Name: In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Erfahren Sie die elektrophysiologische Analyse sensorischer Neuronen im akuten Gewebeschnitt des Vomeronasalorgans der Maus mittels Patch-Clamp. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Chemosensationsmechanismen in vivo.

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Wir danken Ivan Rodriguez und Benoit von der Weid für die Generierung der FPR-rs3-i-venus-Mauslinie, ihre konstruktive Kritik und ihre fruchtbaren Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuwendungen der VolkswagenStiftung (I/83533), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) und durch die Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder gefördert. MS ist Lichtenberg-Professur der VolkswagenStiftung.

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen und Rechtsvorschriften der Europäischen Union über den Schutz von Tieren zu Versuchszwecken (Richtlinie 86/609 / EWG) und mit Empfehlungen von der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) vorgelegt verwendet. Sowohl C57BL / 6 - Mäuse und Fpr-RS3-i-Venus - Mäuse wurden in Gruppen beider Geschlechter bei Raumtemperatur auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Für Experimente junge Erwachsene (6-20 Wochen) beiderlei Geschlechts wurden verwendet. Keine offensichtlichen geschlechtsabhängige Unterschiede beobachtet. 1. Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten extrazelluläre Lösung S 1: 4- (2-Hydroxy-ethyl) -piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) gepufferten extrazelluläre Lösung , enthaltend (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH); Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt). </li><li> bereiten Sie extracellular Lösung S 2: Carbogen-oxygenierten (95% O 2, 5% CO 2) extrazelluläre Lösung (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt). </li><li> Bereiten Sie 4% Nieder Geliertemperatur Agarose - Lösung (S 3) für die Gewebeeinbettung: 4% Nieder Geliertemperatur Agarose. Löse 2 g Tief Gelieren Agarose in 50 ml S 1 in einem 100 - ml - Glaslaborflasche zusammen mit einem Magnetrührer. Um die Agarose schmelzen, stellte die Flasche in einem Wasserbad (mit Deckel nicht dicht geschlossen) bei 70 ° C für ca. 20 Minuten oder bis die Lösung transparent wird unter Rühren. Abkühlen und halten geschmolzener Agarose in einem zweiten Wasserbad bei 42 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Bereiten intrazellulärem Lösung S 4: Pipettenlösung , enthaltend (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (freie Ca 2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (eingestellt mit KOH); Osmolarität = 290 mOsm. </li><li> Modifizieren / anpassen Zusammensetzung S 1, S 2 und S 4 nach individuellen Versuchsplanung (zB pharmakologische Blocker zu isolieren bestimmte Arten von spannungsaktivierten Ströme). </li></ol> 2. Arbeitsbereich Vorbereitung <ol><li> Füllen Scheibe mit Sauerstoff mit S 2 mindestens 30 Minuten vor der Präparation, auf Eis für Temperatur und pH - Einstellung und oxygenate Lösung kontinuierlich Speicherkammer. </li><li> Füllen Reservoir für Scheibe Superfusions bei der Aufnahme - Setup mit S 2 und Sauerstoff kontinuierlich. </li><li> Vor der Präparation, füllen Vibratom Kammer mit S 2 und zerstoßenem Eis um die Kammer anordnen. Alternativ übertragen Ersatz eiskalt mit Sauerstoff angereicherte Lösung aus der Kammer in Vibratom Kammer mit Sauerstoff und kontinuierlich mit Sauerstoff zu halten. </li><li> Vereinbaren Sie chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien. </li><li> Legen Sie Eis Gelpack unter SezierenMikroskop, Deckel mit einem Papiertuch VNO Gewebe gefriert zu Boden der Schale zu verhindern. </li><li> Saubere Rasierklinge durch kurz in 70% Ethanol und destilliertem Wasser gespült und montieren zu Vibratom. Ersetzen Sie für jede Slicing-Sitzung. