Name: In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Lernen Sie die EdU-Färbung zur Markierung mitochondrialer DNA-Replikation in Drosophila-Ovarien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Biogenese und Vererbungsmechanismen bei guter Gewebeerhaltung.

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Wir danken K. Delaney für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Intramural Program des National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) unterstützt.

1. Gewebeentnahme und Dissection <ol><li> In jedem Fläschchen mit Trockenhefe, Kultur 10 erwachsene Frau fliegt mit 10 Männern für 2-3 Tage. Hinweis: Die Aufrechterhaltung gut genährten weiblichen Fliegen wird die Qualität und die Ausbeute an Ovar Produktion und erleichtern Dissektion verbessern. </li><li> Anesthetize das Weibchen auf einem Kohlendioxid fliegt (CO 2) fliegen Pad. </li><li> Unter dem Stereoskop, setzen einige Tropfen RT - Medium (Schneiders Drosophila - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt) auf einem Sezieren Pad. Führen Sie alle Dissektion Verfahren in dem Medium das Gewebe am Leben und gesund zu halten. </li><li> Schnappen Sie sich ein gemästet Frau mit scharfen feinen Nase Zange an ihrem unteren Thorax fliegen. Verwenden Sie eine andere Gruppe von Zange am äußersten hinteren der Fliege sanft zu zerren, bis die Gewebe im Unterleib ausgesetzt sind. Lösen Sie die beiden Ovarien aus anderen Geweben (zB Innereien). Hinweis: Jeder Ovar zeigt eine undurchsichtige Struktur, die compose istd von 16-20 befestigt Ovariolen. </li><li> Um das Eindringen von Reagenzien zu verbessern, öffnen Sie die Ovarien von ihnen auseinander und vorbei an den Spitzen der Zange zwischen jedem Ovariole ein paar Mal ziehen. Halten Sie die Ovariolen innerhalb eines Eierstocks verbunden Verlust von Gewebe während der folgenden Verfahren zu minimieren. </li><li> Übertragen Sie die Ovarien sofort auf eine 1,5 - ml - Mikroröhrchen mit 500 ul Schneiders Drosophila - Medium mit 10% FBS. </li><li> Wiederholen Sie die Präparation und sammeln 10-15 Ovarien in jedem Reaktionsgefäß. </li></ol> 2. EdU Labeling <ol><li> Saugen Sie das Medium in jedem Rohr, und ersetzen mit 500 ul Schneiders Drosophila - Medium mit 10% FBS , enthaltend 7 uM Aphidicolin. Hinweis: Aphidicolin verwendet wird Kern - DNA - Synthese durch Hemmung der DNA - Polymerase α ohne Beeinträchtigung der mtDNA - Replikation 7, 12 zu blockieren. Es ist möglich, die Aphidicolin-Konzentration auf bis zu erhöhenbis 70 um bessere Hemmung zu erzielen. Die Stammlösung von 3-30 mM Aphidicolin in DMSO kann für bis zu 6 Wochen bei -20 ° C im Dunkeln gelagert werden. </li><li> Damit die Ovarien gesund, sicherzustellen, dass sie unter Lösungen eingetaucht werden, während das Medium verändert. Verwenden Schneiders Drosophila - Medium mit 10% FBS bis Schritt 2.6. </li><li> Inkubieren Ovarien 3 h bei RT auf einem Benchtop-Rocker mit sanfter Drehung. <ol><li> Zur medikamentösen Therapie, zum Beispiel mitochondrialen Entkoppler carbonyl Cyanid 4-trifluormethoxy phenylhydrazons (FCCP), fügen Sie die entsprechende Konzentration des Wirkstoffs (zB 10 &amp; mgr; M FCCP) in das Medium nach 2 h von Aphidicolin - Behandlung. Nach weiteren 1 h inkubiert. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Medium, das Aphidicolin mit oder ohne Arzneimittel. Kurz spülen Sie die Ovarien mit Medium (Aphidicolin nicht notwendig ist) zweimal. </li><li> 1 ml Medium, das 10 &amp; mgr; M EdU und 7 uM Aphidicolin und weiter incubatinbei RT g für 2 Std. Lagern Sie die 10 mM EdU Stammlösung (in DMSO) bei -20 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Medium, das EdU und Aphidicolin. Waschen mit Medium (ohne Aphidicolin) zweimal für jeweils 3 min. </li></ol> 3. Gewebefixierung und Permeabilisierungs <ol><li> Bereiten einer 4% Paraformaldehydlösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4). Hinweis: Wir verwendeten kommerziell erhältlichen Paraformaldehyd gespeichert in vorgeritzten Ampullen. Öffnen Sie eine neue Ampulle und mit Wasser auf 4% vor dem Gebrauch. ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig; es sollte mit der Haut und Augenschutz in einem Abzug gehandhabt werden. </li><li> Fix Ovarien mit 4% Paraformaldehyd für 20 min bei RT unter leichtem Rotation. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen Ovarien zweimal in 1 ml 3% BSA in PBS für jeweils 5 min. </li><li> Um das Gewebe durchdringbar zu machen, entfernen Sie die Waschlösung und 1 ml 0,5% Triton X-100 in PBS. 