Name: Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Bewertung von RNA-Molekülen gegen HIV-1 in humanen embryonalen Nieren-293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirksamkeit und Toxizität für die Entwicklung neuer Gentherapien.

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Die vorgestellten Arbeiten wurden von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt (gewährt DCB-120266, PPP-133377 und HBF-348967 zu AG).

1. Zellen und Transfektionen <ol><li> Kultur HEK 293T Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. Vorbereiten eines 2 x 10 5 Zellen / ml - Suspension in dem Zellkulturmedium. In 500, 100 und 1000 &amp; mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung von 24-Well, 96-Loch - und 12-Well - Platten, die für die virale Produktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays, bzw. (2A). </li><li> Vorsichtig schwenken die Platten und inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Wachsen Zellen zu 50-70% Konfluenz. </li><li> Nach einer Transfektion Plan, bereiten Verdünnungen von Test RNAs und ihre Kontrollen in 1,5 ml Mikroröhrchen (Beispiel 2B). <ol><li> Für die virale Produktion Assay, bereiten eine 10 ng / &amp; mgr; l Verdünnung einer HIV-1-Expressionsplasmid und 10 &amp; mgr; l zu jedem Röhrchen hinzufügen. Vorbereitung Die nächsten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine negative Kontrolle RNA. In 2,5 oder 10 &amp; mgr; l jeder Test RNA und negative Kontrolle Verdünnung auf die entsprechenden Rohre für 25 oder 100 nM Endkonzentrationen. </li><li> Für die Zelllebensfähigkeitstest vorbereiten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine 10 mg / ml Verdünnung der positiven Kontroll-RNA, niedermolekulare Poly I: C. Fügen Sie 2 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA-Verdünnungen zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 &amp; mgr; g / ml Endkonzentration, respectively. </li><li> Für die Immunaktivierung Test werden 20 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA Verdünnungen, hergestellt in Schritt 1.3.2. zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 &amp; mgr; g / ml Endkonzentration, respectively. Hinweis: Für den Test-RNA-Expressionsplasmide Herstellung von 10 ng / ul-Verdünnungen anstelle der 5 &amp; mgr; M Verdünnungen von Test RNAs, so dass endgültige Mengen von 25 und 100 ng für Schritt 1.3.1. und 100 ng für die Schritte 1.3.2. und 1.3.3. </li></ol></li><li> In 50, 25 oder 75 &amp; mgr; l DMEM zu jeder Transfektion Rohr für die virale production, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays sind. Für die virale Produktion Assays bringen Zellen und bereit Transfektion Rohre zu einem Bio-Sicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor vor dem nächsten Schritt. </li><li> Fügen Sie 2 ul des Transfektionsreagenz sequentiell an die Transfektion Röhrchen und Inkubation 15 bis 20 min-Komplexen zu erlauben, zu bilden. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Transfektionsreagenz verwendet werden. </li><li> Fügen Sie die gesamte Transfektionsgemischs aus jedes Mikroröhrchen tropfenweise auf die entsprechenden Positionen in den Zellkulturplatten. Leicht geschwenkt und die Platten für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2 inkubieren. </li><li> Messen Sie HIV-1 - Produktion (Abschnitt 2), die Lebensfähigkeit der Zellen (Abschnitt 3) und Immunaktivierung (Abschnitt 4) in den Zellkulturplatten (2C). </li></ol> 2. Viral Produktion Assay <ol><li> Entfernen Sie die 24-Well-Zellkulturplatten aus dem Inkubator und vorsichtig schwenken die Platten im Inneren der BSL3 ZellkulturHaube. Übertragung von 150 &amp; mgr; l Überstand aus jeder Vertiefung auf eine gut entspricht, in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die verwendet werden, HIV-1-Produktion zu quantifizieren. Hinweis: Common viral Quantifizierungsassays umfassen die Expression des HIV-1 - Kapsidprotein Messung (p24) durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20, viraler RNA durch reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion quantifiziert (RT-PCR) 21 und Messen der Aktivität der HIV-1 RT-Enzym. Die Schritte 2.2 bis 2.5 erklären Methoden HIV-1 - RT - Aktivität 13,15,16 zu quantifizieren. </li><li> Transfer 5 &amp; mgr; l Überstand zu entsprechenden Vertiefungen in einer 96-Well - Platte, enthaltend 25 &amp; mgr; l einer viralen Störung Cocktail 15 (Tabelle 1). Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT und übertragen die Platte auf eine Radioaktivität Workstation. Hinweis: Schritt 2.2. Wenn ein Radioaktivität Workstation ist nur notwendig, nicht im BSL3 Labor ist. Wenn die Platten müssen nicht aus der entfernt werdenBSL3 Labor, gehen 2.3 zu treten. und fügen Sie 50 ul radioaktivem / viralen Störung Cocktail (Tabelle 1) anstelle der 25 ul radioaktiver Cocktail. </li><li> Bereiten Sie eine radioaktive Cocktail 15 (Tabelle 1), und fügen Sie 25 ul in jede Vertiefung der viralen Überstand und Störungen Cocktail. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Spot 5 ul der Reaktionsmischung auf entsprechenden Plätzen in einer Glasfaser Di Ethyl Aminoethyl (DEAE) Filtermat Papier und ermöglichen die Flecken für 10 min trocknen. Spot der Reaktionsmischung auf jedem anderen Platz, so dass keine zwei Proben unmittelbar aneinander Grenze. Dies hilft, cross-over zwischen den Proben zu vermeiden, wenn in Counts pro Minute (cpm) Schritt 2.6 bestimmt wird. </li><li> Waschen Sie die Papiere für 5 min 5x mit 2x Salz Natriumcitrat (SSC) Puffer (Tabelle 1), gefolgt von zwei 1 minütiges Waschen mit 95% Ethanol. Lassen Sie die Papiere, um zu trocknen und zu versiegeln sie in einen Probenbeutel verpackt. </li><li> Clip Probenbeutel containing die Filtermatte Papier in eine Kassette und legen Sie die Kassette in einem Mikrotiterplatten-Szintillationszähler. Stellen Sie den Zähler cpm für 32 P mit dem Referenzdatum für die Partie von [32 P] dTTP in dem Experiment verwendet zur Verfügung gestellt zu lesen. Wählen Sie die Proben zu lesen, die Platte Karte unterhalten und den Zähler zu starten. </li><li> Für jede viral Quantifizierungsmethode, teilen die Werte für jede Test RNA durch die benachbarte negative Kontrolle erhalten und multiplizieren diesen Wert mit 100 für jede Wiederholung der Test RNAs die prozentuale Hemmung der HIV-1-Produktion zu erhalten. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs in unterschiedlichen Konzentrationen zu vergleichen ist in 3 bereitgestellt. </li></ol> 3. Zell Viability Assay <ol><li> Entfernen Sie die Platten mit 96 Vertiefungen aus dem Inkubator und füge 20 &amp; mgr; l von 5 mg / ml MTT (3- [4,5-Dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromid), verdünnt in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ( DPBS) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten foder 3 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Zugabe von 150 ul angesäuertes Isopropanol mit einem Detergens (1% NP-40, 4 mM HCl in Isopropanol) in jede Vertiefung und Inkubieren der Platten für 2 h bei RT. </li><li> Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer. </li><li> Berechnen der relativen MTT-Metabolismus für jede positive Kontrolle und Test-RNA durch den Wert für jede Probe durch seinen benachbarten Transfektionskontrolle erhalten dividiert wird. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle Vergleich ist in Figur 4 vorgesehen. </li></ol> 4. Immunaktivierung Assay <ol><li> Entfernen Sie die 12-Well-Platten aus dem Inkubator und absaugen Kulturmedien. Die Zellen vorsichtig waschen zweimal mit DPBS und 70 ul Puffer kalt Lyse in jede Vertiefung 22 (einschließlich Protease und Phosphatase - Inhibitoren, Tabelle 1) hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Platten für 10 Minuten auf Eis. </li><li> Übertragen Sie Zelllysate auf Mikroröhrchen und sie schnell frieren durch das EintauchenRöhrchen in flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Proben für 2 weitere Gefrier-Auftau-Zyklen für insgesamt 3 aufzutauen und zu wiederholen. </li><li> Zentrifugation der Lysate 15 min bei 4 ° C, 15.700 xg, um Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand auf neue Mikroröhrchen und bestimmen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Coomassie - Blau (Bradford) Methode 23,24. </li><li> Auflösen 75 ug Protein aus jeder Probe in einem 10% igen denaturierenden Polyacrylamid - Gel und Transfer auf eine Nitrocellulosemembran , wie zuvor beschrieben 25,26. </li><li> (Tabelle 1) für 1 min , gefolgt von Waschen in doppelt destilliertem Wasser nach der Elektrophorese und Transfer auf eine Membran, offenbaren Proteinbanden durch die Membran in Ponceau S inkubiert. Verwenden Sie die Bänder und Proteinleiter als Führung der Membran bei 80 und 55 kDa zu schneiden. Hinweis: In Schritt 4.4 kann mit Hilfe von 16 x 18 cm 2 Gelen ausgeführt werden , bis zu 34 kDa, so dass es einfach ist , die Membran an den angegebenen Positionen zu schneiden und nicht durch den ausgeschnittenenBands von Interesse. Alternativ können mehrere Gele mit den gleichen Proben durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass die Membran zu schneiden. </li><li> Auswaschen der Ponceau S Färbung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung , enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST, Tabelle 1). In TBST mit 5% fettfreie Milch, um vollständig die Membranen abdecken. Inkubieren der Membranen bei RT unter Rühren für 1 Stunde. </li><li> Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 in 1000 gegen ADAR1 verdünnten Antikörper (110 und 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa) und phospho-IRF3 (47 kDa), für die oberen, mittleren und unteren Teile der Membran sind. </li><li> Waschen Sie die Membranen für 5 min mit TBST 5x und in TBST mit 5% fettfreie Milch und Peroxidase-markierten Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (verdünnt auf 1 in 5000) für 1 Stunde inkubiert. </li><li> Waschen Sie die Membranen 5x 5 min mit TBST und gelten Elektrochemilumineszenz (ECL) Lösung, die Bänder auf Filme zu visualisieren den Anweisungen des Herstellers entsprechend. </li><li> Nach Visualisierung auf Filme, die die Proteinbanden, wasche die mittleren und unteren Stücke der Membran für 10 min mit einem Antikörper Ausstreiflösung. Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% BSA und Antikörper gegen Gesamt PKR (bei 1 in 500) und IRF3 (bei 1 in 1000), für die mittleren und unteren Teile, respectively. Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers für die PKR-Membran (mittel). </li><li> Waschen Sie das Unterteil der Membran 5x für 5 min mit TBST und die Membran in TBST mit 3% BSA für 1 h inkubiert mit einem Antikörper gegen Actin (verdünnt auf 1 in 5000). Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle zu vergleichen ist in 5 vorgesehen. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Antikörpern verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die HIV-1 - Produktion beschriebenen Assay wurde unter Verwendung von HEK293T - Zellen (Figur 2) durchgeführt und ist ähnlich Assays verwendet HIV-1 - RNA für eine effektive Ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30 und U1i RNA 11,31 Zielstellen zu screenen. Mit Hilfe verschiedener Methoden HIV-1-Produktion zu quantifizieren, wurden die meisten Studien virale Produktion 48 Stunden nach der Co-Transfektion eines HIV-1-Expressionsplasmid mit Kandidaten RNAs gemessen. Na...

Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T - Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 - Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie 1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen 3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 - Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation 4. Mehrere Kandidaten anti-HIV-1 - Gene wurden mit einigen klinischen Studien Eingabe in Kombinationen von zwei oder drei 5 6, die die Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber einem einzelnen Gen zu verhindern. Anti-HIV-1 RNAs sind unter den ersten Kandidaten für die Kombination Gentherapie aufgrund ihrer niedrigen Potential Immunantworten hervorzurufen, und weil siesind von sehr kurzen Gensequenzen transkribiert. Einige anti-HIV-1 RNAs wurden entwickelt Viruseintritt und Integration zu zielen. Allerdings sind die meisten anti-HIV-1 - RNA das Ziel nach der Integrationsschritte im viralen Lebenszyklus (Abbildung 1). Nachintegration Inhibitoren umfassen Decoy RNAs, die Targeting - HIV-1 - regulatorischen Proteine ​​Tat oder Rev 1 und Antisense-RNAs beruhen, verschiedene Standorte in HIV-1 - RNA - Targeting, wie Ribozyme 7, 8 und shRNAs U1i RNAs 9. Verfahren, die die Wirksamkeit von Anti-HIV-1 RNAs gehören die Überwachung der viralen Replikation in Zellen , transduziert mit Genen , kodierend für Kandidaten RNAs und Mess virale Produktion in Zellen , transient transfiziert mit Plasmiden exprimieren Kandidaten RNAs und eine HIV-1 - Expressionsplasmid 10 zum Vergleich verwendet wurden -13. Wir haben zuvor eine HIV-1 - Produktion zu screenen Assay HIV-1 RNA für neue Ribozym - Zielstellen 13-15 verwendet. Diese Verfahren sind seit verfeinert das Format einer RNA zu optimieren,Interferenz - Molekül von dem Plasmid DNA als shRNA oder geliefert als synthetisches siRNA 16 ausgedrückt. Der Assay misst die Produktion von reifen Viren aus menschlichen embryonalen Nieren (HEK) , 293T - Zellen, und kann verwendet werden , die Auswirkungen von Inhibitoren zu vergleichen , die nach der Integrationsschritte in der HIV-1 - Replikationszyklus Ziel (Abbildung 1). Für Inhibitoren , die Pre-Integrationsschritte Ziel, alternative Assays wie eine TZM-bl Zelle Infektiosität Assay 17 nötig sind , um antivirale Wirksamkeit zu bewerten. Wichtige Sicherheitsbedenken für die Lieferung von Anti-HIV-1-RNA in der Klinik sind potenzielle Nebeneffekte auf die menschliche RNAs oder Proteine, und die Aktivierung der angeborenen Immunsensoren. Um die Toxizität von anti-HIV-1 siRNAs bewerten, haben wir einen Zelllebensfähigkeitstest in verschiedenen Zelllinien 16 verwendet. Wir maßen auch die Aktivierung der doppelsträngigen RNA-Immunsensoren, RNA aktivierte Proteinkinase R (PKR) und Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), sowie expression des Interferon-stimulierte Gen, ADAR1 p150. Diese Assays können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit von Anti-HIV-1-RNA ist nicht auf indirekte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Immunsensoraktivierung. Sie sind auch nützlich in Ausnahme von Kandidaten RNAs mit potentiellen Toxizitäten von der weiteren Entwicklung. In den folgenden Protokolle, Verfahren neue therapeutische RNAs zu identifizieren und zu optimieren das Format der bestehenden beschrieben werden. Die Verfahren sind nützlich für das Screening RNA basieren Nachintegration Inhibitoren der HIV-1 - Replikation und angepasst werden könnten andere post-Integration - Inhibitoren, wie kleine Moleküle Targeting Rev vermittelte Export von viraler RNA 18 oder CRISPR / CAS - Systeme entwickelt , um screenen integrierten Ziel HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten, 96 Well, 24 Well, 6 Well.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Niedermolekulares Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Transfektionsreagenz für synthetische RNAs</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>Transfektionsreagenz für RNA-Expressionsplasmide</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-RNA-Template&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 DNA-Primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE Filtermat Papier&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Szintillationszähler</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer Tabletten</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitoren</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge Eppendorf</td><td></td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Laufkammer</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Halbtrockene Transferzelle</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Proteinleiter EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper-Stripping-Lösung</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>ADAR1 Antikörper</td><td></td><td></td><td>von Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>Phospho-T446-PKR Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-S396-IRF3 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR Antikörper</td><td></td><td></td><td>von Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Aktin Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-markierte Ziegen-Anti-Kaninchen</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-markierte Ziegen-Anti-Maus</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der wirksamkeit und toxizität von rnas targeting hiv-1-produktion für den einsatz in gene oder arzneimitteltherapie