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> Sacrifice Tier durch kurze Exposition zu CO 2 und enthaupten scharfe chirurgische Schere. Hinweis: Im Laufe der Zeit zu opfern, das Tier auf die Verwirklichung des VNO Kapsel auf Eis kritisch ist, minimieren die Zeit auf weniger als 2 min. Zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes, einbetten sowohl vollständig seziert VNOs in Agarose in weniger als 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Unterkiefer mit großen chirurgischen Schere. Geben Sie durch die Mundhöhle und schneiden Sie die Unterkiefer Knochen und Muskel von jeder Seite getrennt. </li><li> Platzieren Sie den restlichen Teil der Kopf auf den Kopf in der großen Petrischale. </li><li> Ziehen Sie die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze mit mittlerer Pinzette entfernt einen besseren Zugang zu den zu gewinnenSchneidezähne. </li><li> Verwenden Sie Knochen Schere , um den größten Teil der Schneidezähne in der rostralen Richtung (Abbildung 1A) in einer ~ 45 ° Winkel wegzuschneiden. Dies wird die Entfernung des VNO Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern. Hinweis: Nehmen Sie an die Wurzel des Zahns nicht geschnitten Schäden an der Spitze der VNO Kapsel zu verhindern. </li><li> Besorgen Sie sich die starren oberen Gaumen an seinem rostralen Teil mit mittlerer Pinzette und sorgfältig schälen zurück in einem Stück in einem flachen Winkel (1B). Hinweis: Wiederholt spülen mit eiskaltem S 2. </li><li> Verwenden Sie Mikro-Feder Schere, um die Knochenfusion zwischen der Spitze des Vomers und den Kiefer zu schneiden. Legen Sie die Scherenspitzen mit dem gekrümmten Teil der Spitze nach außen weg von der VNO und sorgfältig sowohl den Knochen in kleinen Schritten auf schnitt der linken und rechten Seite lateral der VNO-Kapsel. </li><li> Um die VNO Kapsel zu entfernen, verwenden Mikro Feder Schere durch den Vomers am kaudalen Teil zu schneiden und vorsichtig heben Sie den Vomers aus dem nasal Hohlraum mit mittlerer Pinzette. Unmittelbar übertragen Sie die VNO auf eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Eis-Gel-Packung, wo die restlichen Schritte der Präparation wird ausgeführt. </li><li> Spülen Sie das VNO in einer kleinen Menge eiskaltem S 2 in das Gewebe ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Trennen Sie die knorpelige Kapseln, die die VNO Weichgewebe durch Greifen der Rückseite des Vomers mit mittlerer Zange enthalten. Positionieren Sie die Kapsel für eine dorsale Ansicht , so dass eine Spaltung zwischen den beiden VNOs sichtbar wird (Abbildung 1D i). </li><li> Verwenden Sie die Spitze der feinen Pinzette beide Knorpel VNO Kapseln vom zentralen Knochen zu trennen, während die Vomers am hinteren Teil festgenagelt zu halten. Hinweis: Verwenden einer Pinzette nur am Rand des Knorpels Kapsel und sehr vorsichtig sein, nicht durch den Knorpel zu durchdringen, wie die zarte ist Sinnesepithel leicht beschädigt werden. </li><li> Sobald die beiden VNOs getrennt sind, starten Sie den Knorpel Entfernen der Tannen Einkapselnt VNO. </li><li> Besorgen Sie sich die oberen Rand der Kapsel mit einer feinen Pinzette und spaltete die Knorpelwand weg, die zuvor mit dem Vomers (mediale Seite) befestigt war. </li><li> verbleibenden Knorpel drehen Sie den VNO mit seinen geschwungenen seitlichen Seite auf den Boden der Schale zu entfernen und den Knorpel sicher auf der einen Seite festzunageln Pinzette. bewegen vorsichtig die zweite feinen Pinzette von der Rückseite in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lösen. </li><li> Langsam das VNO schälen aus dem Knorpel entfernt, indem sie es an seiner Schwanzspitze hält, eine Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden. </li><li> Sobald die VNO aus der Kapsel gehebelt wird, stellen Sie sicher, alle verbleibenden kleinen Knorpelteile wie verbleibenden Knorpelstücke zu entfernen, wird das Gewebe aus den umliegenden Agarose während des Schneidprozesses lösen. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen eiskalten S 2 im ersten seziert VNO zu Gewebeschäden zu verhindern. Ein großes Blutgefäß an der lateralen Seite will werden sichtbar anzeigt , dass das Organ noch intakt ist und nicht grob beschädigt während der Präparation (2A ii). Im Falle wurde das Blutgefäß beschädigt, wird es dennoch sinnvoll sein, die VNO, solange die Gesamtmorphologie war nicht eindeutig beeinträchtigt weitermachen mit dem Schneiden. </li><li> Unmittelbar nach der zweiten VNO sezieren. </li><li> So betten die VNOs, füllen die beiden kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzenem S 3 (gespeichert in einem Wasserbad bei 42 ° C; siehe 1.3). </li><li> Halten Sie die VNO auf den breiteren Schwanzende mit einer feinen Pinzette Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden. </li><li> Tauchen Sie die VNO in der Agarose und bewegen Sie ihn horizontal hin und her mehrere Male den Film von extrazellulären Lösung sowie alle Luftblasen von der Oberfläche zu entfernen. </li><li> Positionieren Sie die VNO vertikal mit der Schwanzspitze den Boden der Schale zugewandt ist. Anstatt das VNO mit der Zange direkt Kneifen, justieren Orientierung durch die Zangenspitze in der Nähe proximi bewegenty zum VNO. Hinweis: Orientierung bei der Einbettung ist entscheidend, da es Schnittebene und die Zugänglichkeit zu sensorischen Neuronen während des Experiments bestimmt. </li><li> Legen Sie Gerichte auf Gel Eisbeutel und warten, bis Agarose erstarrt ist. Hinweis: VNO Orientierung nicht ändern, sobald die Agarose verfestigt hat begonnen, da dies das Gewebe aus dem umgebenden Agarose zu lösen. </li></ol> 4. Koronar VNO Gewebe Slicing <ol><li> Verwenden Sie kleine Spachtel Agaroseblock von der kleinen Schale in den Deckel einer großen Petrischale zu entfernen, drehen Sie die Agarose den Kopf, die Schwanzspitze des VNO verlässt nach oben. </li><li> Schneiden Sie den Block in eine pyramidale Form eines chirurgischen Skalpells (3-4 mm an der Spitze, 8-10 mm an der Unterseite) mit. Achten Sie darauf, nicht das eingebettete Gewebe zu beschädigen. </li><li> Verwenden Sie Superkleber der pyramidenförmigen Block auf der Mitte der Vibratom Probenplatte zu reparieren und warten ~ 1 min für den Kleber vollständig trocknen. </li><li> Übertragen Sie die Probenplatte zum Schneiden chamber und die zweite VNO vorzubereiten, entsprechend. Halteplatte mit der zweiten Probe bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Verwenden Sie ein vibrierender Klinge Mikrotom mit den folgenden Einstellungen: Dicke: 150-200 &amp; mgr; m; Geschwindigkeit: 3,5 au = 0,15 mm / sec; Frequenz: 7.5 au = 75 Hz. Übertragen Scheiben zu Sauerstoffanreicherungskammer bis zur Verwendung für Scheibe Morphologie unter dem Binokular kurz inspizieren. Scheiben können für mehrere Stunden gehalten werden. </li></ol> 5. Einzelzelle elektrophysiologischen Ableitungen <ol><li> Für Aufnahmen, verwenden Sie eine aufrechte Fest Bühne Mikroskop ausgestattet mit Wassertauchziele, Dodt oder Infrarot-Differential störenden Kontrast (IR-DIC) und Epi-Fluoreszenz sowie eine gekühlte CCD-Kamera. Zur Datenerfassung, verwenden Sie ein Patch-Clamp-Verstärker, Kopfstufe, AD / DA-Schnittstellenkarte und einem PC (einschließlich Aufnahme-Software). </li><li> Bereiten Sie einen Vorrat von 10-20 Patch-Pipetten (4-7 MOhm). Pull-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) usinga Mikropipette Abzieher und Feuerpolitur mit einem Mikroschmiede. Hinweis: Feuerpolieren der Pipettenspitzen von entscheidender Bedeutung ist, wenn die eher kleinen VSNs Patchen. Dadurch wird die Zellmembran Bersten zu verhindern helfen, wenn Unterdruck anwenden, um eine hohe Beständigkeit Dichtung zu erhalten. Nach der Pipettenöffnung Polieren sollte etwa 1 &amp; mgr; m sein. </li><li> Halten Sie Pipetten in eine Pipette Vorratsgefäß Schaden und Staubansammlung bis zur Verwendung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie Perfusionssystem durch Lösungsbehälter füllen und Schläuche nach experimentellen Design. Hinweis: Entfernen Sie Luftblasen aus Schlauch vollständig, da sie stark mit elektrophysiologischen Ableitungen stören. </li><li> Passen Druck zu erreichen ~ 3 ml / min fließen. Hinweis: Hohe Drücke Bewegung des Gewebeschnitts verursachen sowie Beendigung der elektrophysiologischen Ableitungen. </li><li> Übertragen VNO Scheibe zu Abbildungskammer und befestigen Sie die Schnittposition Edelstahlanker mit Kabel mit 0,1 mm dicken synthetic Fasern (2B - C). Hinweis: Nicht die Gewebescheibe bedecken mit einer der Kunstfasergarne, sondern die Agarose die Scheibe umgibt. </li><li> Transfer Imaging - Kammer zur Einrichtung der Aufnahme und kontinuierlich superfuse Scheibe mit Sauerstoff angereichertem S 2 bei Raumtemperatur über eine Bad - Anwendung. </li><li> Stellen Sie die Saug-Kapillare an der Oberfläche der Lösung eine langsame Absaugung für ständigen Austausch von Bad Lösung zu schaffen. Stellen Sie die 8-in-1 Multi-barrel &quot;Perfusion Bleistift&quot; oben und in der Nähe der Nicht-sensorische Teil des VNO Scheibe, die das Blutgefäß (2C, 3A) 50 enthält. Es wird von Vorteil sein Perfusion Bleistift und Aufnahme Pipette zu ordnen aus entgegengesetzten Richtungen gegenüber der Scheibe zu sein. </li><li> Verbinden Referenzelektrode und Badlösung einen L-förmigen Agarbrücke Verwendung (gefüllt mit 150 mM KCl). </li><li> Füllen Sie Patch - Pipette mit Pipettenlösung S 4. </li><li> Montieren Sie die Pipette über das Silberchlorid beschichteten Patch-Elektrode mit der Kopfstufe verbunden, ohne dass die Beschichtung abgekratzt und befestigen fest. </li><li> Mit leichtem Überdruck (etwa 1 ml auf 10 ml Plastikspritze) mit dem Patch-Pipette, bevor Sie das Bad betreten. </li><li> Senken Sie die Pipette in das Bad Mikromanipulatoren mit weit genug , um das Ziel zu versenken , ohne auf sie (2D). </li><li> Monitor - Pipette Widerstand (R pip, zwischen 4-7 M &amp; Omega;) unter Verwendung von Elektro Software auf die Kopfstufe verbunden. Hinweis: Wenn R pip &lt;4 MOhm die Glasspitze gebrochen ist. Wenn R pip&gt; 10 M &amp; OHgr; ist die Spitze wahrscheinlich verstopft , und die Pipette ersetzt werden müssen. </li><li> Visualisieren Sie die VNO Scheibe mit einer CCD-Kamera mit Infrarot-optimierte differentiellen Interferenzkontrast (DIC) und identifizieren FPR-RS3-i-Venus-Zellen, die (oder ähnlich markierten Neuronen) unter Verwendung von Fluoreszenzbeleuchtungund eine entsprechende Filterwürfel. </li><li> Fokus und Ziel fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Zellen in Abhängigkeit von experimentellen Design. </li><li> Um den Zellkörper nähern, verwenden Handräder für maximale Empfindlichkeit. Aufgrund der positiven Druck, eine kleine Delle in der Zelle soma Membran sichtbar wird, sobald die Pipettenspitze in der Nähe ist. </li><li> Lassen Sie positiven Druck und mit leichtem Unterdruck zu saugen in der Zellmembran, um eine hohe Widerstands Dichtung (1-20 G &amp; Omega;) zu gewinnen. Tragen Sie kurze und sanfte Saugwirkung die Zellmembran und stellen Sie die Gesamtzellkonfiguration zu stören. </li><li> Überwachen Sie den Zugriff Widerstand ständig während Experiment. Hinweis: Nur umfassen Neuronen zeigen kleine und stabile Zugangswiderstand (≤3% der R - Eingang; Änderung &lt;20% über den Verlauf des Experiments) in Analyse. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das VNO ist eine chemosensorischen Struktur, die Semiochemicals erkennt. Bis heute ist die Mehrheit der vomeronasal Rezeptoren werden deorphanized da nur wenige Rezeptor-Ligand-Paare wurden identifiziert. Unter denen, 58 V1rb2 beschrieben wurde spezifisch durch die männlichen Urin Pheromon 2-Heptanon 30, V2rp5 aktiviert zu werden durch das männliche spezifischen Pheromon ESP1 aktiviert werden 57 sowie V2r1b und V2rf2 SYFPEITHI 48 und SEIDLILGY von den MHC - Peptide aktiviert z...

