Spin Sättigungstransfer-Differenz-NMR (SSTD NMR): Ein neues Werkzeug zu erhalten kinetischen Parameter der chemischen Austauschprozesse

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die kinetischen Parameter und Prozesse eines gegenseitigen chemischen Austauschs in kleinen organischen und metallorganischen Molekülen zu ermitteln, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer messbar sind. Diese Methode kann dazu beitragen, die Moleküldynamik organischer und metallorganischer Moleküle, die einem chemischen Austausch unterliegen, besser zu verstehen. Beispiele hierfür sind Rotationsisomerie, Konformationsgleichgewicht, Stickstoffinversion, Ligninaustausch und Tautomerisierung.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass keine Koaleszenz der austauschenden Signale erforderlich ist und dass die Geschwindigkeitskonstante sowie die Relaxationszeit im selben Experiment erhalten werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich bei der Untersuchung des funktionellen Verhaltens von Platinionen-Komplexen in Lösung, wobei wir feststellten, dass die herkömmlichen Methoden der Temperaturabhängigen Ausrichtungsanalyse nicht geeignet waren. Aufgrund unserer Erfahrungen mit Protein-Lignin-Wechselwirkungen mittels NMR erkannten wir, dass ähnliche NMR-Ansätze tatsächlich auch zur Untersuchung von Austauschprozessen in organischen Molekülen angewendet werden könnten – was sich letztlich als zutreffend erwies.

Geben Sie fünf Milligramm N,N-Dimethylamid in ein für niedrige Temperaturen geeignetes NMR-Röhrchen und lösen Sie es in null Komma sechs Millilitern deuteriertem Toluol auf. Um die SSTD-NMR-Experimente einzurichten, bringen Sie zunächst die Probe in das Magnetfeld ein. Einer der entscheidenden Schritte zur Unterstützung des NMR-Experiments ist die Temperaturkontrolle; stellen Sie daher sicher, dass die Probe mindestens 20 Minuten lang bei der gewählten Temperatur stabilisiert wird.

Sobald die Probe im Magnet ist, EDTE in die Befehlszeile eingeben. Die Temperatur auf die erste ausgewählte Temperatur ändern, um das Experiment durchzuführen. Die Probe mindestens 20 Minuten lang bei der gewählten Temperatur stabilisieren lassen.

Führen Sie ein eindimensionales Protonen-NMR-Experiment an der Probe wie im Textprotokoll beschrieben durch und erstellen Sie anschließend einen neuen Datensatz eines Protonen-NMR-Experiments, indem Sie auf Datei, Neu klicken und das neue Experiment benennen. Geben Sie im neuen Datensatz RPAR in der Befehlszeile ein. Wählen Sie einen der STDDIFF-Parametersätze aus der Liste aus.

Um die STDDIFF-Pulssequenz auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche mit den drei Punkten in der Pulsprogrammzeile. Bevor Sie das SSTD-NMR-Experiment durchführen, kalibrieren Sie den Protonen-90-Grad-Hartpuls P1. Geben Sie pulsecal in der Befehlszeile ein und übernehmen Sie den Wert des 90-Grad-Pulses bei der höheren Leistung, also den kürzesten Puls.

Geben Sie die Werte für den kalibrierten Hard-Puls im Experiment mit dem Befehl getprosol ein. Stellen Sie anschließend die Länge des Sättigungspulses ein, geben Sie P13 ein und wählen Sie einen Wert von 50.000 Mikrosekunden. Stellen Sie die Form des selektiven Pulses ein, indem Sie zu „Power“ gehen und auf die Schaltfläche „Edit“ neben „Shape“ klicken. Navigieren Sie dann zu „Shape Pulsed 13“ und wählen Sie den Gauß-Puls aus.

Stellen Sie die Leistung des selektiven Pulses SP13 auf 50 Dezibel ein. Geben Sie NS ein und setzen Sie es auf acht, dann geben Sie DS ein und setzen Sie es auf vier. Um das SSTD-NMR-Experiment aufzunehmen, öffnen Sie das Protonen-NMR-Experiment, um zu überprüfen, wo sich das Signal befindet, das bestrahlt wird.

Suchen Sie dazu das Experiment im Softwarebrowser, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz und wählen Sie „In neuem Fenster anzeigen“. Die Selektivität der Bestrahlung muss präzise sein, um den Erfolg des Experiments zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass keine chemischen Korrekturen verwendet werden, da sonst die Bestrahlungsfrequenz falsch eingestellt werden kann.

Bewegen Sie die Cursorlinie in die Mitte des Signals, das bestrahlt werden soll, und notieren Sie die chemische Verschiebung in Teilen pro Million. Wählen Sie die spektrale Breite aus, die im Experiment verwendet wird. In diesem Fall befindet sich das zu bestrahlende Signal bei 2,17 Teilen pro Million und die verwendete spektrale Breite beträgt 1,46 Teile pro Million.

Als Nächstes wechseln Sie zum zuvor erstellten SSTD-NMR-Experiment und erstellen eine Liste mit den Anregungsfrequenzen, indem Sie FQ2LIST in der Befehlszeile eingeben und eine vorhandene Liste auswählen. Bearbeiten Sie die Liste der Anregungsfrequenzen gemäß der schriftlichen Anleitung. Speichern Sie die Liste unter einem neuen Namen.

Dann geben Sie FQ2LIST in der Befehlszeile ein und wählen die zuvor erstellte Liste aus. Um das Experiment auf das zu untersuchende Signal zu zentrieren, geben Sie O1P ein und wählen die chemische Verschiebung des Signals, das als Zentrum des Experiments bestrahlt wird. Geben Sie SW ein, um die spektrale Breite auszuwählen.