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Entfernen Sie die Permeabilisierung Lösung und waschen zweimal in 1 mlvon 3% BSA in PBS. </li></ol> 4. EdU Erkennung Hinweis: EdU Nachweis beruht auf &quot;Klick&quot; Chemie, eine Cu (I) -katalysierte [3 + 2] -Cycloaddition 13, die fluoreszierende Azide an die terminalen Alkin Gruppe EdU hinzufügt und das fluoreszierende Molekül zum anschließenden Nachweis unterzogen. Da Cu (I), die leicht an die nicht-katalytische Cu (II) -Spezies oxidiert wird, ist erforderlich , um die Reaktion zu katalysieren, wird empfohlen , die Cu (II) -sulfat in situ zu reduzieren , Cu (I) zu erhalten. Das heißt, Cu (II) -sulfat in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Ascorbinsäure, verwendet wird (hierin die &quot;Puffer additive&quot;), Kupfer (I) zu erzeugen. <ol><li> Vor dem Versuch, bereiten Sie die Arbeitslösung des Alexa Fluor Azid (Alexa Fluor 488 Azid, Alexa Fluor 555 Azid oder andere, je nach dem bevorzugten Fluorophore, die als &quot;Farbstoff Azid&quot; im Folgenden genannt werden), EDU Reaktionspuffer und EdU Puffer-Zusatz nach HerstellerAnleitung. <ol><li> Die Rekonstitution der Farbstoff Azid in 70 ul DMSO. Bewahren Sie die Arbeitslösung bei -20 ° C für bis zu 1 Jahr. </li><li> Bereiten Sie frische EdU Reaktionspuffer, die 10-fach EdU Reaktionspuffer mit entsalztem Wasser durch Verdünnen. Hinweis: Nach dem Gebrauch speichern alle verbleibenden 1x Lösung bei 4 ° C. Die 1x Lösung ist stabil für bis zu 6 Monate. </li><li> Machen Sie eine 10x Stammlösung des EdU Puffer-Zusatz durch vollständig um das Pulver in 2 ml entionisiertem Wasser gelöst. Hinweis: Diese Stammlösung für bis zu 1 Jahr bei -20 ° C stabil ist. Wenn die Lösung eine braune Farbe entwickelt, wurde abgebaut und verworfen werden sollte. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die EdU Reaktion Cocktail frisch jedes Mal, und innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass die Reaktionskomponenten in den gleichen Verhältnissen gehalten. <ol><li> (Hergestellt in Schritt 4.1.3) 1:10 in entsalztem Wasser Make frisch 1x EdU Zusatzlösung Puffer durch die 10x Stammlösung verdünnt wird. Verwenden Sie dieses sÖSUNG am selben Tag. </li><li> Vorbereitung 1 ml EdU Reaktionscocktail , indem die folgenden Bestandteile , um die Kombination von : 860 &amp; mgr; l 1x EdU Reaktionspuffer, 40 ul CuSO 4, 2,5 &amp; mgr; l Farbstoff Azid, 100 ul 1x EdU Pufferadditiv. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Bestandteile zugegeben werden, um eine optimale Leistung zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die PBS mit 3% BSA und 0,5 ml der EDU Reaktion Cocktail in jedes Röhrchen. bei RT inkubieren für 30 min unter leichtem Rotation. Halten Sie die Proben vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen Sie die EdU Reaktion Cocktail und waschen Sie einmal mit 1 ml 3% BSA in PBS. </li><li> Waschen Sie die Proben einmal mit 1 ml PBS. </li></ol> 5. Antikörpermarkierung Hinweis: Führen Sie Antikörpermarkierung nach EdU Färbung. Wenn keine zusätzliche Färbung gewünscht wird, kann man direkt an der Montage und Abbildungs ​​fortzufahren. Es ist wichtig, dass die Proben von Licht in allen folgenden Verfahren geschützt werden. <ol><li> Entfernen Sie die Waschlösung. Blockieren die Ovarien in 1 ml Blockierungslösung, enthaltend 0,2% BSA und 0,1% Triton X-100 in PBS für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Blockierungslösung und ersetzen mit dem primären Antikörper verdünnt in Blockierungslösung (zB Maus ATP - Synthase - Untereinheit α - Antikörper, 1: 1000 Verdünnung). Inkubieren im Dunkeln bei 4 ° CO / N. </li><li> Waschen der Proben mit 1 ml Blockierungslösung 3-mal, jeweils 10 Minuten Zeit. Um den Hintergrund zu minimieren, waschen Sie noch zwei Mal für jeweils 30 min. Entfernen Sie die Blockierungslösung. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper , verdünnt in Blockierungslösung (beispielsweise Ziegen - anti-Maus - Alexa Fluor 568 sekundärem Antikörper, 1: 200 Verdünnung) für 2 h bei RT. Hinweis: Verwenden Sie eine andere Farbe als das zu EdU gekoppelt. </li><li> Wiederholen Sie die Waschschritte durchgeführt in Schritt 5.3. </li><li> Spülen Sie mit 1 ml PBS einmal entfernen, um die Reinigungsmittel. </li></ol> 6. Montage und Imaging <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig alle PBS und immediately decken Ovarien mit 50 ul Medium Montage (mit oder ohne DAPI). Hinweis: Verwenden Sie einen Montagemedium, das härtet nicht aus, während die Ovariolen voneinander getrennt werden. Ovarien kann für bis zu einer Woche bei 4 ° C in Befestigungsmedium gespeichert werden. </li><li> Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze und es verwenden, Ovarien sorgfältig auf einen Objektträger übertragen werden. </li><li> Völlig getrennt jeder Ovariole mit scharfen feinen Nase Zange unter dem Stereomikroskop. Entfernen Sie die Verbindungsgewebe am hinteren Ende und Stufe 14 oder reife Eizelle Kammern. Die jungen Eikammern sind am vorderen Ende und transparent. </li><li> Ausrichten der Eikammern mit einer Pinzette, so daß sie miteinander nicht überlappen. </li><li> ein # 1.5 Deckglas auf der Oberseite der Proben langsam senken. Ermöglichen die Befestigungsmittel für mehrere Stunden bei RT zu polymerisieren. Siegel mit transparentem Nagellack. </li><li> Bild schiebt den nächsten Tag oder bei 4 ° C vor der Bildgebung. </li><li> Visualisieren unter einem konfokalen mikop mit einem 63X Ölimmersionsobjektiv. Erfassen Sie dreidimensionale z-Stapel Bilder. Hinweis: Es gibt starke EdU Signal in reifere Eikammern und Hintergrundfluoreszenz in der epithelialen Mantel. Wenn EdU Kennzeichnung in einem bestimmten Germarium untersuchen, sollte man germariums vermeiden, die durch oder in der Nähe zu anderen Geweben überlappen oder später stufigen Eikammern. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