Die meisten Tiere verlassen sich stark auf ihre chemischen Sinne mit ihrer Umgebung interagieren. Der Geruchssinn spielt eine wesentliche Rolle für die Suche nach und das Essen der Bewertung, Räuber und Ortung geeigneten Paarungspartner zu vermeiden. Bei den meisten Säugetieren, besteht das olfaktorische System von mindestens vier anatomisch und funktionell unterschiedlichen peripheren Subsysteme: Haupt Riechepithel 1,2, das Grueneberg Ganglion 3,4, der Septalorgan von Masera 5,6 und das Vomeronasalorgan. Die VNO umfasst die periphere sensorische Struktur des akzessorischen olfaktorischen System (AOS), die bei der Aufdeckung von chemischen Signale eine große Rolle spielt , die 7-10 Informationen über Identität, Geschlecht, sozialen Rang und sexuellen Zustand vermitteln. Das VNO ist an der Basis der Nasenscheidewand direkt über dem Gaumen befindet. Bei Mäusen, ist es ein bilaterales blind endende Rohr in einer knorpeligen Kapsel eingeschlossen 13.11. Die Orgel besteht sowohl aus einem sichelförmigen medialen Sinnes epithelium, die die VSNs und eines nicht-sensorische Teil auf der lateralen Seite beherbergt. Zwischen beiden Epithelien liegt ein Schleim gefüllten Lumen , das 14 in die Nasenhöhle über die schmalen vomeronasal Kanal verbunden ist. Eine große seitliche Blutgefäß in dem nicht-sensorischen Gewebe stellt einen vaskulären Pumpmechanismus Eintritt von relativ großen, meist nicht flüchtigen Moleküle wie Peptide oder kleine Proteine ​​in die VNO Lumen durch Unterdruck 15,16 zu erleichtern. Die Bauteile des VNO sind bei der Geburt vorhanden und das Organ erreicht Erwachsenengröße kurz vor der Pubertät 17. Doch ob das Nagetier AOS bei Jugendlichen bereits funktionsfähig ist , ist noch Gegenstand von 18-20 zu diskutieren. VSNs beide zeichnen sich durch ihre epithelialen Lage und der Art des Rezeptors sie zum Ausdruck bringen. VSNs zeigen eine bipolare Morphologie mit einem unmyelinated Axon und einem einzigen apikalen Dendriten, die in Richtung des Lumens ragt und endet in einem mikrovillösen dendritischen Knopf. VSN axons fasciculate die vomeronasal Nerven zu bilden, die die Knorpelkapsel an der dorso-kaudalen Ende verlässt, steigt entlang der Scheidewand, übergibt die Siebbeinplatte und Projekte mit dem Zubehörriechkolben (AOB) 21,22. Die vomeronasal Sinnesepithel besteht aus zwei Schichten: die apikale Schicht näher an der luminalen Seite befindet und Häfen sowohl V1R- und alle, aber eine Art von FPR-rs-exprimierenden Neuronen. Diese Neuronen koexprimiert die G-Protein - α-Untereinheit G &amp; agr; i2 und Projekt an den vorderen Teil des AOB 23-25. Sensorischen Neuronen befindet sich in den mehr Basalschicht express V2Rs oder FPR-RS1 neben G &amp; agr; o und ihre Axone zu den hinteren Bereich des 26-28 AOB senden. Vomeronasal Neuronen werden durch ziemlich kleine Semiochemicals 29-33 (V1Rs) oder proteinöse Verbindungen 34-38 (V2Rs) , die sezerniert werden in verschiedene Körperflüssigkeiten, wie Urin, Speichel und Tränenflüssigkeit wahrscheinlich aktiviert 37,39-41 </sup&gt;. In situ - Experimente haben gezeigt , dass auch durch VSNs formylierte Peptide und verschiedene antimikrobielle / Entzündung-verknüpften Verbindungen 25,42 sind aktiviert. Darüber hinaus äußerte heterolog FPR-rs - Proteine ​​Agonisten Spektren mit FPR im Immunsystem in jedem Fall teilen, eine mögliche Rolle als Detektoren für Krankheit in Artgenossen oder verdorbene Lebensmittel Quellen angibt , 25 (siehe 43 Referenz). Fundamental zum Verständnis Rezeptor-Ligand-Beziehungen und nachgeschalteten Signalkaskaden in spezifischen VSN Populationen ist eine detaillierte Bewertung ihrer grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften in einer natürlichen Umgebung. In der Vergangenheit hat die Analyse von zellulären Signal stark von gentechnisch veränderten Tieren zugute , die eine definierte Population von Neuronen durch Koexpression ein fluoreszierendes Markerprotein 30,44-49 markieren. In diesem Protokoll eine transgene Mauslinie, die FPR-RS3 zusammen mit einem fluoreszierenden Marker (fPr-RS3-i-Venus) wird zum Ausdruck verwendet.Dieser Ansatz zeigt, wie eine solche genetisch veränderten Mausstamm zu verwenden, um durchführen elektro Analyse einer optisch erkennbaren Zellpopulation mit einzelnen Neurons Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten koronaren VNO Gewebeschnitten. Ein Luftdruck getriebene Mehr barrel Perfusionssystem für Sinnesreize und pharmakologische Mittel ermöglicht eine schnelle, reversible und fokale neuronale Stimulation oder Hemmung während Aufnahmen. Ganzzellableitungen in Schnittpräparaten ermöglichen eine detaillierte Analyse der Eigenschaften, der spannungsaktivierte Leitwerte sowie Aktionspotential Entladungsmuster in der natürlichen Umgebung der Zelle.