Name: Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Messung von Glukose- und Fettsäureoxidation im isolierten Arbeitsrattenherz. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in die myokardiale Stoffwechselanpassung bei variierendem Energiebedarf.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der vorstehende Protokoll beschreibt die Methoden, um gleichzeitig den Fluss des Substrats durch Glucose-Oxidation und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherzen zu quantifizieren. Die Messungen können dann auf die aufgezeichneten Herzfunktionsparameter überlagert werden , um die Beziehung zwischen den Substraten Stoffwechsel und Herzarbeit unter der Basislinie und Belastungsbedingungen (Veränderung der Arbeitsbelastung, Ischämie-Reperfusion, etc ...) zu bestimmen. Es ist auch möglich, z...

Klinische Relevanz Im Säugerherz, gibt es eine starke positive Beziehung zwischen dem Fluß von Substraten durch oxidativen Stoffwechselwege, ATP Erzeugungs- und Herzarbeit 1. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich die Untersuchung der komplizierten Verbindung zwischen Herz-Stoffwechsel und Funktion führte zu erkennen , dass Veränderungen in der Herzstoffwechsel eine Ursache für die Kontraktions Dysfunktion sind und möglicherweise pathologischen strukturellen Umbau bei der Festlegung der verschiedenen Arten von Herzerkrankungen 2-4. daher wird erwartet , dass unser Verständnis der Mechanismen metabolischen Umbau des belasteten Herzleitungs wird zur Vorbeugung oder Behandlung von Herzinsuffizienz 5-7 zur Identifizierung therapeutischer Targets führen. Die jüngste Veröffentlichung einer wissenschaftlichen Erklärung der American Heart Association zum Thema &quot;Beurteilung der Herz Metabolism&quot;, betont das wachsende Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft für tsein Forschungsgebiet 8. Doch während die technologischen Fortschritte in der Herzbildgebung jetzt für eine schnelle und genaue Bewertung der kardialen Morphologie und Funktion zu ermöglichen, die in - vivo - Studie von Herz-Stoffwechsel bleibt begrenzt und beschwerlich: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spektroskopie und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung kann werden verwendet , um Herzenergiereichen Phosphatstoffwechsel und Krebs - Zyklus - Aktivität, aber diese Techniken sind geplagt durch hohe Betriebskosten und durch ihre Unfähigkeit zur Bestimmung des Beitrags der verschiedenen Substrate zu oxidativen Stoffwechsel in stationären Bedingungen 9 .To diesem Zeitpunkt der ex vivo verfolgen Herz Vorbereitung Arbeits stellt die einzige und einzigartige Technik zur Verfügung, gleichzeitig zu studieren und in Echtzeit, Kontraktionsfunktion und Fluss von Substraten in oxidativen Stoffwechselwege 7,9. Das folgende Protokoll zielt darauf ab, Richtlinien für die Herstellung und Verwendung von Reagenzien zu schaffen, verwendet die Ratte zu bestimmen,es von Substraten Nutzung in der isolierten Arbeitsrattenherz. Die isolierte Arbeits Nagetier-Herz-Apparat Obwohl die Technik Hälfte ist fast ein Jahrhundert alt, bleibt die isolierte Arbeitsrattenherz Vorbereitung eine Methode der Wahl für Herz-Kreislauf-Forschung. Wie bei der Langendorff-Herz der Zubereitung bietet das Arbeits rodent Herz eine relativ einfache, zuverlässige und kostengünstige Möglichkeit, eine Vielzahl von Herzparameter unabhängig von den verwirrenden Effekte anderer Organe, neurohormonal und andere zirkulierende Faktoren zu messen. Aber im Gegensatz zu dem Langendorff perfundierten Herzen, das Arbeits Herz weiterhin nahezu physiologischen Herzarbeit, eine Voraussetzung für die Bildung von oxidativen metabolischen Flusses auf ein Niveau durchzuführen , die zu in vivo - Bedingungen relevant sind. Dies wird durch