Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gleichzeitige Echtzeit-Messungen der myokardialen Raten der Glukoseoxidation und Fettsäureoxidation sowie der kontraktilen Herzfunktion in einem isolierten arbeitenden Rattenherzen zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, beispielsweise wie sich das Herz metabolisch an akute Änderungen des Energiebedarfs anpasst und wie diese Reaktionen unter pathologischen Bedingungen beeinflusst werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dem Untersuchenden eine vollständige Kontrolle über die Umweltvariablen bietet, wie beispielsweise die Art und Konzentrationen von Substraten, Arzneimitteln oder Hormonen, die dem Herzen zugeführt werden. Am meisten würde Bhavisha Bakrania, eine Postdoktorandin aus dem kardiovaskulären Reno-Ressourcenzentrum am University of Mississippi Medical Center, betroffen sein. Beginnen Sie damit, die Pumpe einzuschalten, um die Perfusionsapparatur zu spülen und den Puffer zu oxygenieren.

Nachdem die Materialien vorbereitet wurden, betäuben Sie eine Ratte und bereiten Sie sie für die Operation vor. Rasieren Sie den Bauchbereich kahlen und führen Sie einen medianen Schnitt mit seitlicher Ausdehnung durch. Bewegen Sie den Magen und das Darm beiseite, um die Vena cava inferior freizulegen, und injizieren Sie 200 USP-Einheiten Heparin.

Warten Sie fünf bis zehn Sekunden, dann schneiden Sie mit einer Schere das Zwerchfell und die Seiten des Brustkorbs auf, um den Inhalt der Brusthöhle freizulegen. Anschließend greifen Sie vorsichtig mit der Hand das Herz und entfernen Herz und Lungen gemeinsam. Schneiden Sie auf Höhe der absteigenden Aorta, wobei darauf geachtet werden muss, den Aortenbogen und die aufsteigende Aorta nicht zu beschädigen.

Überführen Sie das Herz und die Lunge unverzüglich in eine Schnellschale, die mit eiskaltem KH-Puffer gefüllt ist. Sobald das Herz aufhört zu schlagen, lernen Sie, schnell zu arbeiten, damit es innerhalb von einer oder zwei Minuten wieder gestartet werden kann. Tauchen Sie das Herz und die Lunge nun in eine neue Schale mit eiskaltem KH-Puffer ein.

Schneiden Sie umgehend große Stücke des Lungengewebes ab und durchtrennen Sie die absteigende Aorta direkt oberhalb des Aortenbogens. Für die folgenden Schritte sind die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit radioaktiven Stoffen zu beachten. Öffnen Sie anschließend vorsichtig mit einer Pinzette die Aorta und schieben Sie das Herz auf die Kanüle auf.

Seien Sie sehr vorsichtig, um die Aortenroute nicht mit einer Kanüle zu passieren, da dies zu einer Hypoperfusion des Herzens und Schäden an den Aortenklappen führen kann. Sichern Sie nun die Verbindung mit einer Mikroklemme und leiten Sie die Langendorff-Perfusion des Herzens ein. Sichern Sie die Aorta ohne Eile mit einer 3-0-Seidennaht an der Aortenkanüle und entfernen Sie die Mikroklemme.

Danach die Lungenvene lokalisieren und nicht-kardiales Gewebe nach Bedarf entfernen. Genügend Gewebe belassen, um den linken Vorhof an der Kanüle zu befestigen. Die Kanülierung des linken Vorhofs ist der zweitwichtigste Schritt des Protokolls, da eine unsachgemäße Einführung der Kanüle oder das Vorhandensein einer Undichtheit die Kontraktionen schwächen und die Quantifizierung der Stoffwechselraten beeinträchtigen würde.

Bereiten Sie als Nächstes die linke Vorhof-Linienkanüle vor, genau wie bei der rechten Kanüle. Greifen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Öffnung der Lungenvene und schieben das Herz auf die Vorhofkanüle auf. Bewegen Sie die Gewebe nach Bedarf, ohne die Aorta zu verbiegen oder das Herz übermäßig zu belasten.

Dann befestigen Sie die Kanüle mit einer 3-0-Seidennaht. Öffnen Sie abschließend die Vorhofleitung, während Sie gleichzeitig die Aortenleitung in den Arbeitsmodus schalten. Wenn Puffer aus dem linken Vorhof austritt, schließen Sie die Vorhofleitung und wechseln Sie zurück in den Langendorff-Modus.

Verwenden Sie anschließend weitere Nähte, um die Kanüle besser zu befestigen, und versuchen Sie erneut, in den Arbeitsmodus zu wechseln. Falls das Experiment eine direkte Messung der LV-Funktion mit einem Katheter umfasst, punktieren Sie zunächst die LV-Spitze mit einer 26-Gauge-Nadel, führen Sie einen Druck-Volumen-Katheter ein und richten Sie den Schaft entlang der longitudinalen LV-Achse aus. Positionieren Sie danach die distale Elektrode E1 direkt unterhalb der Aortenklappe, angrenzend an die endokardiale Grenzfläche, und platzieren Sie die proximale Elektrode E4 knapp innerhalb der ventrikulären Wand.

Versiegeln Sie nun das Herz in einer wassergekühlten Kammer. Beginnen Sie anschließend mit der Überwachung der funktionellen Parameter in der Software. Sobald die Basislinienparameter mindestens fünf Minuten lang stabil waren, beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung.

Um den koronaren Fluss zu messen, notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um 20 Milliliter des Effluents zu sammeln. Entnehmen Sie anschließend zwei Milliliter des Effluents mittels einer Dreiventil-Schleuse in eine Spritze und verwerfen Sie den Rest. Überführen Sie die zwei Milliliter Probe unverzüglich in ein Mikrozentrifugenröhrchen und entnehmen Sie ein halbes Milliliter-Aliquot, um die Rate der Glukoseoxidation zu bestimmen.

