der Reinheit mit SDS-Seite.

Tauschen Sie dann TreT durch Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius in Tris-Puffer aus, um die TreT-Lösung für die Trehalose-Analogsynthese zu bilden. Sammeln Sie den Rohling aus der Dialysewäsche. Bestimmen Sie die TreT-Konzentration durch UV-Vis-Spektroskopie gegen den Dialyse-Rohling.

Um mit der Synthese von 6-Azido-trehalose unter Verwendung von TreT auf der Skala von 20 bis 30 Milligramm zu beginnen, geben Sie 0,08 Millimol 6-Azido-Glucose, 0,16 Millimol UDP-Glucose und 0,08 Millimol Magnesiumdichlorid in ein konisches 15-Millimeter-Röhrchen. Fügen Sie den TreT- und Tris-Puffer hinzu. Verdünnen Sie die Mischung nach Bedarf mit Tris-Puffer, um eine Enzymkonzentration von 300 Mikrogramm pro Milliliter in einem Endvolumen von vier Millilitern zu erreichen.

Verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es um, um die Feststoffe aufzulösen. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius unter Schütteln bei 300 U/min. Während der Inkubation werden drei Milliliter entionisiertes Wasser in eine 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit gegeben und bei 3.000 G zentrifugiert, bis sich die gesamte Flüssigkeit im Röhrchen befindet.

Wiederholen Sie den Waschvorgang noch zweimal, um eine gründliche Spülung der Filtereinheit zu gewährleisten. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, kühlen Sie die Mischung auf Eis auf Raumtemperatur ab. Anschließend wird das Produktgemisch in die Zentrifugalfiltereinheit überführt.

Spülen Sie das Reaktionsrohr dreimal mit einem Milliliter entionisiertem Wasser und geben Sie jede Spülung in die Zentrifugalfiltereinheit. Die Mischung wird bei 3.000 G zentrifugiert, bis die gesamte Flüssigkeit in das Röhrchen gelangt ist. Geben Sie drei Milliliter entionisiertes Wasser in die Filtereinheit und zentrifugieren Sie erneut unter den gleichen Bedingungen.

Wiederholen Sie das Spülen nach Bedarf, um die Produktrückgewinnung zu maximieren. Geben Sie drei Gramm Mischbett-Ionenaustauscherharz zum Filtrat. Rühren Sie die Mischung mit einem Rührstab bei Raumtemperatur eine Stunde lang um.

Nach dem Rühren den Überstand dekantieren und filtrieren. Spülen Sie das Harz mit fünf Millilitern entionisiertem Wasser ab und filtern Sie die Spülung. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, um die Produktrückgewinnung zu maximieren und alle Filtrate zu kombinieren.

Das kombinierte Filtrat wird konzentriert. Um dann nach nicht umgesetztem 6-GlcAz-Vorläufer zu suchen, bereiten Sie eine Kieselgel-DC-Platte mit Spots von 6-GlcAz, 6-TreAz, dem konzentrierten Produkt und einem Co-Spot vor. Entwickeln Sie die Platte mit einer Mischung aus n-Butanol, Ethanol und entionisiertem Wasser.

Sobald die Platte trocken ist, visualisieren Sie die Flecken, indem Sie die Platte in 5 % Schwefelsäure und Ethanol tauchen und die Platte auf einer heißen Platte auf hoher Stufe etwa fünf Minuten lang erhitzen. Wenn ein nicht umgesetzter Vorläufer beobachtet wird, reinigen Sie das Produktgemisch auf einer Größenausschlusssäule und wiederholen Sie die DC-Analyse. Sobald das reine Trehalose-Analogon erhalten wurde, entfernen Sie das Wasser, um das getrocknete 6-TreAz-Produkt zu erhalten.

Das TreT-Enzym stereo verbindet selektiv das Glukoseanalogon und die UDP-Glukose zum entsprechenden Trehalose-Analogon. Der Reaktionsbereich umfasst stereochemische Desoxifluor-, Thio- und Azidomodifikationen. Substituenten an der vierten Position des Rings werden jedoch weniger gut vertragen.

Mit diesem Verfahren wurde das Glukoseanalogon 6-GlcAz in weniger als 60 Minuten quantitativ in das Trehalose-Analogon 6-TreAz umgewandelt, was durch TLC bestätigt wurde. Das reine Produkt wurde mit der nicht-chromatographischen Spindialyse-Ionenaustauscher-Aufreinigungsmethode isoliert und mittels NMR in der HPLC charakterisiert. Die reine 6-TreAz-Lösung wurde dann verwendet, um die Azidmarkierung des Modellbakteriums M.smegmatis durchzuführen.

Die anschließende Fluorophor-Markierung durch eine Click-Chemie-Reaktion mit den Aziden der Zelloberfläche zeigte, dass M.smegmatis mit einem funktionellen Trehalose-Transporter erfolgreich mit Aziden markiert worden war, während der Stamm ohne dies nicht der Fall war. Einmal gemeistert, kann die TreT-Katalysereaktion und die anschließende Reinigung in ein bis vier Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der verwendeten Spülschritte, um die Produktionsrückgewinnung zu maximieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass das Reaktionsprodukt immer durch NMR und TLC oder HPLC analysiert werden sollte, um seine Reinheit und Struktur zu bestätigen.

Nach diesem Verfahren kann das synthetisierte Trehalose-Analogon evaluiert oder als bakterielle Bildgebungssonde, metabolischer Tracer, Enzyminhibitor oder Biomolekül-Stabilisierungsmittel eingesetzt werden. Diese Methode bietet Forschern die Möglichkeit, Trehalose-Analoga mit Modifikationen wie stabilen Isotopen- oder Radioisotopenmarkierungen herzustellen. Insgesamt sollten die auf diese Weise zugänglichen Verbindungen in der Tuberkuloseforschung und anderen biomedizinischen Forschungsbereichen nützlich sein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das TreT-Enzym exprimieren und reinigen, TreT verwenden, um Trehalose-Analoga in einem Schritt zu synthetisieren und die Trehalose-Analogprodukte zu reinigen.