die Bereitstellung der Perfusionspuffer mit dem linken Ventrikel (LV) über eine Kanüle mit dem linken Vorhof erreicht, und da der LV füllt und Verträge, diePuffer wird durch die Aorten-Leitung gegen einen entschlossenen Nachbelastung hydrostatischem Druck ausgestoßen. Das Design der Perfusionsapparatur beschrieben ursprünglich von Neely und Kollegen 10 wurde anschließend durch Taegtmeyer verbessert, Säume und Krebs 11, hat aber nur sehr wenig verändert seitdem. Wie in der ursprünglichen Gerät beschrieben, kann Kontraktionsfunktion durch Bestimmung der Herzleistung beurteilt werden, nicht mehr als Messzylinder mit und eine Stoppuhr Aorten zu messen und koronare fließt 10,11. Mehrere Hersteller bieten nun komplette Arbeits Nagetier Herz Perfusionssystemen. Diese kommerziell erhältlichen Vorrichtung kann mit flowprobes, Druckwandler erfaßt werden, ein Druck-Volumen-Katheter und die gesamte Ausrüstung, die für Herzfunktionsdatenerfassung und -analyse. Die Hersteller bieten eine umfangreiche Dokumentation und Schulungen den neuen Benutzer mit ihrer Ausrüstung vertraut zu machen. Einige Übersichten auch Detail-Protokolle auf dem Arbeits Herz instrumentation und über die Verwendung von Kathetern , Herzfunktion in Nagetieren 12-15 zu messen. Aus diesem Grund werden wir nur kurz auf die Set-up des Perfusionsgerät erwähnen und dem Aufnahmegerät. Das vorliegende Protokoll vielmehr soll die bereits vorhandenen Informationen mit einer Beschreibung der Methoden zu ergänzen, die gleichzeitig durchgeführt werden können, um die Raten der Glukose und langkettigen Fettsäureoxidation, die beiden großen Energie liefert Substrate in der normalen Herz messen. Wir beschreiben hier all die Schritte bei der Verwendung von radiomarkiertem Energiesubstrate für die Beurteilung der myokardialen oxidativen Metabolismus, aus der Herstellung von Reagenzien und Puffer zur Gewinnung und Verarbeitung von Proben, zur Datenanalyse. Prinzipien des Verfahrens Kardiomyozyten erzeugen den größten Teil ihrer Energie für die Kontraktion von der oxidative Phosphorylierung von Fettsäuren (hauptsächlich langkettige Fettsäuren) und Kohlenhydrate (glucose und Laktat). Das Herz hat eine begrenzte sehr energisch Reserven und stützt sich auf eine ständige Zufuhr dieser Energie liefert Substrate aus dem Kreislauf. Der Katabolismus von Glucose durch den glykolytischen Weg ergibt Pyruvat, das dann durch die Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex von der inneren Mitochondrienmembran decarboxyliert wird. Langkettige Fettsäuren, extrahiert aus Triglyceriden Albumin oder Lipoprotein Zirkulieren werden zuerst in Acyl-CoA-Molekülen in das Cytosol aktiviert und anschließend in der mitochondrialen Matrix durch die Carnitin-Shuttle transportiert, um die beta-Oxidationswegs ein. Die Acetyl-CoA - Molekülen durch den Katabolismus von Glucose und Fettsäuren , die den Krebs - Zyklus Kraftstoff die Reduktionsäquivalente (NADH und FADH 2) , die durch die Elektronentransportkette , verwendet werden zur Erzeugung der Protonen-Antriebskraft über die innere Mitochondrienmembran zu bauen und ATP durch die Aktivität der ATP-Synthase erzeugen. Wasser und Kohlendioxid sind die End-Nebenproduktedie enzymatischen Reaktionen im Inneren des Krebs-Zyklus stattfindet. Die Lieferung von 14 C- und H- 3 radiomarkierte Substrate (wie beispielsweise 14 C-radioaktiv markiertem Glukose und 3 H-radiomarkierten Ölsäure) zum isolierten Arbeits Herz wird folglich für die Produktion von 14 CO 2 und 3 H 2 O führen, wo quantitativ aus dem koronaren Abwasser zurückgewonnen werden. Die Sammlung von 14 CO 2 wird durch Halten der isoliert perfundierten Herzen in eine abgedichtete Kammer und durch sofortiges Gewinnen des koronaren Abflusses durchgeführt , wie es das Herz verlässt. Eine kleine Anionenaustauschsäule verwendet 3 H 2 O aus dem koronaren Ausfluß zu trennen und zu gewinnen. Die Radioaktivität aus den verarbeiteten Proben wird mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen und mit Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet, ist es dann möglich, den Fluss von Glukose und Fettsäure in der individuell QuantifizierenOxidationswege 16,17.