Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Visual-Chemotaxis-Assays sind für ein besseres Verständnis, wie eukaryotische Zellen steuern chemoattractant vermittelten Richtungszellmigration. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden für: 1) in Echtzeit, hochauflösende Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays und 2) gleichzeitig die chemische Lockstoffe Gradienten zu visualisieren und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in Neutrophilen wie HL60-Zellen signalisiert.

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, die gleichzeitige Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays oder die Visualisierung der verschiedenen Signalereignisse einer einzelnen chemosteuernden Zelle zu ermöglichen. Die Zellbiologen von Overdeck haben verschiedene Ansätze entwickelt, um das Chemotaxis-Verhalten der Zellen zu quantifizieren. Bis vor kurzem waren wir in der Lage, Schlüsselfragen im Bereich der Chemotaxis zu beantworten, wie z. B. die gleichzeitige Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays.

Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, das Prinzip der Mikrofluidik anzuwenden, um hochreproduzierbare und zuverlässige Inhaltsstoffe für mehrere gleichzeitige Chemotaxis-Assays mit hoher Auflösung in Echtzeit zu erzeugen. Das Verfahren wird von Dr. Xi Wen, einem Postdoc aus unserem Labor, demonstriert. Um die Halterung zu montieren, verwenden Sie zunächst die Hebel, um die Basis in die vertikale Position zu bringen, so dass die Hebel in Richtung des Benutzers gekippt werden können.

Bestreichen Sie dann die Oberfläche des 41-Millimeter-Glases kurz mit 70 % Ethanol und entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einem Tuch. Setzen Sie das Glas in den Haltersockel ein und legen Sie einen BSA-beschichteten, 2 Millimeter dicken, quadratischen Abdeckschirm auf das Glas. Setzen Sie dann den kleinen O-Ring in die Unterseite des Wafergehäuses ein und montieren Sie das Wafergehäuse in die Halterungsbasis, mit dem elliptischen Loch an der Rückseite des Geräts.

Ziehen Sie die innere Ebene der Halterungsbasis nach vorne in die horizontale Position, um das Wafergehäuse zu verriegeln. Verwenden Sie einen Staubwedel, um Schmutz aus dem Inneren des Wafergehäuses zu blasen. Geben Sie dann 4 Milliliter RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 0,1 % BSA, in das Gehäuse.

Montieren Sie nun den BSA-beschichteten Chip für die Zellmobilitätsanalyse in der Mitte des Wafergehäuses, wobei die strukturelle Fläche mit dem Glas in Kontakt und die Positionierungsmarkierung auf der Rückseite ist. Setzen Sie die beiden Vorsprünge der Gummidichtung in die Löcher ein, um die Dichtung an der Unterseite der Waferklemme zu befestigen, und montieren Sie den großen O-Ring an der Oberseite des Wafergehäuses. Montieren Sie dann die Waferklemme mit dem Sensorloch an der Rückseite und ziehen Sie den äußeren Hebel des Gehäusebodens nach vorne in die horizontale Position, um die Waferklemme zu verriegeln.

Wenn der Halter zusammengebaut ist, setzen Sie den Boden des Halters auf einen Leuchtkasten, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen befinden. Entfernen Sie dann die Abdeckung, übertragen Sie die Baugruppe auf die Platte oben auf der Einheit des Zellmobilitätsanalysegeräts und befestigen Sie den Sensorblock an der Halterung. Um den Zellmobilitätsassay durchzuführen, suspendieren wir zunächst differenzierte HL60-Zellen in BSA-supplementiertem RPMI 1640-Medium und eine Konzentration von zwei mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter.

Verbinden Sie dann die Geräteeinheit zur Analyse der Zellmobilität für die Bildaufnahme mit dem Computer, und schalten Sie beide Geräte ein. Öffnen Sie als Nächstes die Software für das Zellmobilitätsanalysegerät. Verwenden Sie im Bedienfeld für das Kamerabild die horizontalen und vertikalen Linien, um die Position des Halters in Echtzeit anzupassen, und zentrieren Sie das Gerät im Kamerabildfenster.

