In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Einzelzell-Elektrophysiologie-Analyse einer definierten Population sensorischer Neuronen in akuten Gewebeschnitten aus dem Vomeronasalorgan der Maus durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Chemosensorik zu klären, beispielsweise die Mechanismen der chemischen Detektion ohne Sehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Ableitung von sensorischen Neuronen in akuten Gewebeschnitten diese Zellen in ihrem nativen Milieu untersucht werden können.

Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie nach der Tötung des Tieres den Unterkiefer, indem Sie ein Paar großer chirurgischer Scheren durch die Mundhöhle einführen und die Unterkieferknochen und Muskeln jeder Seite separat durchtrennen. Entfernen Sie anschließend mit einer mittleren Pinzette die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze, um besser an die Schneidezähne heranzukommen. Schneiden Sie dann mit der Knochenschere unter einem Winkel von 45 Grad in rostraler Richtung den größten Teil der Schneidezähne ab, um die Entfernung der VNO-Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern.

Schneiden Sie die Wurzel des Zahns nicht ab, um eine Beschädigung der Spitze der VNO-Kapsel zu vermeiden. Danach greifen Sie mit mittleren Pinzetten den harten oberen Gaumen an seinem rostralen Teil und lösen ihn vorsichtig in einem Stück unter flachem Winkel ab. Spülen Sie die Nasenhöhle wiederholt mit eiskalter Lösung S2 aus. Anschließend schneiden Sie mit Mikro-Federschere die Knochenanhängsel zwischen der Spitze des Pflugschaufelbeins und dem Kiefer durch.

Führen Sie die Scherenspitzen ein, wobei der gebogene Teil von der VNO wegzeigt. Schneiden Sie vorsichtig in kleinen Schritten das Knochengewebe auf der linken und rechten Seite lateral zur VNO-Kapsel durch. Um die VNO-Kapsel zu entfernen, durchtrennen Sie das Vomerbein im kaudalen Bereich und heben Sie das Vomerbein vorsichtig mit einer mittleren Pinzette aus der Nasenhöhle heraus.

Überführen Sie das VNO unverzüglich in eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Kühlgelpack, wo die verbleibenden Schritte der Dissektion durchgeführt werden sollten. Spülen Sie anschließend das VNO mit einer geringen Menge eiskalter S2-Lösung, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet. Trennen Sie danach die knorpeligen Kapseln, die das weiche VNO-Gewebe enthalten, indem Sie mit mittleren Pinzette das hintere Ende des Pflugscharbeins ergreifen.

Dazu positionieren Sie die Kapsel so für eine dorsale Ansicht, dass eine Trennung zwischen beiden VNOs sichtbar wird. Benutzen Sie die Spitze einer feinen Pinzette, um beide knorpeligen VNO-Kapseln vom zentralen Knochen zu lösen, wobei das Vomerbein im hinteren Bereich fixiert bleibt. Achten Sie darauf, dass die zuvor mit dem Vomerbein verbundene mediale Knorpelwand entfernt wird.

Beim Entfernen des Knorpels um das VNO verwenden Sie die Pinzette nur am Rand der Knorpelkapsel. Achten Sie sorgfältig darauf, das empfindliche sensorische Epithel nicht zu beschädigen. Um verbliebenen Knorpel zu entfernen, drehen Sie das VNO mit seiner gekrümmten lateralen Seite nach unten auf den Boden der Schale und fixieren Sie den Knorpel auf einer Seite mithilfe der Pinzette sicher.

Bewegen Sie dann vorsichtig die zweite feine Pinzette von der Rückseite aus in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO, um die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lösen. Um das sensorische Epithel nicht zu beschädigen, lösen Sie das VNO langsam vom Knorpel, indem Sie es an seiner kaudalen Spitze halten. Sobald das VNO aus der Kapsel gelöst ist, entfernen Sie alle verbleibenden kleinen Knorpelteile, da sonstige Knorpelreste das Gewebe während des Schneidens von der umgebenden Agarose ablösen könnten.

Als Nächstes einen kleinen Tropfen eiskalte S2-Lösung auf das erste präparierte VNO geben, um Gewebeschäden zu verhindern. Um die VNOs einzubetten, beide kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzener S3-Lösung füllen. Danach jedes VNO in die Agarose eintauchen und mehrmals horizontal hin und her bewegen, um den Film der extrazellulären Lösung sowie eventuelle Luftblasen von der Oberfläche zu entfernen. Das VNO vertikal ausrichten, wobei die rostrale Spitze auf den Boden der Schale zeigt.

Stellen Sie anschließend beide Schalen auf einen Gelpack mit Kühlakkus und warten Sie, bis sich das Agarose verfestigt hat. Ändern Sie die Orientierung des VNO nicht mehr, sobald die Agarose zu erstarren beginnt, da dies das Gewebe von der umgebenden Agarose lösen würde. Entfernen Sie in diesem Verfahren den Agaroseblock mit einem kleinen Spatel aus der kleinen Schale und legen Sie ihn in den Deckel einer großen Petrischale, wobei Sie den Agaroseblock umdrehen, sodass die rostrale Spitze des VNO nach oben zeigt.