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3</td><td>)Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 Harz, Chloridform, 100 - 200 trockene Maschenweite, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Dieser Artikel kann durch den direkten Kauf der Hydoxidform ersetzt werden. (siehe Referenz unten), aber dies kostet fast 8-mal mehr</td></tr><tr><td>AG 1-X8 Harz, Hydroxidform, 100 - 200 Trockenmaschenweite, 100 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>Der Kauf dieses Artikels ermöglicht es, die Umwandlung des Anionenaustauscherharzes von der Chloridform in die Hydroxidform zu umgehen (siehe Abschnitt 1.2 des Protokolls)</td></tr><tr><td>Glasmikroanalyse-Vakuumfilterhalter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Korrosiv. Konsultieren Sie das Sicherheitsdatenblatt des Produkts für die richtige Handhabung und Lagerung.</td></tr><tr><td>Gasdispersionsrohr mit Frittenzylinder</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Rinderserum Albumin Fettsäurefrei, Pulver</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Wir empfehlen die Verwendung eines mit Holzkohle entfetteten BSA, da andere Reinigungsverfahren wie z. B. die Kaltethanolfraktionierung Rückstände hinterlassen können, die für das Herz giftig sind.</td></tr><tr><td>Natriumoleat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Radioaktives Material. Befolgen Sie die Richtlinien des Strahlenschutzbüros Ihrer Institution für die Bestellung und Handhabung.</td></tr><tr><td>Membranschlauch für Dialyse, Durchmesser 29 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glukose, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Radioaktives Material. Befolgen Sie die Richtlinien des Strahlenschutzbüros Ihrer Institution für die Bestellung und Handhabung.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Controlled substance on USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Hochgiftig und verursacht schwere Verbrennungen. Konsultieren Sie das Produktdatenblatt für die angemessene Handhabung und Lagerung</td></tr><tr><td>20 ml Szintillationsfläschchen aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>Verwenden Sie Glasfläschchen zur quantitativen Rückgewinnung von 14CO2</sub</td></tr><tr><td>>20 ml HDPE-Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Verwenden Sie HDPE-Fläschchen für die quantitative Rückgewinnung von 3H2O</td></tr><tr><td>Rot Gummimanschettenstopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit 20 mL Szintillationsfläschchen; Wiederverwendbare</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Zur Injektion von Perchlorsäure durch den Gummimanschettenstopfen der CO2Falle</td></tr><tr><td>Perchlorsäure, 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Hochgradig korrosiv und kann als Oxidationsmittel wirken und/oder eine Explosionsgefahr verursachen. Konsultieren Sie das Produktdatenblatt für die sachgemäße Handhabung und Lagerung</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Glass Wool</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Detergent Powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Zur Reinigung von Glaswaren, Kunststoffteilen und Schläuchen</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Enzym-Active Powered Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>Zur Reinigung von "schwer zugänglichen" Oberflächen (Rohre, Glaswaren), die durch Fettsäure-BSA-Rückstände verunreinigt</td></tr></tbody></table> sind