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (niedrige Geliertemperatur)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrogencarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare<</td></tr><tr><td>strong>Chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien</td>Große Petrischale, 90 mm VWR-Enthauptung, Dissektion der VNO-Kapsel <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Kleine Petrischale, 35 mm VWR-Deckel für VNO-Dissektion, Schale zum Einbetten in Agarose <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scharfe große chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Enthauptung, Entfernung des Unterkiefers</td></tr><tr><td>Starke Knochenschere</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Schneideschneidezähne</td></tr><tr><td>Mittlere Pinzette, Dumont Pinzette #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>zum Entfernen von Haut und Gaumen</td></tr><tr><td>Mikrofederschere, 8,5 cm, gebogen, 7 mm Klingen&nbsp;</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td></td><td>ohne VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>Zwei Paar feine Pinzetten, Dumont Pinzette #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>zum Präparieren von VNO aus knorpeliger Kapsel</td></tr><tr><td>Kleiner Spatel aus Edelstahl</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>für den Umgang mit Agaroseblöcken und Gewebescheiben</td></tr><tr><td>Chirurgisches Skalpell</td><td></td><td></td>, <td>das Agaroseblöcke in pyramidenförmige Form</td></tr> <tr><td>schneidetName</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas (1,50 mm OD/0,86 mm ID)</td><td>Wissenschaft Produkte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filterwürfel, Anregung: BP 450-490, Entstörung: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstofflampe</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte Magnetrührer</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator-Gerät&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher, vertikal zweistufig</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Noise Eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Wissenschaftliches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziel&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionssystem 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät fünf einfache</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-Vorratsdose</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Aufnahmekammer&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice Mini Chamber</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffhaltige Scheibenaufbewahrungskammer; alternative Handelskammern sind: z.B. , BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) oder die Vorkammer (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>maßgefertigtes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger-Schnittstelle&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

in eingehenden physiologische analyse definierter zellpopulationen bei der akuten gewebeschnitten der maus vomeronasalorgans

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Bei den meisten Säugetieren ist das vomeronasale Organ (VNO) eine chemosensorische Struktur, die sowohl hetero- als auch konspezifische soziale Signale erkennt. Vomeronasale sensorische Neuronen (VSNs) exprimieren einen spezifischen Typ von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) aus mindestens drei verschiedenen Chemorezeptor-Genfamilien, was eine empfindliche und spezifische Detektion chemosensorischer Signale ermöglicht. Zu diesen Familien gehören die Genfamilien V1r und V2r sowie die Familie der formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) putativer Chemorezeptor-Gene. Um die Physiologie der vomeronasalen Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen und der nachgeschalteten Signalübertragung zu verstehen, ist es wichtig, die biophysikalischen Eigenschaften zu identifizieren, die jeder spezifischen Klasse von VSNs inhärent sind.
Der hier beschriebene physiologische Ansatz ermöglicht die Identifizierung und eingehende Analyse einer definierten Population von sensorischen Neuronen anhand einer transgenen Mauslinie (Fpr-rs3-i-Venus). Die Verwendung dieses Protokolls ist jedoch nicht auf diese spezielle Linie beschränkt und kann daher leicht auf andere gentechnisch veränderte Linien oder Wildtyp-Tiere ausgeweitet werden.

Um einen Einblick in die biophysikalischen und physiologischen Eigenschaften von definierten Zellpopulationen zu gewinnen, führen wir akuten koronaren Gewebeschnitten der Maus VNO (Abbildung 1 - 2). Nach der Dissektion Scheiben können in eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung (S 2) für mehrere Stunden gehalten werden. Bei der Aufnahme - Setup, ein ständiger Austausch mit frischem Sauerstoff angereicherten Lösung (...