Wählen Sie dann Kanal Eins, um die Kamera auf den ausgewählten Kanal zu bewegen, und verwenden Sie "Nach links" oder "Nach rechts", um die X-Koordinate der Kamera anzupassen und das Ansichtsfeld horizontal zu zentrieren. Um das Bild vertikal an die Mitte des Bildschirms anzupassen, drehen Sie den Positionsknopf auf der Vorderseite des Geräts zur Analyse der Zellmobilität. Stellen Sie auf dem Bedienfeld der Heizung die Temperatur des Halters auf 37 Grad Celsius und die Temperatur der Platte auf 39 Grad Celsius ein.

Um die Temperatur mit dem an die Halterung angeschlossenen Temperatursensor zu steuern, klicken Sie auf Heizen, um die Heizung zu starten, und dann auf Halter. Geben Sie auf dem Aufnahmefeld 15 Sekunden für das Intervall und 30 Minuten für die Zeit zum Festlegen der Intervalle bzw. der Dauer des Chemotaxis-Assays ein. Wählen Sie aus Sicherheitsgründen die Heizung aus am Ende des Schießkastens.

Speichern Sie dann die Datei, geben Sie die Einzelheiten des Experiments in das Memofenster ein, und bestätigen Sie, dass das Gerät in allen Kanälen zentriert wurde. Entfernen Sie nun den gesamten Puffer aus dem Halter und acht Mikroliter Puffer aus der dritten Vertiefung von der Oberseite des ersten Kanals. Injizieren Sie mit einer Spritze zwei Mikroliter Zellen in die zweite Vertiefung im selben Kanal, während Sie den Bildschirm in Echtzeit überwachen, um die Zellzahl und den Zellfluss während der Injektion zu kontrollieren.

Wenn die Zellen ausgerichtet sind, geben Sie sofort die acht Mikroliter Puffer wieder in die Vertiefung und wiederholen Sie die Zellinjektion in den Kanälen zwei bis sechs, wie gerade gezeigt. Nachdem alle Zellen hinzugefügt wurden, geben Sie zwei Milliliter Puffer zurück in den Halter und geben Sie einen Mikroliter des Chemolockstoffs in die dritte Vertiefung von oben in die entsprechenden Kanäle. Starten Sie abschließend die Bildaufnahme.

In diesem repräsentativen Experiment begannen die HL60-Zellen unmittelbar nach der Injektion des Chemolockstoffs mit der Chemotaxierung auf einem geraden Weg und setzten die Chemotaxierung während der gesamten 60 Minuten des Assays fort, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Gradientenstabilitätssimulation. Die Verfolgung des Reisepfads und der Morphologie der Zellen ermöglicht die quantitative Messung und den anschließenden Vergleich des Chemotaxis-Verhaltens unter Verwendung eines Chemotaxis-Index, der die Gesamtweglänge, die Richtung, die Geschwindigkeit und die Rundheit der Zellen umfasst. Die Anwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs in Verbindung mit dem Chemoattraktor ermöglicht die Herstellung einer linearen Beziehung zwischen der Konzentration des Chemolockstoffs und der überwachten Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs.

Darüber hinaus vermitteln die HL60-Zellen als Reaktion auf eine gleichmäßig angewendete Chemoattraktstoffstimulation eine robuste Membrantranslokation der GFP-Taktproteinkinase D1.In einem Chemoattraktstoffgradienten, die HL60-Zellen rekrutieren die Kinase aktiv an der Rückseite der Vorderkante. Einmal gemeistert, kann dieser Vorgang in 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Anweisungen des Herstellers auf der Halterbaugruppe genau zu befolgen und die Zellinjektion zu überwachen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Chemotaxis, um die Möglichkeit mehrerer Chemotaxis-Assays zu erforschen, wie z. B. eines Monogenismus, eines Dictyostiliums oder anderer Arten von Säugetierzellsystemen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Gerät zusammenbauen, simultane Chemotaxis-Assays durchführen oder gleichzeitig mehrere Signalereignisse in chemosteuernden Zellen visualisieren