In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einzellige elektrophysiologische Analyse einer definierten Population sensorischer Neuronen in akuten Gewebeschnitten aus dem vomeronasalen Organ der Maus durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Chemoempfindung zu klären, wie z.B. die Mechanismen des see-no chemical Nachweises. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Aufzeichnung von sensorischen Neuronen in akuten Gewebeschnitten diese Zellen in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden können.

Um diesen Eingriff zu beginnen, entfernen Sie nach dem Opfern des Tieres seinen Unterkiefer, indem Sie eine große chirurgische Schere durch die Mundhöhle einführen und die Unterkieferknochen und Muskeln jeder Seite separat schneiden. Entfernen Sie anschließend die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze herum mit einer mittleren Pinzette, um einen besseren Zugang zu den Schneidezähnen zu erhalten. Schneiden Sie dann mit der Knochenschere den größten Teil der Schneidezähne in einem 45-Grad-Winkel in rostraler Richtung ab, um die Entnahme der VNO-Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern.

Schneiden Sie nicht die Zahnwurzel ab, um eine Beschädigung der Spitze der VNO-Kapsel zu vermeiden. Fassen Sie danach den starren oberen Gaumen mit einer mittleren Pinzette an seinem rostralen Teil und schälen Sie ihn vorsichtig in einem Stück in einem flachen Winkel zurück. Spülen Sie die Nabelhöhle wiederholt mit eiskalter Lösung S2 ab. Schneiden Sie dann mit einer Mikrofederschere den Knochenerguss zwischen der Spitze des Vomerknochens und dem Kiefer ab.

Führen Sie die Scherenspitzen so ein, dass der gebogene Teil vom VNO weg zeigt. Und schneiden Sie den Knochen vorsichtig in kleinen Schritten sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite, seitlich der VNO-Kapsel. Um die VNO-Kapsel zu entfernen, schneiden Sie den Vomerknochen im kaudalen Teil durch und heben Sie den Vomerknochen vorsichtig mit einer mittleren Pinzette aus der Nasenhöhle an.

Übertragen Sie das VNO sofort in eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Eisgelpack, wo die restlichen Schritte der Dissektion durchgeführt werden sollten. Spülen Sie anschließend das VNO mit einer kleinen Menge eiskaltem S2 aus, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Trennen Sie dann die knorpeligen Kapseln, die die VNO-Weichteile enthalten, indem Sie mit einer mittleren Pinzette nach der Rückseite des Vomerknochens greifen.

Positionieren Sie dazu die Kapsel für eine dorsale Ansicht, so dass eine Teilung zwischen beiden VNOs sichtbar wird. Trennen Sie mit der Spitze einer feinen Pinzette beide Knorpel-VNO-Kapseln vom zentralen Knochen, während der Vomerknochen im hinteren Teil festgesteckt bleibt. Stellen Sie sicher, dass die mediale Knorpelwand, die zuvor mit dem Vomerknochen verbunden war, entfernt wird.

Verwenden Sie bei der Entnahme von Knorpel um den VNO herum eine Pinzette nur am Rand der Knorpelkapsel. Und seien Sie sehr vorsichtig, um das empfindliche sensorische Epithel nicht zu beschädigen. Um verbleibenden Knorpel zu entfernen, drehen Sie den VNO mit seiner gebogenen Seitenseite zum Boden der Schale und stecken Sie den Knorpel auf einer Seite mit einer Pinzette fest fest.

Bewegen Sie dann vorsichtig die zweite feine Pinzette von der Rückseite in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO, um die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lockern. Um eine Beschädigung des sensorischen Epithels zu vermeiden, schälen Sie das VNO langsam vom Knorpel ab, indem Sie es an seiner kaudalen Spitze halten. Sobald das VNO aus der Kapsel gehebelt ist, entfernen Sie alle verbleibenden kleinen Knorpelteile, da alle verbleibenden Knorpelstücke das Gewebe während des Schneidens von der umgebenden Agarose lösen.

Geben Sie anschließend einen kleinen Tropfen eiskaltes S2 auf das erste präparierte VNO, um Gewebeschäden zu vermeiden. Um die VNOs einzubetten, füllen Sie die beiden kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzenem S3. Tauchen Sie danach jedes VNO in Agarose und bewegen Sie es mehrmals horizontal hin und her, um den Film der extrazellulären Lösung sowie alle Luftblasen von seiner Oberfläche zu entfernen. Positionieren Sie den VNO senkrecht, wobei die rostrale Spitze zum Boden der Schale zeigt.

Anschließend beide Schalen auf einen Gel-Eisbeutel legen und warten, bis die Agarose fest geworden ist. Ändern Sie die VNO-Ausrichtung nicht, sobald die Agarose zu verfestigen begonnen hat, da sich dadurch das Gewebe von der umgebenden Agarose löst. Nehmen Sie bei diesem Verfahren mit einem kleinen Spatel den Agaroseblock aus der kleinen Schale in den Deckel einer großen Petrischale und drehen Sie die Agarose auf den Kopf, wobei die rostrale Spitze des VNO nach oben zeigt.