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Kleine RNA-Therapien, die auf Postintegrationsschritte im HIV-1-Replikationszyklus abzielen, gehören zu den Top-Kandidaten für die Gentherapie und haben das Potenzial, als medikamentöse Therapien für HIV-1-Infektionen eingesetzt zu werden. Zu den Postintegrationsinhibitoren gehören Ribozyme, kurze Hairpin-RNAs (sh), kleine interferierende (si) RNAs, U1-Interferenz-RNAs (U1i) und RNA-Aptamere. Viele von ihnen wurden mit Hilfe von transienten Co-Transfektionsassays mit einem HIV-1-Expressionsplasmid identifiziert, und einige sind in klinische Studien übergegangen. Zusätzlich zu den Wirksamkeitsmessungen wurden kleine RNAs auf ihr Potenzial untersucht, die Expression menschlicher RNAs zu beeinflussen, das Zellwachstum und/oder die Zelldifferenzierung zu verändern und angeborene Immunantworten hervorzurufen. In den hier beschriebenen Protokollen wird eine Reihe von transienten Transfektionsassays beschrieben, die zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen entwickelt wurden, die auf Postintegrationsschritte im HIV-1-Replikationszyklus abzielen. Wir haben diese Assays verwendet, um neue Ribozyme zu identifizieren und das Format von shRNAs und siRNAs zu optimieren, die auf HIV-1-RNA abzielen. Die Methoden bieten eine schnelle Reihe von Assays, die für das Screening neuer Anti-HIV-1-RNAs nützlich sind und für das Screening anderer Postintegrationsinhibitoren der HIV-1-Replikation angepasst werden könnten.