Wählen Sie den Wert für die inter-scan Relaxationsverzögerung D1. Stellen Sie sicher, dass dieser mindestens das ein- bis fünffache des T1-Werts des am langsamsten relaxierenden Protons beträgt. Geben Sie D1 ein und setzen Sie es auf 40 Sekunden. Legen Sie den ersten Wert für die Sättigungszeit fest, indem Sie D20 eingeben und auf 40 Sekunden setzen.

Bestimmen Sie die Empfängerempfindlichkeit automatisch, indem Sie RGA eingeben. Erstellen Sie das nächste Experiment, indem Sie IEXPNO eingeben. Geben Sie D20 ein und wählen Sie eine Sättigungszeit von 20 Sekunden.

Dann geben Sie RGA ein, um RG automatisch zu bestimmen. Wiederholen Sie den letzten Schritt für D20 gleich 10, fünf, 2,5, 1,25, 0,625 und 0,3 Sekunden. Sobald alle Experimente erstellt wurden, öffnen Sie das erste Experiment und geben in der Befehlszeile multizg ein, wobei Sie die Anzahl der Experimente angeben. Um die Daten zu verarbeiten, öffnen Sie die Prozessnummer eins aus dem Satz von Experimenten mit der längeren Sättigungszeit.

Geben Sie in der Befehlszeile LB ein und stellen Sie den Wert auf 1,5. Geben Sie in der Befehlszeile EFP ein und verarbeiten Sie die FID-Nummer gleich eins, Prozessnummer gleich zwei. Korrigieren Sie die Phase des Experiments, indem Sie den interaktiven Phasenkorrekturknopf anklicken, und speichern Sie es als Zwei-G-Experiment, anschließend speichern und beenden.

Geben Sie in der Befehlszeile REP 1 ein, um zum Prozess Nummer eins zu wechseln. Geben Sie in der Befehlszeile EFP und Prozess-FID-Nummer gleich zwei, In-Prozess-Nummer gleich drei ein. Geben Sie anschließend in der Befehlszeile Punkt MD und dann REP 2 ein, um ein Mehrfachanzeigefenster mit den Spektren der Prozesse zwei und drei anzuzeigen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Delta-Zeichen, um die Differenzspektren zu berechnen und sie im Verfahrensschritt vier zu speichern. Schließen Sie danach das Mehrfach-Anzeigefenster. Wählen Sie einen Integrationsbereich vom Signal auf der linken Seite aus.

Integrieren Sie immer denselben Bereich im Prozess Nummer drei und Prozess Nummer vier. Gehen Sie nach der Integration in jedem Experiment zur Registerkarte „Integrale“ und kopieren Sie den absoluten Wert des Integrals. Wiederholen Sie den Vorgang für die übrigen Experimente mit verschiedenen Sättigungstypen.

Um die kinetischen Parameter zu erhalten, tragen Sie zunächst die erhaltenen SSTD-Parameterwerte gegen die Sättigungszeit auf. Setzen Sie die Datenanalyse wie im Textprotokoll beschrieben fort. Die behinderte Rotation um die Amidbindung differenziert beide Methylgruppen in zwei Signale in den Protonen-NMR-Spektren.

Die Spin-Sättigung der Methylgruppe bei 2,17 Teilen pro Million führt zum Verschwinden ihres Signals in der Protonen-NMR. Durch die Sättigung der Methylgruppe B bei 2,17 Teilen pro Million kann die Übertragung der Sättigung auf die Methylgruppe A bei 2,16 Teilen pro Million aufgrund der internen Rotation beobachtet werden, und zwar durch eine Abnahme der Protonenintensität im Signal bei 2,61 Teilen pro Million. Der SSTD-Parameterfaktor wird berechnet, indem der Wert des Integrals der Methylgruppe A im Differenzspektrum durch den Wert des Integrals der Methylgruppe A im ursprünglichen Spektrum dividiert wird.

Für eine bestimmte Temperatur ergaben die Auftragungen der Werte des SSTD-Parameters gegen die Sättigungszeit exponentielle Kurven. Die Anpassung der Kurven liefert die Geschwindigkeitskonstante und die Relaxationszeit des Protons des gemessenen Signals. Auftragungen des SSTD-Parameters gegen die Sättigungszeit bei verschiedenen Temperaturen ergaben entsprechende Geschwindigkeitskonstanten und Relaxationszeiten.

Die Eyring-Gleichung wurde verwendet, um die thermodynamischen Parameter zu berechnen. Die mit der SSTD-NMR erhaltenen Werte stehen in ausgezeichneter Übereinstimmung mit Daten, die mithilfe anderer Methoden berichtet wurden. Sobald ein Satz von Experimenten bei einer bestimmten Temperatur beherrscht ist, kann die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstanten und einer Relaxationszeit in etwa drei Stunden durchgeführt werden, sofern dies ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Wahl der Lösungsmittel und Temperaturen entscheidend ist, um gute Ergebnisse zu erzielen, da sich die chemischen Austauschraten signifikant mit diesen Parametern ändern können. Mithilfe dieses Verfahrens können auch andere Prozesse wie der kinetische weiche intermolekulare chemische Austausch und der Ligninaustausch untersucht werden, und darüber hinaus könnte die Methode auf Mehrstellen-Austausch und ungleiche Populationen erweitert werden, sofern eine geeignete Anpassung der Gleichung vorgenommen wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Spin-Sättigungs-Transfer-Differenz-Experimente durchführt und wie man Magnetisierungstransfer verwendet, um kinetische und thermodynamische Parameter bei Molekülen zu erhalten, die chemischem Austausch unterliegen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Chemikalien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Sicherheitsbrille und Handschuhe stets getroffen werden sollten, während die Probenzubereitung in diesem Verfahren durchgeführt wird.