Bewahren Sie den Rest auf Eis auf. Nehmen Sie weiterhin in regelmäßigen Abständen Proben der koronaren Ausflüssigkeit und injizieren Sie vor Beendigung 10 Mikroliter hypertonische Kochsalzlösung in die Vorhofleitung, kurz bevor sie an die Kanüle angeschlossen wird.

Verwenden Sie die Antwort auf diesen Bolus, um die parallele Leitfähigkeit zur genauen Bestimmung des Herzvolumens zu berechnen. Danach öffnen Sie die Herzkammer und entfernen den Katheter im linken Ventrikel. Schneiden Sie anschließend das Herz von den Kanülen ab und geben es in eiskaltes KH-Pufferlösung. Trocknen Sie das Herz nun schnell mit einem Papiertuch ab und bestimmen Sie das Feuchtgewicht.

Nachdem das Gewicht bestimmt wurde, disziere die erforderlichen Gewebeproben und friere das verbleibende Gewebe mit auf Trockeneis gekühlten Zangen ein. Bereite als Vorbereitung Glaszählvials vor, indem du jedes mit einem Milliliter 10x Hyaminhydroxid befüllst. Stelle jeweils eines für jede koronare Ausflussprobe und zwei für Kontrollen bereit.

Sobald eine Probenflasche geladen ist, stellen Sie sie direkt in eine beladene Szintillationsflasche. Verschließen Sie die Flasche für die Analyse vorsichtig mit einem Gummimanschettenstopfen und verwenden Sie Parafilm, um die Flasche abzudichten. Injizieren Sie nun mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer langen 23-Gauge-Nadel 200 Mikroliter 60%iger Perchlorsäure durch die Gummimanschette.

Lassen Sie alle Probenfläschchen über Nacht stehen. Am nächsten Tag entnehmen Sie vorsichtig jedes Probengefäß mit einer Pinzette und spülen deren Böden über den offenen Fläschchen mit einem Milliliter Szintillationscocktail ab, um den gesamten Hyaminhydroxid zu gewinnen. Anschließend geben Sie weitere neun Milliliter Szintillationscocktail zu jedem Fläschchen hinzu.

Um die spezifische Aktivität zu ermitteln, geben Sie 0,5 Milliliter Pufferpuffer in zwei der Vials. Schütteln Sie die Vials nun kräftig und lassen Sie sie mindestens sechs Stunden lang ruhen, bevor Sie Messungen durchführen. Um die myokardiale Oleat-Oxidationsraten zu bestimmen, bereiten Sie zunächst für jede Probe eine Anionenaustauscher-Säule vor.

Füllen Sie die Spitzen von 3-Milliliter-Spritzen mit Glaswolle. Geben Sie dann die Harz-Wasser-Suspension mit einer Transferpipette bis zur 2-Milliliter-Marke in jede Säule. Spülen Sie anschließend das Harz, indem Sie dreimal je 2 Milliliter ultrareines Wasser durch jede Säule leiten.

Dann Scintillationsgefäße unter die Säulen stellen und die Säulen mit einem halben Milliliter koronarem Effluent beladen. Für die Hintergrundmessung stattdessen Perfusionspuffer verwenden. Anschließend die Säulen nacheinander mit einer halben Milliliter, einer Milliliter und schließlich zwei Millilitern ultrareinem Wasser eluieren.

Entsorgen Sie die Säulen. Geben Sie anschließend 13 Milliliter Szintillationscocktail in die Vials. Geben Sie 0,5 Milliliter Perfusionspuffer direkt in zwei Vials, die mit 13 Milliliter flüssigem Szintillationscocktail gefüllt sind, zur Bestimmung der spezifischen Aktivität.

Schütteln Sie die Vials kräftig, lassen Sie sie mehr als sechs Stunden lang ruhen und nehmen Sie dann die Messungen vor. Herzen wurden von zwei 16 Wochen alten Ratten isoliert und unterschiedlichen Stressbedingungen ausgesetzt. Bei einem Herzen wurde eine akute Zunahme der Arbeitslast simuliert, indem die Nachlast um 40 % erhöht und Epinephrin zum Perfusionspuffer hinzugefügt wurde.

Die Herzfrequenz stieg unmittelbar nach der Arbeitslastsprung-Induktion um mehr als 50 % an. Die Herzleistung erhöhte sich am Arbeitslastsprung um mehr als 40 %, was von einem Anstieg sowohl der Glukose- als auch der Oleat-Oxidationsraten begleitet wurde. Die relative Zunahme der Glukoseoxidation gegenüber dem Ausgangswert war auffällig.

Das andere Herz wurde einer 15-minütigen globalen Ischämie und einer 30-minütigen Reperfusion unterzogen. Unter diesen Versuchsbedingungen wurde bereits nach wenigen Minuten eine nahezu normale Pulsdruckdifferenz während der Reperfusion wiederhergestellt. Innerhalb von 10 Minuten stieg die Herzleistung rasch über die Werte vor der Ischämie an, bevor sie anschließend wieder auf nahezu Ausgangswerte zurückging.

Dies resultierte aus einer erhöhten Oxidation von Oleat. Während die Glukoseoxidation schnell wieder auf das vorischemische Niveau zurückkehrte. Wenn die Technik beherrscht ist, kann die Isolation des Herzens bis zur initialen Reperfusion im Arbeitsmodus, bei korrekter Durchführung, in weniger als fünf Minuten durchgeführt werden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie RNA- und Proteinexpressionsanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den Effekt eines Medikaments oder einer Stressbedingung auf molekulare Signalwege. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Tracern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen vollständiger persönlicher Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.