EdU Kennzeichnung ist ein neuartiges und effizientes Verfahren der DNA-Synthese in proliferierenden Zellen zu erfassen, die sich auf den Einbau und Färbung von Nukleosidanaloga in neu synthetisierte DNA basiert. Dieses Verfahren ist besser als die BrdU-Markierungsverfahren, dass es schneller und sehr empfindlich. Noch wichtiger ist , ermöglicht es für eine gute strukturelle Erhaltung und effiziente EDU-Farbstoffpenetration von 9 Gewebe ganze Montage, 10. Historisch gesehen , als eine überlegene Alternative zu BrdU - Markierung, wurde während der S-Phase des Zellkern - DNA - Replikation EdU Markierung verwendet für das Studium Zellzyklus. Aphidicolin ist ein Inhibitor der DNA - Polymerase α, die für die Kern - DNA - Replikation in der S-Phase 12 15 der Haupt Polymerase ist. mtDNA-Replikation wird durch DNA-Polymerase-γ durchgeführt wird, die unempfindlich ist Behandlung Aphidicolin. Daher Behandlung mit Aphidicolin vor und während der EdU Inkubation deutlich hemmte EdU Einbau in die Kern-DNA. Es solltezu beachten, dass Aphidicolin für mehrere Wochen stabil sein kann, wenn in geeigneter Weise gespeichert, und die Wirksamkeit von Aphidicolin in Kern-DNA-Replikation war variabel Hemmung in unseren Händen. Die Ovariolen oder Eikammern mit starken sollten nukleare DNA-Markierung ausgeschlossen werden von der weiteren Datenanalysen. mtDNA Replikation kann leicht als puncta im Zytoplasma sichtbar gemacht werden, die auch eine einfache Möglichkeit bietet, indem die Anzahl von EdU puncta, normiert auf das Gesamtvolumen des Zytoplasmas das Niveau der mtDNA-Replikation zu quantifizieren. Imaging-Software kann angewendet werden, um automatisch EdU puncta in mikroskopischen Bildern zu identifizieren, die für die rechnerische Analysen großer Datenmengen besonders nützlich ist. Allerdings sollten Vorkehrungen getroffen werden, da die unvollständige Hemmung der Zellkern-DNA-Replikation zu der EDU Einbau in verschiedene Loci auf dem Chromosom und zeigen als puncta innerhalb des Kerns führen kann. Auch in anderen Fällen, die Aufnahme der Intensität von EdU in replicating mtDNA können schwach sein, während der Hintergrund und Rauschen hoch sein könnte. Daher sollten die einzelnen Parameter für die automatische Bildanalyse genau definiert. Es wird auch empfohlen, dass die Bilder sollten mit geschulten Augen, um sicherzustellen, überprüft werden, dass die richtige EdU puncta identifiziert werden. Visualisierung von neu synthetisierten mtDNA während Drosophila Oogenese bietet die Möglichkeit zu untersuchen , wie mtDNA Replikation unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen reguliert wird, indem das Experiment in Fliegen auf eine Vielzahl von pharmakologischen und genetischen Störungen unterworfen , durchgeführt wird . In einer früheren Studie wurde EdU Inkorporationstest in einem mtDNA mutierten Drosophila mt ausgeführt: COI T300I 11. Darüber hinaus können die mitochondrialen Membranpotentials zu unterbrechen, wurden Ovarien mit verschiedenen Konzentrationen von mitochondrialen Entkoppler FCCP behandelt oder 2,4-Dinitrophenol (DNP) vor EdU Inkorporation. In Abhängigkeit von den experimentellen Zweckenund Drogen Eigenschaften, verschiedene Methoden könnte für eine effektive Lieferung angenommen. Für erwachsene Fliegen, Medikamente können als Dampf (zB Ethanol und Kokain) 16,17 oder Drogen präsentiert werden können in das Abdomen injiziert, wo es schnell im ganzen Körper diffundiert 18. Die am weitesten verbreitete Praxis besteht darin, dass Medikamente zur Fliege Lebensmittel oder einer Saccharose / arzneimittel gesättigtem Filterpapier zugesetzt werden. Zum Beispiel kann der Inhibitor von Mikrotubuli Anordnung, Colchicin, wurde 2-3 Tage vor Ovar dissection 19 fliegt zugeführt. Daher ist es wichtig, die Arzneimittelverabreichungsmethode und wählen geeigneten Konzentrationen zu bewerten. Um die erfolgreiche Abbildung von mtDNA - Replikation in Drosophila Ovarien, mehrere wichtige Schritte sicherstellen müssen sorgfältig ausgeführt. Foremost, bei der Präparation und EdU Inkorporation die Lebensfähigkeit und die Gesundheit der Ovarien zu erhalten ist wichtig (die Schritte 1 und 2). Die Drosophila Mediums Schneider mit FBS muss RT erwärmt werdenvor Gebrauch. Man sollte einen direkten Kontakt zwischen den Eikammern und Sezieren Werkzeuge oder Pipettenspitzen zu minimieren. Die Ovarien sollten unter Lösungen für alle Zeiten eingetaucht werden, um Austrocknung zu vermeiden. führen die Gewebe Falsche Handhabung leicht in Ohnmacht fallen oder keine Fluoreszenzsignale. Während des Gewebes Montageschritt sollte Ovariolen voneinander getrennt werden, und verteilt auf dem Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Eikammern nicht übereinander gestapelt werden. Wir haben festgestellt, dass die Eikammern über Stufe 14 wenig EdU Einbau angezeigt. Zusätzlich wegen der großen Größe, die Eier späten Stadium Kammern verursachen oft die benachbarten jüngeren Eikammern unscharf zu sein. Daher empfiehlt es sich, dass die späten Stadium Eikammern verworfen werden. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Markierung von mtDNA in Drosophila erwachsenen Ovarien zu replizieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache Quantifizierung von mtDNA-Replikation unter verschiedenen genetischen und pharmakologischen Störungen,und wird nützlich sein, zum Präparieren Mechanismen entwicklungs mitochondrialen Biogenese und mtDNA Erbe zugrunde liegen.