Schneiden Sie als Nächstes den Block mit einem chirurgischen Skalpell in eine pyramidenförmige Form und achten Sie darauf, das eingebettete Gewebe nicht zu beschädigen. Befestigen Sie dann den pyramidenförmigen Block mit Sekundenkleber in der Mitte der Vibratomschneideplatte und warten Sie etwa eine Minute, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.

Schneiden Sie die Probe in Abschnitte mit einer Dicke von 150 bis 200 Mikrometern. Überprüfen Sie kurz die Morphologie der Schnitte unter dem Stereomikroskop. Überführen Sie anschließend alle Schnitte in die Sauerstoffkammer, bis sie verwendet werden.

In diesem Schritt überführen Sie eine VNO-Schnittstelle in die Bildgebungskammer und fixieren die Position der Schnittstelle mit einem Edelstahlanker, der mit synthetischen Fasern von einem Millimeter Dicke verdrahtet ist. Bedecken Sie die Gewebeschnittstelle nicht mit den synthetischen Fasern. Überführen Sie anschließend die Bildgebungskammer in die Aufzeichnungseinrichtung und spülen Sie die Schnittstelle kontinuierlich bei Raumtemperatur mit oxygeniertem S2 durch.

Stellen Sie die Saugkapillare an der Oberfläche der Lösung so ein, dass ein konstanter Austausch der Badlösung erfolgt. Danach positionieren Sie den Acht-in-eins-Mehrfach-Perfusionsstift oberhalb und nahe dem nicht-sensorischen Teil des VNO-Schnitts, der das Blutgefäß enthält. Anschließend verbinden Sie die Referenzelektrode und die Badlösung mithilfe der L-förmigen Agarbrücke, die mit 150 Millimolar Kaliumchlorid gefüllt ist.

Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit der Pipettenlösung S4. Bringen Sie die Pipette über der mit Silberchlorid beschichteten Elektrode an, die mit der Kopfstufe verbunden ist, ohne die Beschichtung abzukratzen, und befestigen Sie sie fest. Anschließend wird ein leichter positiver Druck auf die Patch-Pipette ausgeübt, bevor sie in das Bad eintaucht. Überwachen Sie die Pipette und stellen Sie sicher, dass ihr Widerstand zwischen vier Megaohm und 10 Megaohm liegt.

Visualisieren Sie den VNO-Schnitt mit einer CCD-Kamera unter Verwendung von auf Infrarot optimiertem DIC und identifizieren Sie FPR-rs3 i-Venus exprimierende Zellen oder ähnlich markierte Neuronen mithilfe von Fluoreszenzbeleuchtung und einem geeigneten Filterwürfel. Nähern Sie sich dem Zellkörper mit den Handrädern für maximale Empfindlichkeit. Aufgrund des positiven Drucks wird eine kleine Delle auf der Zellmembran sichtbar, sobald sich die Pipettenspitze in unmittelbarer Nähe befindet.

Danach wird der positive Druck abgelassen und leichter Unterdruck angewendet, um die Zellmembran einzusaugen und einen Hochwiderstandskontakt von ein bis 20 Gigohm zu erzielen. Anschließend wird kurz und vorsichtig gesaugt, um die Zellmembran zu durchbrechen und die Ganzzell-Konfiguration herzustellen. In dieser Abbildung zeigt ein konfokales Bild eines koronalen VNO-Gewebeschnitts die Verteilung fluoreszierender FPR-rs3 Tau Venus-positiver Neuronen im vomeronasalen sensorischen Epithel.

Die FPR-rs3 Tau Venus-positiven Neurone weisen einen einzelnen apikalen Dendriten auf, der in einer knobenartigen Struktur an der luminalen Grenze endet. Dargestellt sind hier Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen, die am VSN-Soma durchgeführt wurden. Hier sind repräsentative Spuren aus Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen eines TTX-sensitiven, schnell aktivierenden Natriumstroms und FPR-rs3-positiver VSNs.

Spannungsschritt-Aufnahmen unter Kontrollbedingungen zeigen einen spannungsabhängigen, schnellen und transienten einwärts gerichteten Strom. Die Behandlung mit TTX bei einer Konzentration von einem Mikromolar verringert den Strom stark. Und die hier dargestellte digital subtrahierte Spur zeigt den TTX-sensitiven, spannungsabhängigen Natriumstrom.

Die repräsentativen Stromklemm-Aufnahmen zeigen Depolarisation und Hyperpolarisation sowie Aktionspotenzialserien, die durch schrittweise positive und negative Strominjektion ausgelöst werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann der gesamte Prozess aus Dissektion und Gewebeschnitten für beide VNOs innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie extrazelluläre Loose-Patch-Aufnahmen oder Calcium-Imaging angewendet werden, um die Durchsatzrate bei der Analyse größerer Neuronenpopulationen zu erhöhen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute Gewebeschnitte aus dem Vomeronasalorgan des Mundes herstellt und wie man elektrophysiologische Einzelzellableitungen von Vomeronasalsinnesneuronen durchführt.