Eine allgemeine schematische Darstellung der Verfahren ist in Figur 2 mit einem Beispiel der Transfektion Plan für drei Test RNAs und einer Steuer RNA bereitgestellt in 2B gezeigt. Für die virale Produktion und Zelllebensfähigkeitstests, die Auslese für jedes Testkonstrukt wird auf eine negative Kontrolle normalisiert. Replikate werden in Sätzen transfiziert, so daß jeder Test RNA an seinen benachbarten negativen Kontrolle normiert. Dies geschieht, um un...

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirksamkeit und Toxizität neuer RNA-Moleküle, die auf die Produktion von HIV-1 abzielen, zu vergleichen. Diese Methode kann dabei helfen, neue RNA-Moleküle für die gentherapeutische oder medikamentöse Behandlung von HIV-1 zu identifizieren, beispielsweise kurze Haarnadel- oder kleine interferierende RNAs, Ribozyme und RNA-Decoys. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass mehrere neue RNA-Konstrukte gleichzeitig und mit kurzer Durchlaufzeit getestet werden können.Obwohl diese Methode zur Bewertung neuer RNA-basierter Arzneimittel oder Gentherapien gegen HIV entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf kleine Moleküle oder CRISPR-Anwendungen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Experimente aufbauten, um eine große Anzahl von Ribozymen auf anti-HIV-Effekte zu testen. Bereiten Sie zunächst eine Suspension menschlicher embryonaler Nierenzellen 293T mit zwei mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter in DMEM mit 10 % FPS und 1 % Penicillin-Streptomycin vor.Geben Sie 500, 100 bzw. 1.000 Mikroliter der Zellsuspension in die jeweiligen Vertiefungen von 24-, 96- und 12-Well-Platten für die Virusproduktions-, Zellviabilitäts- und Immunaktivierungs-Assays. Schwenken Sie die Platten vorsichtig und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid bis zu einer Konfluenz von 50 % bis 70 %. Für den Virusproduktions-Assay stellen Sie eine Verdünnung des HIV-1-Expressionsplasmids mit 10 Nanogramm pro Mikroliter her und geben 10 Mikroliter zu jedem Assay-Röhrchen hinzu.Bereiten Sie anschließend Verdünnungen von fünf Mikromolar der Test-RNAs sowie einer negativen Kontroll-RNA vor. Geben Sie dann 2,5 oder 10 Mikroliter jeder Test-RNA- und negativen Kontrollverdünnung in die entsprechenden Röhrchen, um Endkonzentrationen von 25 Nanomolar bzw. 100 Nanomolar zu erreichen. Für den Zellviabilitätsassay stellen Sie Verdünnungen von fünf Mikromolar der Test-RNAs sowie eine Verdünnung von 10 Milligramm pro Milliliter der positiven Kontroll-RNA, low molecular weight poly(I:C), her. Fügen Sie jeweils zwei Mikroliter der Test-RNA- oder der positiven Kontroll-RNA-Verdünnung in die entsprechenden Röhrchen hinzu, um Endkonzentrationen von 100 Nanomolar bzw. 200 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.Fügen Sie für den Immunaktivierungstest 20 Mikroliter der Test-RNA oder der positiven Kontroll-RNA-Dilutionen, wie für den Zellviabilitätstest vorbereitet, den entsprechenden Röhrchen für endgültige Konzentrationen von jeweils 100 Nanomolar oder 200 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Fügen Sie anschließend jeweils 50, 25 oder 75 Mikroliter DMEM den Transfektionsröhrchen für die virale Produktion, den Zellviabilitätstest und den Immunaktivierungstest hinzu. Für die Tests zur viralen Produktion bringen Sie die Zellen und die vorbereiteten Transfektionsröhrchen vor dem nächsten Schritt in ein Biosicherheitslabor der Stufe drei (BSL-3).Geben Sie zwei Mikroliter des Transfektionsreagens nacheinander zu den Transfektionsröhrchen hinzu und inkubieren Sie 15 bis 20 Minuten, um die Bildung von Komplexen zu ermöglichen. Fügen Sie die gesamte Transfektionsmischung aus jedem Mikroröhrchen tropfenweise den entsprechenden Positionen in den Zellkulturschalen hinzu. Vorsichtig schwenken und die Schalen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Um den Virusproduktionsassay durchzuführen, bringen Sie die 