Neben dem Kerngenom, jede eukaryotische Zelle enthält auch Tausende von Kopien von kleinen kreisförmigen DNA in der mitochondrialen Matrix. Während mitochondriale DNA (mtDNA) wesentliche Untereinheiten der Elektronentransportkette kodiert, die Mehrheit der mitochondrialen Proteoms, einschließlich aller Faktoren, die für die Replikation und Transkription von mtDNA durch die nukleare Genom kodiert. Im Gegensatz zum Kerngenom, die Mendelschen Vererbungsgesetze folgt, wird das Tier mitochondriale Genom ausschließlich über die mütterliche Linie vererbt. Daher verstehen, wie mtDNA stark vermehrt wird und von einer Generation zur nächsten durch die weibliche Eizelle übertragen wird, ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings gibt es anhaltende Debatte darüber, wie mtDNA-Replikation in der weiblichen Keimbahn geregelt wird. Darüber hinaus schlägt die weithin akzeptierte mtDNA Engpass Theorie für mtDNA Übertragung, dass die Bevölkerung von mtDNA in Urkeimzellen auf eine relativ kleine Zahl unterabgetastet during Entwicklung 1 2. Es bedeutet auch, dass die mtDNA-Replikation ist zeitlich und räumlich reguliert während der Oogenese. Daher wird die in situ Nachweis von mtDNA - Replikation während der Entwicklung der Keimbahn das Verständnis des Mechanismus der mtDNA Vererbungs erleichtern. Drosophila oogenesis ein genetisch manipulierbaren System mtDNA - Replikation und Übertragung zu studieren. In jeder der beiden Drosophila Ovarien, gibt es 16-20 unabhängige Strings Eikammern genannt Ovariolen 3, die die Funktionseinheiten der Eierproduktion sind (siehe 1A). Jede Ovariole enthält eine progressive lineare Organisation der Oogenese, wo die vordere Spitze einer Struktur namens Germarium zusammengesetzt ist. Die Germarium wird weiter in vier Bereiche unterteilt, die Keimzellen an unterschiedlichen Entwicklungsstadien enthalten. In der Region 1, gehen Keimbahn-Stammzellen durch asymmetrische Teilung Tochterzellen als c bekannt zu produzierenystoblasts. Region 2a enthält die cystoblasts, die ihre endgültige Teilung abgeschlossen haben. Cystoblasts laufen vier Runden der Division produziert 16-Zellgruppen. Die 16 Zellen bleiben zytoplasmatische Brücken miteinander verbunden sind Kanäle genannt Ring. Nur einer der Zellen verpflichtet sich zur Differenzierung der Eizelle, während die anderen 15 als polyploid Nährzellen entwickeln. Eine wesentliche cytoplasmatische Struktur, wie fusome bekannt ist , wird vorgeschlagen , mit der Bildung von Ringkanälen zu erleichtern, die Zyste Polarität und die Krankenschwester Zell-Wechselwirkungen Oozyte 4,5 bestimmen. Da die Zysten in Richtung Bereich 2b bewegen, erstrecken sich die Zyste Strukturen, die die gesamte Breite des Germarium, und sich mehr mit Follikel-Zellen in Verbindung gebracht. Die Germarium Strukturen enden mit Bereich 3 des ersten Knospung Eikammer enthält. Anschließend werden die Eikammern am hinteren Ende des Germarium zusammengebaut, das in 14 morphologisch unterschiedlichen Phasen durch die Ovariole fortzuschreiten. Das Wachstum der Eizelle, hängt von den Nährzellen, which Transportproteine, mRNA und endomembrane Strukturen (zB Golgi) über die Ringkanäle in die Eizelle. Während Drosophila oogenesis wurde festgestellt , dass ein Bruchteil der Mitochondrien in jeder 16-Zell - Zyste wurden mit dem fusome verbunden sind , bewegt durch die Ringkanäle und wurden in die einzelnen Eizelle in einer großen Masse geliefert genannt Balbiani Körper 6. Dieses Phänomen wurde vorgeschlagen, um die Qualitätskontrolle der mitochondrialen Vererbung durch weiblichen Ovarien beizutragen. Nachweis von mtDNA-Synthese beruht auf dem Einbau von markierten DNA-Vorläufer in die zelluläre DNA. Traditionell wurde ein Nukleosid - Analogon von Thymidin - 5-bromo-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) verwendet , die 7,8 mtDNA - Replikation in Gewebekulturzellen zu etikettieren. Allerdings ist die Antikörper-basierte BrdU-Markierung weist mehrere Einschränkungen, insbesondere für ganze-mount Gewebefärbung. Ein wesentlicher Nachteil von BrdU-Markierung ist, dass es DNA-Denaturierung erfordert aussetzendie BrdU-Epitop, so dass es durch die anti-BrdU-Antikörper nachgewiesen werden. Die Probe wurde behandelt unter rauen denaturierenden Bedingungen wie Chemikalien (beispielsweise Salzsäure oder Mischungen aus Methanol und Essigsäure), Wärme oder Verdau mit DNase werden, die die Struktur der Probe stören könnten und erschweren die folgenden Färbeverfahren 9, 10. Hier wird