Hier beschreiben wir einen physiologischen Ansatz, der die Identifizierung und eingehende Analyse einer definierten Population von sensorischen Neuronen in akuten koronalen Gewebeschnitten des vomeronasalen Organs der Maus unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ermöglicht.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Einzelzell-Elektrophysiologie-Analyse einer definierten Population sensorischer Neuronen in akuten Gewebeschnitten aus dem Vomeronasalorgan der Maus durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Chemosensorik zu klären, beispielsweise die Mechanismen der chemischen Detektion ohne Sehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Ableitung von sensorischen Neuronen in akuten Gewebeschnitten diese Zellen in ihrem nativen Milieu untersucht werden können.Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie nach der Tötung des Tieres den Unterkiefer, indem Sie ein Paar großer chirurgischer Scheren durch die Mundhöhle einführen und die Unterkieferknochen und Muskeln jeder Seite separat durchtrennen. Entfernen Sie anschließend mit einer mittleren Pinzette die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze, um besser an die Schneidezähne heranzukommen. Schneiden Sie dann mit der Knochenschere unter einem Winkel von 45 Grad in rostraler Richtung den größten Teil der Schneidezähne ab, um die Entfernung der VNO-Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern.Schneiden Sie die Wurzel des Zahns nicht ab, um eine Beschädigung der Spitze der VNO-Kapsel zu vermeiden. Danach greifen Sie mit mittleren Pinzetten den harten oberen Gaumen an seinem rostralen Teil und lösen ihn vorsichtig in einem Stück unter flachem Winkel ab. Spülen Sie die Nasenhöhle wiederholt mit eiskalter Lösung S2 aus. Anschließend schneiden Sie mit Mikro-Federschere die Knochenanhängsel zwischen der Spitze des Pflugschaufelbeins und dem Kiefer durch.Führen Sie die Scherenspitzen ein, wobei der gebogene Teil von der VNO wegzeigt. Schneiden Sie vorsichtig in kleinen Schritten das Knochengewebe auf der linken und rechten Seite lateral zur VNO-Kapsel durch. Um die VNO-Kapsel zu entfernen, durchtrennen Sie das Vomerbein im kaudalen Bereich und heben Sie das Vomerbein vorsichtig mit einer mittleren Pinzette aus der Nasenhöhle heraus.Überführen Sie das VNO unverzüglich in eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Kühlgelpack, wo die verbleibenden Schritte der Dissektion durchgeführt werden sollten. Spülen Sie anschließend das VNO mit einer geringen Menge eiskalter S2-Lösung, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet. Trennen Sie danach die knorpeligen Kapseln, die das weiche VNO-Gewebe enthalten, indem Sie mit mittleren Pinzette das hintere Ende des Pflugscharbeins ergreifen.Dazu positionieren Sie die Kapsel so für eine dorsale Ansicht, dass eine Trennung zwischen beiden VNOs sichtbar wird. Benutzen Sie die Spitze einer feinen Pinzette, um beide knorpeligen VNO-Kapseln vom zentralen Knochen zu lösen, wobei das Vomerbein im hinteren Bereich fixiert bleibt. Achten Sie darauf, dass die zuvor mit dem Vomerbein verbundene mediale Knorpelwand entfernt wird.Beim Entfernen des Knorpels um das VNO verwenden Sie die Pinzette nur am Rand der Knorpelkapsel. Achten Sie sorgfältig darauf, das empfindliche sensorische Epithel nicht zu beschädigen. Um verbliebenen Knorpel zu entfernen, drehen Sie das VNO mit seiner gekrümmten lateralen Seite nach unten auf den Boden der Schale und fixieren Sie den Knorpel auf einer Seite mithilfe der Pinzette sicher. Bewegen Sie dann vorsichtig die zweite feine Pinzette von der Rückseite aus in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO, um die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lösen. Um das sensorische Epithel nicht zu beschädigen, lösen Sie das VNO langsam vom Knorpel, indem Sie es an seiner kaudalen Spitze halten. Sobald das VNO aus der Kapsel gelöst ist, entfernen Sie alle verbleibenden kleinen Knorpelteile, da sonstige Knorpelreste das Gewebe während des Schneidens von der umgebenden Agarose ablösen könnten.Als Nächstes einen kleinen Tropfen eiskalte S2-Lösung auf das erste präparierte VNO geben, um Gewebeschäden zu verhindern. Um die VNOs einzubetten, beide kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzener S3-Lösung füllen. Danach jedes VNO in die Agarose eintauchen und mehrmals horizontal hin und her bewegen, um den Film der extrazellulären Lösung sowie eventuelle Luftblasen von der Oberfläche zu entfernen. Das VNO vertikal ausrichten, wobei die rostrale Spitze auf den Boden der Schale zeigt.Stellen Sie anschließend beide Schalen auf einen Gelpack mit Kühlakkus und warten Sie, bis sich das Agarose verfestigt hat. Ändern Sie die Orientierung des VNO nicht mehr, sobald die Agarose zu erstarren beginnt, da dies das Gewebe von der umgebenden Agarose lösen würde. Entfernen Sie in diesem Verfahren den Agaroseblock mit einem kleinen Spatel aus der kleinen Schale und legen Sie ihn in den Deckel einer großen Petrischale, wobei Sie den Agaroseblock umdrehen, sodass die rostrale Spitze des VNO nach oben zeigt.Schneiden Sie als Nächstes den Block mit einem chirurgischen Skalpell in eine pyramidenförmige Form und achten Sie darauf, das eingebettete Gewebe nicht zu beschädigen. Befestigen Sie dann den pyramidenförmigen Block mit Sekundenkleber in der Mitte der Vibratomschneideplatte und warten Sie etwa eine