24-Loch-Zellkulturplatten nach Entnahme aus dem Inkubator in die BSL-3-Zellkulturhaube. Schwenken Sie die Platten vorsichtig und übertragen Sie anschließend 150 Mikroliter des Überstandes aus jedem Loch in das entsprechende Loch einer 96-Loch-Flachbodenplatte, die zur Quantifizierung der HIV-1-Produktion verwendet wird. Übertragen Sie fünf Mikroliter des Überstandes in die entsprechenden Löcher einer 96-Loch-Platte, die 25 Mikroliter eines viralen Aufbrech-Cocktails enthält.Nachdem das Gemisch fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde, die Platte in eine Radioaktivitätsarbeitsstation überführen. Danach einen radioaktiven Cocktail herstellen und 25 µL in jedes Loch mit viralem Überstand und Disruptionscocktail geben. Die Platten zwei Stunden lang bei 37 °C inkubieren.Tragen Sie fünf Mikroliter der Reaktionsmischung auf die entsprechenden Felder in einer Glasfasermatritze/DEAE-Filterpapiermatrize auf und lassen Sie die Tropfen 10 Minuten lang trocknen. Waschen Sie die Papiere fünfmal je fünf Minuten mit 2x SSC-Puffer, gefolgt von zwei einmaligen Wäschen mit 95 %igem Ethanol. Lassen Sie die Papiere trocknen, bevor Sie sie in Probenbeuteln versiegeln.Schneiden Sie die Probenbeutel mit dem Filtermatt-Papier in eine Messkassette ein und setzen Sie die Kassette in einen Mikroplatten-Flüssigszintillationszähler ein. Starten Sie anschließend den Zähler. Bei jeder Methode zur Virusquantifizierung teilen Sie die erhaltenen Werte für jede Test-RNA durch den benachbarten negativen Kontrollwert und multiplizieren diesen Quotienten mit 100, um die prozentuale Hemmung der HIV-1-Produktion für jede Wiederholung der Test-RNAs zu ermitteln.Um einen Zellviabilitätsassay durchzuführen, nachdem die 96-Loch-Platten aus dem Inkubator entnommen wurden, 20 Mikroliter einer fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung in DPBS in jedes Loch geben. Anschließend die Platten drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach 150 Mikroliter sauer alkoholisierte Isopropanol-Lösung mit Detergens in jedes Loch geben und die Platten zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Verwenden Sie dann ein Mikroplatten-Spektrophotometer, um die Extinktion bei 570 Nanometern zu bestimmen. Berechnen Sie den relativen MTT-Stoffwechsel für jede positive Kontrolle und Test-RNA, indem Sie den für jede Probe erhaltenen Wert durch die entsprechende Transfektionskontrolle teilen. Für den Immunaktivierungs-Assay aspirieren Sie nach dem Entnehmen der 12-Loch-Platten aus dem Inkubator das Kulturmedium und waschen die Zellen zweimal vorsichtig mit DPBS.Fügen Sie dann 70 µL kalten Lysepuffer, der Protease- und Phosphataseinhibitoren enthält, in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platten 10 Minuten lang auf Eis. Überführen Sie die Zelllysate in Mikroröhrchen und schnellgefrieren Sie diese, indem Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff tauchen. Nach dem Auftauen der Proben wiederholen Sie den Gefrier-Tau-Zyklus noch zweimal, sodass insgesamt drei Gefrier-Tau-Zyklen durchgeführt werden.Zentrifugieren Sie anschließend die Lysate bei 15.700 × g und 4 °C für 15 Minuten, um das Zelltrümmer-Pellet zu erhalten. Danach werden die Proteinbanden nach Elektrophorese und Übertragung auf eine Membran sichtbar gemacht, indem die Membran für eine Minute in Ponceau S inkubiert wird. Anschließend wird sie mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen.Verwenden Sie die Banden und die Proteinkalibrierungsskala als Orientierungshilfe, um die Membran bei 80 und 55 Kilodalton zu schneiden. Spülen Sie nun die Ponceau-S-Färbung mit TBS mit 0,05 % TWEEN 20 (TBST) aus. Geben Sie TBST mit 5 % fettfreier Milch hinzu, um die Membranen vollständig zu bedecken, und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln.Überführen Sie die Membranen in TBST mit 3 % BSA und Antikörpern, die für ADAR, Phosphor-PKR und Phosphor-IRF3 jeweils für das obere, mittlere und untere Stück der Membran im Verhältnis 1:1.000 verdünnt sind. Inkubieren Sie bei 4 Grad Celsius unter Schütteln über Nacht. Am folgenden Morgen waschen Sie die Membranen am nächsten Morgen fünfmal mit TBST, jeweils fünf Minuten lang, bevor Sie sie in TBST mit 5 % fettfreier Milch und mit Peroxidase markierten sekundären Antikörpern von Ziegen anti-Kaninchen im Verhältnis 1:5.000 für eine Stunde überführen.Nach der Sichtbaren Darstellung der Proteinbanden auf den Filmen verwenden Sie eine Abwaschlösung, um die mittleren und unteren Teile der Membran 10 Minuten lang zu waschen, bevor Sie den mittleren Teil der Membran mit PKR-Antikörpern und den unteren Teil mit IRF3-Antikörpern inkubieren. Als positiven Kontrollversuch untersuchen Sie die untere Membran gemäß dem Textprotokoll mit Antikörpern gegen Actin. Eine allgemeine Übersichtsabbildung der Assays ist hier zusammen mit einem Beispiel für einen Transfektionsplan für drei Test-RNAs und eine Kontroll-RNA dargestellt.Für die virale Produktion und Zellviabilitätsassays wird der Messwert für jeden Testkonstrukt auf einen negativen Kontrollwert normalisiert. Mithilfe des HIV-1-Produktionsassays in Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, das den HIV-1-Stamm NL4-3 exprimiert, wurde der Prozentsatz der RT-Aktivität in Zellen, die gleichzeitig mit einem der hier gezeigten siRNAs transfiziert wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit einem langen Dicer-Substrat-Nonsense-siRNA transfiziert wurden, berechnet, um die optimale Länge von RNA-Interferenz-Molekülen zu ermitteln, die eine konservierte Stelle in der HIV-1-RNA targeten. Basierend auf den wirksamsten identifizierten siRNAs wurde der Prozentsatz des MTT-Stoffwechsels für die transfizierten Zellen bestimmt.Längs doppelsträngiger RNA verringerte Poly(I:C) die Zellviabilität nur bei der höchsten Dosis. Für siRNAs, die auf die Position 1498 in der HIV-1-RNA abzielen, wurde unabhängig von ihrer Länge keine signifikante Verringerung der Zellviabilität beobachtet. Wie hier mittels Western Blot gezeigt, wurde dieselbe RNA-Satz in dem Assay zur Immunaktivierung evaluiert.Unter Bedingungen, bei denen Poly(I:C) die Expression von ADAR1-p150 aktiviert und die Phosphorylierung von PKR und IRF3 induziert, konnte für keines der Test-RNAs ein signifikanter Effekt auf Inaktivierungsmarker beobachtet werden. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie in sieben Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, hochwertige Präparationen sowohl von RNA als auch von DNA für die Transfektion zu verwenden.Des Weiteren sollten geeignete negative und positive Kontrollen einbezogen werden. Mit dieser Methode können anschließend andere Verfahren, wie beispielsweise die HIV-Infektion transduzierter Zellen, genutzt werden, um die langfristige Wirksamkeit und Toxizität potenzieller anti-HIV-Kandidaten zu bewerten. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik uns, eine zugängliche und konservierte Target-Sequenz in der HIV-RNA zu identifizieren und die Formate von Ribozymen, shRNAs und siRNAs, die darauf abzielen, zu optimieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neue RNA-Kandidaten, die auf die HIV-Produktion abzielen, mithilfe des Virusproduktionsassays auf Wirksamkeit und mithilfe der Immunaktivierungs- und Zellviabilitätsassays auf potenzielle Toxizität schnell screenen kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV und radioaktiv markierten Nukleotiden äußerst gefährlich sein kann. Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise indem zertifizierte Biosicherheitslabore und Radioaktivitätslabore verwendet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Aktuelle HIV-1-Strategien handeln, um den viralen Lebenszyklus zu unterdrücken, aber nicht effektiv beseitigen Infektion. Hier zeigen wir, dass ein technisch Rekombinase effizient Verbrauchsteuern integrierte HIV-1 Provirus-DNA aus dem Genom der infizierten Zellen.

Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase

Mehrere 2'-Fluoro RNA-Aptamere gegen HIV-1Ba-L gp120 mit Nanomol Affinität von einer RNA-Bibliothek isoliert...

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

Die Vorhersage des Korezeptor Nutzung von HIV-1 ist für die Verwaltung einer neuen Klasse von antiretroviralen Medikamenten, dh Korezeptor-Antagonisten erforderlich. Es kann durch Sequenzanalyse die durchgeführt...

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von...

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Wir haben ein Protokoll zur Generierung und Bewertung eines humanisierten und humanen, mit Immundefizienz virusinfizierten NOG-Mausmodells entwickelt, das auf Stammzelltransplantation, intravaginaler exposition menschlicher Immundefizienzviren und Tropfen-Digital-PCR-RNA basiert. Quantifizierung.

Humanisierte NOG-Mäuse für intravaginale HIV-Exposition und Behandlung von HIV-Infektionen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

In dieser Studie wurden In-silico-Strategien verwendet, um das aufgezählte Etravirin als vielversprechendes Therapeutikum für HIV zu identifizieren. Unsere Erkenntnisse über molekulare Wechselwirkungen und Dynamiken unterstützen das rationale Design neuartiger NNRTIs als mögliche HIV-Behandlungsalternativen.

Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung, Aktivitätsvorhersage und Molekulardynamik von Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren

Lernen Sie die Bewertung von RNA-Molekülen gegen HIV-1 in humanen embryonalen Nieren-293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirksamkeit und Toxizität für die Entwicklung neuer Gentherapien.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

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