eine alternative Thymidin - Analogon 5-ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EDU) wird verwendet , um die Replikation von mitochondrialer DNA in Drosophila erwachsenen Ovarien zu etikettieren. Diese Methode ist schneller und hochempfindlich. EdU wird leicht in die zelluläre DNA während der DNA-Replikation eingebaut. Die folgende Erkennung auf einem &quot;Klick&quot; Reaktion basiert, ein Cu (I) -katalysierte kovalente Reaktion zwischen dem terminalen Alkin - Gruppe und einem fluoreszierenden Azid 10. Da die Reaktion nicht die Denaturierung der Probe erfordern, ermöglicht es eine gute strukturelle Erhaltung. Ferner ist die Größe der Farbstoff einzide ist nur 1/500 derjenigen eines Antikörpermoleküls 10, die eine schnelle und effiziente Eindringen von Vollmontage Gewebe ermöglicht. Wir haben diese Methode verwendet , um mtDNA - Replikation während der Drosophila oogenesis und fand eine verblüffende räumliche Muster in der Germarium Region von Drosophila Ovar 11, die uns erkennen , führen eine Replikationsabhängigen mtDNA selektiven Vererbungsmechanismus vorzuschlagen. Wir präsentieren hier ein ausführliches Protokoll über EdU Kennzeichnung von mtDNA - Replikation in Drosophila Ovarien. Um die Anwendung des Protokolls zeigen , testeten wir auch die mtDNA - Replikation in einer mtDNA mutanten Drosophila (mt: CoI T300I) 11, sowie mit diversen Behandlung mitochondrialer Entkoppler, der die mitochondriale Membranpotential abzuleiten und potenziell mtDNA - Replikation stören.

<table><tbody><tr><td>Schneider" s Drosophila medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Paar Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Aliquot nach dem Auflösen in DMSO. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und Einfrieren. Vor Licht schützen. Kann innerhalb von 6 Wochen nach dem Auflösen verwendet werden.</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16 % EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Formaldehyd ist giftig und sollte in einem Abzug mit Haut- und Augenschutz gehandhabt werden.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td>Sigma A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 Azid, EdU-Reaktionspuffer und Edu-Puffer-Additiv sind enthalten</td></tr><tr><td>Maus-ATP-Synthase-Untereinheit und Alpha-Antikörper, (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus Hts Antikörper (Klon RC)</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 568 Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser, #1,5 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Elf</td><td></td><td>Viele der in Nagellacken verwendeten Pigmente sind fluoreszierend und laugen in Proben ein. Es sollte nur klarer Nagellack verwendet werden.</td></tr></tbody></table>

in situ labeling der mitochondrialen dna - replikation in drosophila adult ovarien von edu anfärben

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Das mitochondriale Genom wird ausschließlich über die mütterliche Linie vererbt. Von grundlegender Bedeutung ist das Verständnis, wie das Mitochondrium und sein Genom durch die weibliche Eizelle vermehrt und von einer Generation zur nächsten weitergegeben werden. Aufgrund der genetischen Rückverfolgbarkeit und der eleganten, geordneten Einfachheit, mit der die Eizellentwicklung abläuft, ist die Drosophila-Oogenese zu einem unschätzbaren System für mitochondriale Studien geworden. Eine EdU-Markierungsmethode (5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin) wurde verwendet, um die Replikation der mitochondrialen DNA (mtDNA) in den Eierstöcken von Drosophila nachzuweisen. Diese Methode ist der BrdU-Markierungsmethode (5-Brom-2'-Desoxyuridin) insofern überlegen, als sie eine gute strukturelle Erhaltung und eine effiziente Fluoreszenzfarbstoffpenetration von Ganzgeweben ermöglicht.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Markierung der replizierenden mitochondrialen DNA in erwachsenen Eierstöcken von Drosophila mit EdU. Es werden einige technische Lösungen angeboten, um die Lebensfähigkeit der Eierstöcke zu verbessern, ihre Gesundheit während der Präparation zu erhalten und eine qualitativ hochwertige Bildgebung zu gewährleisten. Die Visualisierung neu synthetisierter mtDNA in den Eierstöcken zeigt nicht nur das auffällige zeitliche und räumliche Muster der mtDNA-Replikation durch Oogenese, sondern ermöglicht auch eine einfache Quantifizierung der mtDNA-Replikation unter verschiedenen genetischen und pharmakologischen Störungen.