Schneiden Sie anschließend den Block mit einem chirurgischen Skalpell in eine pyramidenförmige Form und achten Sie darauf, das eingebettete Gewebe nicht zu beschädigen. Befestigen Sie dann den pyramidenförmigen Block mit Sekundenkleber in der Mitte der Vibratom-Probenplatte. Und warten Sie etwa eine Minute, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.

Schneiden Sie die Probe in 150 bis 200 Mikrometer dicke Abschnitte. Untersuchen Sie kurz die Morphologie der Scheibe unter dem Präpariermikroskop. Übertragen Sie dann alle Scheiben bis zur Verwendung in die Sauerstoffkammer.

In diesem Schritt übertragen Sie eine VNO-Scheibe in die Bildgebungskammer und fixieren die Schnittposition mit einem Edelstahlanker, der mit einem Punkt von einem Milometer dicken synthetischen Fasern verdrahtet ist. Decken Sie die Gewebescheibe nicht mit einem der Kunstfaserfäden ab. Übertragen Sie dann die Bildgebungskammer in das Aufnahme-Setup und überstrahlen Sie die Scheibe kontinuierlich mit sauerstoffhaltigem S2 bei Raumtemperatur.

Passen Sie die Saugkapillare an die Oberfläche der Lösung an, um einen ständigen Austausch der Badlösung zu gewährleisten. Passen Sie dann den Acht-in-einem-Mehrfach-Profusionsstift über und in der Nähe des nicht-sensorischen Teils der VNO-Scheibe an, der das Blutgefäß enthält. Verbinden Sie anschließend die Referenzelektrode und die Badlösung mit der L-förmigen Agarbrücke, die mit 150 Millimolar Kaliumchlorid gefüllt ist.

Füllen Sie anschließend die Patchpipette mit der Pipettenlösung S4. Montieren Sie die Pipette über die mit Silberchlorid beschichtete Elektrode, die mit dem Kopftisch verbunden ist, ohne die Beschichtung abzukratzen, und befestigen Sie sie fest. Üben Sie dann einen leichten Überdruck auf die Patch-Pipette aus, bevor Sie in die Badewanne gelangen. Überwachen Sie die Pipette und stellen Sie sicher, dass sie zwischen vier und 10 Megaohm liegt.

Visualisieren Sie die VNO-Schicht mit einer CCD-Kamera unter Verwendung von infrarotoptimierter DIC und identifizieren Sie FPR-rs3 i-Venus-exprimierende Zellen oder ähnlich markierte Neuronen mithilfe von Floreszenzbeleuchtung und einem geeigneten Filterwürfel. Nähern Sie sich dem Zellkörper mit Handrädern, um maximale Empfindlichkeit zu erzielen. Durch den Überdruck wird eine kleine Delle auf der Somamembran der Zelle sichtbar, sobald sich die Pipettenspitze in unmittelbarer Nähe befindet.

Lassen Sie dann den Überdruck ab und üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um die Zellmembran anzusaugen, um eine hochohmige Abdichtung von einem bis 20 Gigaohm zu erhalten. Wenden Sie anschließend ein kurzes und sanftes Saugen an, um die Zellmembran aufzubrechen und die gesamte Zellkonfiguration zu etablieren. In dieser Abbildung zeigt ein konfokales Bild eines koronalen VNO-Gewebeschnitts die Verteilung von fluoreszierenden FPR-rs3 Tau Venus-positiven Neuronen im vomeronasalen sensorischen Epithel.

Die FPR-rs3 Tau Venus-positiven Neuronen weisen einen einzelnen apikalen Dendriten auf, der in einer knubbelartigen Struktur an der luminalen Grenze endet. Und hier sind die Aufnahmen der gesamten Zell-Patch-Klemme, die vom VSN-Soma durchgeführt wurden. Hier sind die repräsentativen Spuren von Großhandels-Patch-Clamp-Aufzeichnungen eines TTX-empfindlichen, schnell aktivierenden Natriumstroms und FPR-rs3-positiven VSNs.

Spannungsschrittaufzeichnungen unter Regelbedingungen zeigen einen spannungsabhängigen schnellen und transienten Einströmstrom. Die TTX-Behandlung an einem Mikromolaren verringert den Strom stark. Und die hier gezeigte digital subtrahierte Kurve zeigt den TTX-empfindlichen spannungsgesteuerten Natriumstrom.

Die repräsentativen Stromzangenspuren zeigen Depolarisation und Hyperpolarisation sowie Züge von Aktionspotentialen, die bei schrittweiser positiver und negativer Strominjektion erzeugt werden. Sobald die Beherrschung abgeschlossen ist, kann der gesamte Dissektions- und Gewebeschnittprozess für beide VNOs in etwa einer Stunde durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie extrazelluläre Loose Patch Recordings oder Calcium Imaging durchgeführt werden, um den Durchsatz bei der Analyse größerer Neuronenpopulationen zu erhöhen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute Gewebeschnitte aus dem vomeronasalen Organ des Mundes macht und wie man elektrophysiologische Einzelzellaufnahmen von vomeronasalen sensorischen Neuronen durchführt.