methoden zur bestimmung von preisen von glucose und die oxidation von fettsäuren in der isolierten arbeitsrattenherz

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Die Säuger Herz ist ein großer Verbraucher von ATP und erfordert eine ständige Energiezufuhr für Substrate Kontraktion. Es überrascht nicht, Veränderungen der myokardialen Stoffwechsel wurden zur Entwicklung der Kontraktions Dysfunktion und Herzinsuffizienz verknüpft. Daher sollte auf einige der Mechanismen beleuchten den Zusammenhang zwischen Stoffwechsel und Kontraktion entwirren Herz Anpassung oder Fehlanpassung bei Krankheitszuständen regeln. Die isolierte Rattenherz arbeitet Zubereitung kann folgen verwendet werden, gleichzeitig und in Echtzeit, Herzkontraktionsfunktion und Energiefluß Substrate in oxidativen Stoffwechselwege bereitstellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Geschwindigkeiten der Oxidations für Glukose und Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, der Hauptenergiesubstrate des Herzens bereitstellt. Die Verfahren zur Probenanalyse und Dateninterpretation verwendet werden ebenfalls diskutiert.Kurz gesagt, ist die Technik , die auf die Lieferung von 14 C- radiomarkierten Glucose und einem 3 H radioaktiv markierten Fettsäure langkettige zu einem ex vivo schlagendes Herz über normothermic kristalloider Perfusion. 14 CO 2 und 3 H 2 O, Ende Nebenprodukte die enzymatischen Reaktionen in der Nutzung dieser Energie liefert Substrate beteiligt sind, werden dann quantitativ aus dem koronaren Ausflusses gewonnen. Bei Kenntnis der spezifischen Aktivität der radiomarkierten Substraten verwendet wird, ist es dann möglich, individuell auf den Fluss von Glukose und Fettsäure in der Oxidationswege quantifizieren. Kontraktionsfunktion des isolierten Herz kann mit dem entsprechenden Aufnahmegeräte und direkt korreliert metabolischen Flusswerte parallel bestimmt werden. Die Technik ist sehr nützlich, um den Stoffwechsel / Kontraktionsverhältnis in Antwort auf verschiedene Stressbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in pre und nach der Belastung und Ischämie zu untersuchen, ein Medikament oder ein circulating Faktor oder Produkt nach der Veränderung der Expression eines Gens.

Zwei repräsentativen Experimente sind in den Figuren unten beschrieben ist. In beiden Fällen wurde das Herz eines 16 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten isoliert und in den Arbeitsmodus mit KH-Puffer nach dem vorhergehenden Vorschrift hergestellt perfundiert. In jedem Experiment wurde das Herz mit einem Spannungszustand unterworfen Herzarbeit zu beeinflussen. Herzkontraktionsfunktion wurde durch kontinuierliche Aufzeichnung von Pulsdruck durch Einsetzen eines Druckwandlers in d...

Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Glukose- und Fettsäureoxidationsraten im isolierten Arbeitsherz der Ratte. Die Methoden, die für die Probenanalyse und die Dateninterpretation verwendet werden, werden ebenfalls diskutiert.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gleichzeitige Echtzeit-Messungen der myokardialen Raten der Glukoseoxidation und Fettsäureoxidation sowie der kontraktilen Herzfunktion in einem isolierten arbeitenden Rattenherzen zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, beispielsweise wie sich das Herz metabolisch an akute Änderungen des Energiebedarfs anpasst und wie diese Reaktionen unter pathologischen Bedingungen beeinflusst werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dem Untersuchenden eine vollständige Kontrolle über die Umweltvariablen bietet, wie beispielsweise die Art und Konzentrationen von Substraten, Arzneimitteln oder Hormonen, die dem Herzen zugeführt werden. Am