Das obige Protokoll ermöglicht die Visualisierung der punctate Strukturen im Zusammenhang mit Mitochondrien (1B-C), die während der Oogenese Drosophila mitochondrialen DNA - Replikation zeigen. Die EDU puncta mit Mitochondrien lokalisiert gekennzeichnet durch für die ATP - Synthase - alpha - Untereinheit (Abbildung 2) Färbung. Die beobachteten Signale fehlten in Ovarien mit Ethidiumbromid 11 behandelt, einem Inhibitor für mtDNA - Replikation 14, Validierung , dass diese puncta tatsächlich Label replizierende mtDNA.Aphidicolin verwendet wurde , nukleare DNA - Färbung zu verhindern , ohne dass dies Auswirkungen mtDNA Replikation (Abbildung 2). Ohne Aphidicolin - Behandlung, beschriften intensive EdU Signale , die Kerne und mtDNA puncta wurden kaum nachgewiesen werden (Abbildung 3). Jedoch in Gegenwart von Aphidicolin wurde Kern Inkorporation dramatisch reduziert und viele puncta mit Mitochondrien assoziiert beobachtet. (1B). Doch vor allem, angezeigt mtDNA-Replikation ein räumliches Muster in Germarium. Wie durch die Anzahl der EdU puncta angegeben ist , gibt es ein moderates Maß an mtDNA - Replikation in Region 1 des Germarium, aber fast keine EdU Einbau in Region 2A (1C). Da die Zyste in der Germarium zu Region 2B bewegt sich nach unten, wieder mtDNA - Replikation und die Anzahl der EdU puncta in der hinteren Zyste von 2B Region war viel höher als die in der Region 2A (1C). Insbesondere wurde intensive EdU Inkorporation um die Ringkanäle eingeengt und der fusome Strukturen, wie sie in der hu li tai Shao (HES) Protein gefärbt. mtDNA gehalten in Bereich 3 des Germarium (1C) auf einem hohen Niveau zu replizieren Um die Zuordnung von spezif demonstrierenic Gene oder Behandlung mit mtDNA Proliferation konnte Drosophila Ovarien Genmanipulation oder medikamentöse Behandlung unterzogen werden. Wir behandelten Ovarien mit verschiedenen Konzentrationen von FCCP, einem klassischen mitochondrialen protonophore, das mitochondriale Membranpotential ableitet. Als Kontrolle hatte DMSO keine Auswirkung auf mtDNA Replikation (4A). Hohe Dosen von FCCP (10 uM) fast mtDNA Replikation verarmt vollständig im gesamten Germarium (4D). Dennoch geringere Konzentration von FCCP (2 oder 5 &amp; mgr; M) hatte einen geringen Einfluss auf die mtDNA - Replikation in Region 1 , aber gehemmt Replikation in Regionen 2B und 3 (4B-C), was darauf hindeutet Regionen 2B und 3 empfindlicher auf mitochondriale Störung sind, oder sie halten relativ langsamer Replikationskinetik. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass mtDNA-Replikation mit mitochondrialen Aktivität assoziiert ist. Insbesondere reagiert verschiedenen Regionen der Germarium unterschiedlich auf die mitochondriale impairment. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Abbildung 1. mtDNA - Replikation während der Drosophila oogenesis. (A) Schematische Darstellung eines Drosophila Ovariole und eine vergrößerte Ansicht des Germarium. Die Ovariole zeigt von links nach rechts, von vorne nach hinten, aufeinanderfolgenden Entwicklungsstadien der Eikammern. Im Germarium, die fusome (rot), Keimbahn-Stammzellen (blau), Mitochondrien (grün), Zukunft Oozyten (gestrichelte Linie, anerkannt durch Positionierung, fusome Struktur und mitochondriale Cluster), die Entwicklung von Zysten (Pfirsich) und vier Entwicklungsbereiche werden gezeigt . (B) Repräsentative Z-Stapel - Projektion eines Ovariole Wildtyp gekennzeichnet durch EdU und Antikörper gegen Hts-RC, einem Marker für die Ringkanäle und fusome. In Gegenwart von Aphidicolin wurde die EdU in mtDNA eingebaut (Pfeilspitzen) und Kerne (Pfeile). Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m.(C) Vergrößerte Ansicht von germaria im boxed Region in B skizziert. Die vier Entwicklungsbereiche sind angegeben. Maßstabsbalken, 5 um 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Abbildung 2. mtDNA Replikation in der Germarium Drosophila visualisiert durch EdU Einbau mit Aphidicolin - Behandlung (A) -. (D) Repräsentative konfokalen Abschnitt eines Wildtyp Germarium zeigt EdU Inkorporation (grün, b), Mitochondrien, durch ATP - Synthase alpha - Untereinheit Färbung markiert (red, C), und Kerne, markiert mit DAPI - Färbung (blau, D) mit Vorinkubation mit DNA - Polymerase-α - Inhibitor Aphidicolin. (A &amp;# 39 ;-D &#39;) ein vergrößertes Bild des eingerahmten Bereich in (A) zeigt EdU Inkorporation (B&#39;), Mitochondrien (C &#39;) und Kerne (D&#39;). In Gegenwart von Aphidicolin wird Kern Inkorporation (Pfeile) verringert und viele puncta wurden innerhalb von Mitochondrien (Pfeilspitzen) lokalisiert. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. Die Figur wurde von 11 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Abbildung 3. mtDNA - Replikation wird kaum in der Drosophila Germarium ohne Aphidicolin - Behandlung nachgewiesen werden (A) . - (D) Repräsentative konfokalen Abschnitt eines Wildtyp Germarium zeigt EdU Inkorporation (grün), Mitochondrien, gekennzeichnet durchATP-Synthetase-Untereinheit alpha-Färbung (rot), und Kerne, markiert mit DAPI-Färbung (blau) in Abwesenheit der DNA-Polymerase-α-Inhibitor Aphidicolin. (A&#39;-D &#39;) ein vergrößertes Bild des eingerahmten Bereich in (A) zeigt Inkorporation EdU (B&#39;), Mitochondrien (C &#39;) und Kerne (D&#39;). Ohne Aphidicolin wurden intensiv EdU Signale Etikett Kerne (Pfeile) und mtDNA puncta kaum erkannt. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. Die Figur wurde von 11 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Abbildung 4. Mitochondrial Entkupplungsgleise beeinträchtigt die mtDNA - Replikation. Repräsentative z-Stack Projekte Wildtyp Germarium mit DMSO behandelt zeigt(A) oder der mitochondrialen Entkopplers FCCP bei Konzentrationen von 2 uM (B), 5 &amp; mgr; M (C), 10 uM (D) während EdU Inkorporation. Beachten Sie die beeinträchtigte EdU Kennzeichnung in der Region 2B behandelt mit 2 uM FCCP (B), und in beiden Bereich 2B und 3 behandelt mit 5 uM FCCP (skizziert in Kästen). Vier Entwicklungsregionen sind dargestellt. Pfeile, die Kern-DNA; Pfeilspitzen, mtDNA. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. Die Figur wurde von 11 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Oogenese von Drosophila ist weiterhin außerordentlich nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Proliferation und Vererbung. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Markierung der replizierenden mitochondrialen DNA (mtDNA) in adulten Eierstöcken von Drosophila mit 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU), das die Aufdeckung von Mechanismen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Vererbung erleichtert, die bisher umstritten waren.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die mitochondriale DNA-Replikation in Drosophila-Adultovarien mittels EdU-Färbung nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitochondrienforschung zu beantworten, beispielsweise den Prozess der mitochondrialen Biogenese sowie die Vererbung der mitochondrialen DNA während der Entwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine gute Erhaltung der Struktur und eine effiziente Penetration fluoreszierender Farbstoffe in kompletten gebundenen Geweben ermöglicht.Um das Experiment zu beginnen, nehmen Sie ein Gefäß mit Drosophila-Medium, das Trockenhefe enthält, und kultivieren Sie 10 adulte weibliche Fliegen zusammen mit 10 adulten männlichen Fliegen bei 25 Grad Celsius für zwei bis drei Tage. Stellen Sie sicher, dass die Fliegen während der Inkubation ausreichend gefüttert bleiben. Betäuben Sie die Fliegen auf einem Kohlendioxid-Fliegenkissen und entnehmen Sie die weiblichen Fliegen mit einem Pinsel.Geben Sie mehrere Tropfen Drosophila-Medium mit 10 % FBS bei Raumtemperatur auf ein Präparationspad und platzieren Sie es unter ein Stereomikroskop. Greifen Sie mithilfe einer scharfen feinen Pinzette eine aufgeplusterte weibliche Fliege am hinteren Thorax. Tauchen Sie das gesamte Gewebe in das Medium ein und ziehen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten vorsichtig am äußersten Hinterende der Fliege, bis das Gewebe im Abdomen freigelegt ist.Als Nächstes lösen Sie die beiden Eierstöcke vorsichtig vom umgebenden Darm und überschüssigem Gewebe ab. Öffnen Sie die Eierstöcke durch vorsichtiges Auseinanderziehen, um die Ovariole freizulegen. Um das Eindringen der Reagenzien zu erleichtern, führen Sie die Spitzen der Pinzette mehrmals zwischen den einzelnen Ovariolan ein.Überführen Sie die Ovarien schließlich in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter sauberes Drosophila-Medium mit 10 % FBS enthält. Wiederholen Sie die Dissektion, um so viele Ovarien wie gewünscht zu sammeln, wobei 10 bis 15 Ovarien pro Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden. Um mit der Markierung zu beginnen, aspirieren Sie das Medium aus den Röhrchen mit den Ovarien, wobei sichergestellt werden muss, dass das Gewebe während des gesamten Vorgangs unter der Lösung bleibt, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Medium, das sieben Mikromolar Aphidicolin, einen Hemmstoff der nukleären DNA-Synthese, enthält.Die Ovarien drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Tischschüttler mit sanfter Rotation inkubieren. Falls eine Behandlung mit Wirkstoff gewünscht ist, die geeignete Konzentration des ausgewählten Wirkstoffs nach zwei Stunden Inkubation dem Medium zusetzen und anschließend die Inkubation für die gewünschte Dauer des jeweiligen Wirkstoffs fortsetzen. Das Medium von den Ovarien entfernen und diese kurz zwei Mal mit frischem Drosophila-Medium spülen.Geben Sie ein Milliliter Medium, das zehn Mikromolar EdU und sieben Mikromolar Aphidicolin enthält, hinzu und inkubieren Sie die Ovarien zwei Stunden bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation. Entfernen Sie abschließend die Flüssigkeit mit EdU und Aphidicolin und waschen Sie die Ovarien zweimal je drei Minuten mit frischem Drosophila-Medium. Um das Gewebe zu fixieren, inkubieren Sie die Ovarien zunächst zwanzig Minuten bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation in 4 % Paraformaldehyd.Entfernen Sie anschließend das Fixativ und waschen das Gewebe zweimal mit je einem Milliliter 3 % BSA in PBS, jeweils fünf Minuten lang, unter Rotation. Zum Permeabilisieren entfernen Sie die Waschlösung, geben einen Milliliter 0,5 % Triton X-100 in PBS hinzu und inkubieren die Ovarien dann zwanzig Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation. Schließlich entfernen Sie die Lösung und waschen das Gewebe zweimal mit je einem Milliliter 3 % BSA in PBS.Vor dem Experiment das EdU-Pufferadditiv gemäß den Herstelleranweisungen zubereiten und lagern. Das Pulver des EdU-Pufferadditivs vollständig in zwei Milliliter deionisiertem Wasser lösen, um eine 10x-Stammlösung herzustellen. Zur Durchführung der Detektion frischen EdU-Reaktionspuffer herstellen, indem der 10x EdU-Reaktionspuffer mit dem ionisierten Wasser verdünnt wird, um eine 1x-Arbeitslösung von einem Milliliter herzustellen, die zum Markieren von zwei Röhrchen mit Ovarien verwendet werden kann.Stellen Sie 100 Mikroliter frische 