Minute, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.Schneiden Sie die Probe in Abschnitte mit einer Dicke von 150 bis 200 Mikrometern. Überprüfen Sie kurz die Morphologie der Schnitte unter dem Stereomikroskop. Überführen Sie anschließend alle Schnitte in die Sauerstoffkammer, bis sie verwendet werden.In diesem Schritt überführen Sie eine VNO-Schnittstelle in die Bildgebungskammer und fixieren die Position der Schnittstelle mit einem Edelstahlanker, der mit synthetischen Fasern von einem Millimeter Dicke verdrahtet ist. Bedecken Sie die Gewebeschnittstelle nicht mit den synthetischen Fasern. Überführen Sie anschließend die Bildgebungskammer in die Aufzeichnungseinrichtung und spülen Sie die Schnittstelle kontinuierlich bei Raumtemperatur mit oxygeniertem S2 durch.Stellen Sie die Saugkapillare an der Oberfläche der Lösung so ein, dass ein konstanter Austausch der Badlösung erfolgt. Danach positionieren Sie den Acht-in-eins-Mehrfach-Perfusionsstift oberhalb und nahe dem nicht-sensorischen Teil des VNO-Schnitts, der das Blutgefäß enthält. Anschließend verbinden Sie die Referenzelektrode und die Badlösung mithilfe der L-förmigen Agarbrücke, die mit 150 Millimolar Kaliumchlorid gefüllt ist.Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit der Pipettenlösung S4. Bringen Sie die Pipette über der mit Silberchlorid beschichteten Elektrode an, die mit der Kopfstufe verbunden ist, ohne die Beschichtung abzukratzen, und befestigen Sie sie fest. Anschließend wird ein leichter positiver Druck auf die Patch-Pipette ausgeübt, bevor sie in das Bad eintaucht. Überwachen Sie die Pipette und stellen Sie sicher, dass ihr Widerstand zwischen vier Megaohm und 10 Megaohm liegt.Visualisieren Sie den VNO-Schnitt mit einer CCD-Kamera unter Verwendung von auf Infrarot optimiertem DIC und identifizieren Sie FPR-rs3 i-Venus exprimierende Zellen oder ähnlich markierte Neuronen mithilfe von Fluoreszenzbeleuchtung und einem geeigneten Filterwürfel. Nähern Sie sich dem Zellkörper mit den Handrädern für maximale Empfindlichkeit. Aufgrund des positiven Drucks wird eine kleine Delle auf der Zellmembran sichtbar, sobald sich die Pipettenspitze in unmittelbarer Nähe befindet.Danach wird der positive Druck abgelassen und leichter Unterdruck angewendet, um die Zellmembran einzusaugen und einen Hochwiderstandskontakt von ein bis 20 Gigohm zu erzielen. Anschließend wird kurz und vorsichtig gesaugt, um die Zellmembran zu durchbrechen und die Ganzzell-Konfiguration herzustellen. In dieser Abbildung zeigt ein konfokales Bild eines koronalen VNO-Gewebeschnitts die Verteilung fluoreszierender FPR-rs3 Tau Venus-positiver Neuronen im vomeronasalen sensorischen Epithel.Die FPR-rs3 Tau Venus-positiven Neurone weisen einen einzelnen apikalen Dendriten auf, der in einer knobenartigen Struktur an der luminalen Grenze endet. Dargestellt sind hier Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen, die am VSN-Soma durchgeführt wurden. Hier sind repräsentative Spuren aus Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen eines TTX-sensitiven, schnell aktivierenden Natriumstroms und FPR-rs3-positiver VSNs.Spannungsschritt-Aufnahmen unter Kontrollbedingungen zeigen einen spannungsabhängigen, schnellen und transienten einwärts gerichteten Strom. Die Behandlung mit TTX bei einer Konzentration von einem Mikromolar verringert den Strom stark. Und die hier dargestellte digital subtrahierte Spur zeigt den TTX-sensitiven, spannungsabhängigen Natriumstrom.Die repräsentativen Stromklemm-Aufnahmen zeigen Depolarisation und Hyperpolarisation sowie Aktionspotenzialserien, die durch schrittweise positive und negative Strominjektion ausgelöst werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann der gesamte Prozess aus Dissektion und Gewebeschnitten für beide VNOs innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie extrazelluläre Loose-Patch-Aufnahmen oder Calcium-Imaging angewendet werden, um die Durchsatzrate bei der Analyse größerer Neuronenpopulationen zu erhöhen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute Gewebeschnitte aus dem Vomeronasalorgan des Mundes herstellt und wie man elektrophysiologische Einzelzellableitungen von Vomeronasalsinnesneuronen durchführt.

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt Intraspezies chemischen Signalen, die sozialen und reproduktiven Informationen zu vermitteln. Wir haben Ca2 +-Imaging durchgeführt Experimente mit transgenen Mäusen, die G-camp2 in VNO Gewebe. Dieser Ansatz erlaubt es uns, die komplizierten Reaktionsmuster des vomeronasalen Neuronen eine große Anzahl von Pheromon-Stimuli zu analysieren.

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Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

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Dieser Artikel bietet ein optimiertes Protokoll für die Dissektion und Dissoziation von murinem Geruchsepithel zum Zwecke der Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

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