meisten würde Bhavisha Bakrania, eine Postdoktorandin aus dem kardiovaskulären Reno-Ressourcenzentrum am University of Mississippi Medical Center, betroffen sein. Beginnen Sie damit, die Pumpe einzuschalten, um die Perfusionsapparatur zu spülen und den Puffer zu oxygenieren.Nachdem die Materialien vorbereitet wurden, betäuben Sie eine Ratte und bereiten Sie sie für die Operation vor. Rasieren Sie den Bauchbereich kahlen und führen Sie einen medianen Schnitt mit seitlicher Ausdehnung durch. Bewegen Sie den Magen und das Darm beiseite, um die Vena cava inferior freizulegen, und injizieren Sie 200 USP-Einheiten Heparin.Warten Sie fünf bis zehn Sekunden, dann schneiden Sie mit einer Schere das Zwerchfell und die Seiten des Brustkorbs auf, um den Inhalt der Brusthöhle freizulegen. Anschließend greifen Sie vorsichtig mit der Hand das Herz und entfernen Herz und Lungen gemeinsam. Schneiden Sie auf Höhe der absteigenden Aorta, wobei darauf geachtet werden muss, den Aortenbogen und die aufsteigende Aorta nicht zu beschädigen.Überführen Sie das Herz und die Lunge unverz&uuml;glich in eine Schnellschale, die mit eiskaltem KH-Puffer gef&uuml;llt ist. Sobald das Herz aufh&ouml;rt zu schlagen, lernen Sie, schnell zu arbeiten, damit es innerhalb von einer oder zwei Minuten wieder gestartet werden kann. Tauchen Sie das Herz und die Lunge nun in eine neue Schale mit eiskaltem KH-Puffer ein.Schneiden Sie umgehend große Stücke des Lungengewebes ab und durchtrennen Sie die absteigende Aorta direkt oberhalb des Aortenbogens. Für die folgenden Schritte sind die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit radioaktiven Stoffen zu beachten. Öffnen Sie anschließend vorsichtig mit einer Pinzette die Aorta und schieben Sie das Herz auf die Kanüle auf.Seien Sie sehr vorsichtig, um die Aortenroute nicht mit einer Kanüle zu passieren, da dies zu einer Hypoperfusion des Herzens und Schäden an den Aortenklappen führen kann. Sichern Sie nun die Verbindung mit einer Mikroklemme und leiten Sie die Langendorff-Perfusion des Herzens ein. Sichern Sie die Aorta ohne Eile mit einer 3-0-Seidennaht an der Aortenkanüle und entfernen Sie die Mikroklemme. Danach die Lungenvene lokalisieren und nicht-kardiales Gewebe nach Bedarf entfernen. Genügend Gewebe belassen, um den linken Vorhof an der Kanüle zu befestigen. Die Kanülierung des linken Vorhofs ist der zweitwichtigste Schritt des Protokolls, da eine unsachgemäße Einführung der Kanüle oder das Vorhandensein einer Undichtheit die Kontraktionen schwächen und die Quantifizierung der Stoffwechselraten beeinträchtigen würde.Bereiten Sie als Nächstes die linke Vorhof-Linienkanüle vor, genau wie bei der rechten Kanüle. Greifen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Öffnung der Lungenvene und schieben das Herz auf die Vorhofkanüle auf. Bewegen Sie die Gewebe nach Bedarf, ohne die Aorta zu verbiegen oder das Herz übermäßig zu belasten.Dann befestigen Sie die Kanüle mit einer 3-0-Seidennaht. Öffnen Sie abschließend die Vorhofleitung, während Sie gleichzeitig die Aortenleitung in den Arbeitsmodus schalten. Wenn Puffer aus dem linken Vorhof austritt, schließen Sie die Vorhofleitung und wechseln Sie zurück in den Langendorff-Modus.Verwenden Sie anschließend weitere Nähte, um die Kanüle besser zu befestigen, und versuchen Sie erneut, in den Arbeitsmodus zu wechseln. Falls das Experiment eine direkte Messung der LV-Funktion mit einem Katheter umfasst, punktieren Sie zunächst die LV-Spitze mit einer 26-Gauge-Nadel, führen Sie einen Druck-Volumen-Katheter ein und richten Sie den Schaft entlang der longitudinalen LV-Achse aus. Positionieren Sie danach die distale Elektrode E1 direkt unterhalb der Aortenklappe, angrenzend an die endokardiale Grenzfläche, und platzieren Sie die proximale