1x EdU-Additivpufferlösung her, indem Sie den 10x-Stammpuffer im Verhältnis 1:10 in entionisiertem Wasser verdünnen. Bereiten Sie ein Milliliter EdU-Reaktionscocktail vor, indem Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge kombinieren: 860 Mikroliter 1x EdU-Puffer, 40 Mikroliter Kupfersulfat, 2,5 Mikroliter Farbstoffazid und 100 Mikroliter EdU-Pufferadditiv. Es ist wichtig, die Reagenzien in genau dieser Reihenfolge hinzuzufügen und den Cocktail innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung zu verwenden.Entfernen Sie die BSA-Lösung von den Proben und geben Sie 0,5 Milliliter der EdU-Reaktionsmischung zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Rotation. Schützen Sie die Proben vor Licht.Spülen Sie die Proben abschließend einmal mit einem Milliliter 3 % BSA in PBS und anschließend einmal mit einem Milliliter PBS. Um mit der Antikörperfärbung zu beginnen, entfernen Sie zunächst die Waschlösung von den Ovarien und geben ein Milliliter Blockierungslösung hinzu, die 0,2 % BSA und 0,1 % Triton X-100 in PBS enthält. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren, wobei Sie in jedem Schritt der Markierung sicherstellen, dass die Proben vor Licht geschützt werden.Entfernen Sie die Blockierungslösung. Ersetzen Sie sie durch den in der Blockierungslösung verdünnten primären Antikörper und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie die Proben dreimal mit je einem Milliliter Blockierungslösung für jeweils zehn Minuten und anschließend noch zweimal für jeweils 30 Minuten, um die Hintergrundanfärbung zu minimieren.Entfernen Sie abschließend die Blockierungslösung. Inkubieren Sie das Gewebe anschließend für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln in 500 Mikrolitern sekundärem Antikörper, der in Blockierungslösung verdünnt wurde. Wiederholen Sie die Waschschritte dreimal mit je einem Milliliter Blockierungslösung für jeweils 10 Minuten und zweimal für jeweils 30 Minuten.Spülen Sie das Gewebe abschließend mit einem Milliliter PBS, um das Detergens zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten PBS und bedecken Sie das Gewebe sofort mit 50 Mikrolitern Einbettmedium. Überführen Sie die Ovarien mit einer Pipette, deren Spitze abgeschnitten wurde, vorsichtig auf einen Objektträger.Unter dem Stereomikroskop und mit feinen spitzen Pinzetten werden die Ovariole vollständig voneinander getrennt. Die verbindenden Gewebe am hinteren Ende sowie die Eikammern des Stadiums 14 oder reife Eikammern werden entfernt, sodass die jungen, durchsichtigen Eikammern im Inneren verbleiben. Mit Hilfe der Pinzette werden die Eikammern vorsichtig ausgerichtet, um Überlappungen zu vermeiden.Senken Sie langsam eine Deckglasnummer 1,5 aus Glas auf die Proben ab und lassen Sie das Montagemedium mehrere Stunden bei Raumtemperatur polymerisieren. Versiegeln Sie die Ränder mit durchsichtigem Nagellack und nehmen Sie die Proben auf, oder lagern Sie sie bei vier Grad Celsius unter lichtgeschützten Bedingungen, bis sie benötigt werden. Die Objektträger können etwa zwei Wochen lang aufbewahrt werden.Die Präparate unter einem konfokalen Mikroskop mit einer 63x-Ölimmersions-Objektivlinse visualisieren und dreidimensionale Z-Stapelbilder des Eierstockgewebes aufnehmen. Die hier gezeigten Drosophila-Ovariole zeigen die typischen aufeinanderfolgenden Entwicklungsstadien der Eikammern von anterior nach posterior. Konfokale Aufnahmen zeigen die EdU-Färbung der punktförmigen Struktur, die mit Mitochondrien assoziiert ist, und es wurde bestätigt, dass EdU während der Drosophila-Oogenese in die mtDNA und die Kerne eingebaut wird.Hier wird die mtDNA-Replikation im Drosophila-Germarium durch EdU-Inkorporation in Gegenwart des Inhibitors der nukleären DNA-Polymerase, Aphidicolin, sichtbar gemacht. Unter diesen Bedingungen zeigt sich eine verminderte nukleäre Inkorporation von EdU, und zahlreiche Punktstrukturen ließen sich innerhalb der Mitochondrien lokalisieren. In Abwesenheit einer Aphidicolin-Behandlung wird die mtDNA-Replikation im Drosophila-Germarium nur in sehr geringem Maße nachgewiesen.Ein konfokaler Schnitt eines Keimariums vom Wildtyp zeigt intensive EdU-Inkorporation in den Kernen, wobei MT-DNA-Punkte kaum nachweisbar sind. Wenn Keimarien vom Wildtyp mit einem mitochondrialen Entkopper, FCCP, in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt werden, ist die MT-DNA-Replikation beeinträchtigt. Dies wird durch eine Verringerung der EdU-Färbung bestätigt, wie bei den Behandlungen mit zwei Mikromolar, fünf Mikromolar und 10 Mikromolar zu sehen ist.Mit dieser Methode kann eine einfache Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Replikation unter verschiedenen genetischen und pharmakologischen Bedingungen durchgeführt werden.

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Forschung

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Genetics

Genetik

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Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

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Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila-Eierstöcken werden in dieser Arbeit beschrieben und demonstriert.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Lernen Sie die EdU-Färbung zur Markierung mitochondrialer DNA-Replikation in Drosophila-Ovarien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Biogenese und Vererbungsmechanismen bei guter Gewebeerhaltung.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

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