Elektrode E4 knapp innerhalb der ventrikulären Wand.Versiegeln Sie nun das Herz in einer wassergekühlten Kammer. Beginnen Sie anschließend mit der Überwachung der funktionellen Parameter in der Software. Sobald die Basislinienparameter mindestens fünf Minuten lang stabil waren, beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung.Um den koronaren Fluss zu messen, notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um 20 Milliliter des Effluents zu sammeln. Entnehmen Sie anschließend zwei Milliliter des Effluents mittels einer Dreiventil-Schleuse in eine Spritze und verwerfen Sie den Rest. Überführen Sie die zwei Milliliter Probe unverzüglich in ein Mikrozentrifugenröhrchen und entnehmen Sie ein halbes Milliliter-Aliquot, um die Rate der Glukoseoxidation zu bestimmen.Bewahren Sie den Rest auf Eis auf. Nehmen Sie weiterhin in regelmäßigen Abständen Proben der koronaren Ausflüssigkeit und injizieren Sie vor Beendigung 10 Mikroliter hypertonische Kochsalzlösung in die Vorhofleitung, kurz bevor sie an die Kanüle angeschlossen wird.Verwenden Sie die Antwort auf diesen Bolus, um die parallele Leitfähigkeit zur genauen Bestimmung des Herzvolumens zu berechnen. Danach öffnen Sie die Herzkammer und entfernen den Katheter im linken Ventrikel. Schneiden Sie anschließend das Herz von den Kanülen ab und geben es in eiskaltes KH-Pufferlösung. Trocknen Sie das Herz nun schnell mit einem Papiertuch ab und bestimmen Sie das Feuchtgewicht.Nachdem das Gewicht bestimmt wurde, disziere die erforderlichen Gewebeproben und friere das verbleibende Gewebe mit auf Trockeneis gekühlten Zangen ein. Bereite als Vorbereitung Glaszählvials vor, indem du jedes mit einem Milliliter 10x Hyaminhydroxid befüllst. Stelle jeweils eines für jede koronare Ausflussprobe und zwei für Kontrollen bereit.Sobald eine Probenflasche geladen ist, stellen Sie sie direkt in eine beladene Szintillationsflasche. Verschließen Sie die Flasche für die Analyse vorsichtig mit einem Gummimanschettenstopfen und verwenden Sie Parafilm, um die Flasche abzudichten. Injizieren Sie nun mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer langen 23-Gauge-Nadel 200 Mikroliter 60%iger Perchlorsäure durch die Gummimanschette.Lassen Sie alle Probenfläschchen über Nacht stehen. Am nächsten Tag entnehmen Sie vorsichtig jedes Probengefäß mit einer Pinzette und spülen deren Böden über den offenen Fläschchen mit einem Milliliter Szintillationscocktail ab, um den gesamten Hyaminhydroxid zu gewinnen. Anschließend geben Sie weitere neun Milliliter Szintillationscocktail zu jedem Fläschchen hinzu.Um die spezifische Aktivität zu ermitteln, geben Sie 0,5 Milliliter Pufferpuffer in zwei der Vials. Schütteln Sie die Vials nun kräftig und lassen Sie sie mindestens sechs Stunden lang ruhen, bevor Sie Messungen durchführen. Um die myokardiale Oleat-Oxidationsraten zu bestimmen, bereiten Sie zunächst für jede Probe eine Anionenaustauscher-Säule vor.Füllen Sie die Spitzen von 3-Milliliter-Spritzen mit Glaswolle. Geben Sie dann die Harz-Wasser-Suspension mit einer Transferpipette bis zur 2-Milliliter-Marke in jede Säule. Spülen Sie anschließend das Harz, indem Sie dreimal je 2 Milliliter ultrareines Wasser durch jede Säule leiten.Dann Scintillationsgefäße unter die Säulen stellen und die Säulen mit einem halben Milliliter koronarem Effluent beladen. Für die Hintergrundmessung stattdessen Perfusionspuffer verwenden. Anschließend die Säulen nacheinander mit einer halben Milliliter, einer Milliliter und schließlich zwei Millilitern ultrareinem Wasser eluieren.Entsorgen Sie die Säulen. Geben Sie anschließend 13 Milliliter Szintillationscocktail in die Vials. Geben Sie 0,5 Milliliter Perfusionspuffer direkt in zwei Vials, die mit 13 Milliliter flüssigem Szintillationscocktail gefüllt sind, zur Bestimmung der spezifischen Aktivität.Schütteln Sie die Vials kräftig, lassen Sie sie mehr als sechs Stunden lang ruhen und nehmen Sie dann die Messungen vor. Herzen wurden von zwei 16 Wochen alten Ratten isoliert und unterschiedlichen Stressbedingungen ausgesetzt. Bei einem Herzen wurde eine akute Zunahme der Arbeitslast simuliert, indem die Nachlast um 40 % erhöht und Epinephrin zum Perfusionspuffer hinzugefügt wurde.Die Herzfrequenz stieg unmittelbar nach der Arbeitslastsprung-Induktion um mehr als 50 % an. Die Herzleistung erhöhte sich am Arbeitslastsprung um mehr als 40 %, was von einem Anstieg sowohl der Glukose- als auch der Oleat-Oxidationsraten begleitet wurde. Die relative Zunahme der Glukoseoxidation gegenüber dem Ausgangswert war auffällig.Das andere Herz wurde einer 15-minütigen globalen Ischämie und einer 30-minütigen Reperfusion unterzogen. Unter diesen Versuchsbedingungen wurde bereits nach wenigen Minuten eine nahezu normale Pulsdruckdifferenz während der Reperfusion wiederhergestellt. Innerhalb von 10 Minuten stieg die Herzleistung rasch über die Werte vor der Ischämie an, bevor sie anschließend wieder auf nahezu Ausgangswerte zurückging. Dies resultierte aus einer erhöhten Oxidation von Oleat. Während die Glukoseoxidation schnell wieder auf das vorischemische Niveau zurückkehrte. Wenn die Technik beherrscht ist, kann die Isolation des Herzens bis zur initialen Reperfusion im Arbeitsmodus, bei korrekter Durchführung, in weniger als fünf Minuten durchgeführt werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie RNA- und Proteinexpressionsanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den Effekt eines Medikaments oder einer Stressbedingung auf molekulare Signalwege. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Tracern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen vollständiger persönlicher Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.

NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

De novo Lipogenese und β-Oxidation von Fettsäuren bilden Schlüsselstoffwechselwege in Hepatozyten, Wege, die in mehreren Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleber gestört werden. Hier zeigen wir Isolierung von Maus primären Hepatozyten und zu beschreiben, die Quantifizierung der β-Oxidation von Fettsäuren und Lipogenese.

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H+ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Die Erforschung des Stoffwechsels wird für die immunologische Forschung immer relevanter. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in Maus-Splenozyten sowie T- und B-Lymphozyten vor.

Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Hier führen wir eine Methode zur Verwendung eines optischen Intraventrikelkatheters in durchlässigen Herzen ein, um eine Absorptionsspektroskopie über die Herzwand durchzuführen. Die gewonnenen Daten liefern robuste Informationen über die Gewebesauerstoffspannung sowie substratiennutzung und Membranpotenzial gleichzeitig mit kardialen Leistungsmessungen in dieser allgegenwärtigen Zubereitung.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung von 14C-markierter Palmitinsäure.

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines mitochondrialen Stresstests und eines Glykolytika-Rate-Assays in ex vivo Netzhautgewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Bioanalytikers.

Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Erfahren Sie die Messung von Glukose- und Fettsäureoxidation im isolierten Arbeitsrattenherz. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in die myokardiale Stoffwechselanpassung bei variierendem Energiebedarf.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

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