Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Affinity Capture Protocol ist es, endogene Proteinkomplexe aus Säugetierzellen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zell- und Molekularbiologie zu beantworten, etwa welche Proteine sich zu physikalisch verknüpften Funktionsmodulen zusammenschließen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass zahlreiche physikalische Wechselwirkungen, die mit dem Zielprotein von Interesse verbunden sind, gleichzeitig beobachtet werden können.

Züchten Sie ein bis acht Gramm Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Gieße das Wachstumsmedium in ein großes Becherglas ab. Stellen Sie dann die Kulturschale auf Eis in eine große rechteckige Eispfanne.

Geben Sie 20 Milliliter eiskalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Kulturschale und lösen Sie die Zellen mit einem großen Zellschaber aus der Schale. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis vorgekühlt ist. Geben Sie weitere 10 Milliliter eiskaltes 1x PBS in das gleiche Gericht.

Sammeln Sie die restlichen Zellen und geben Sie sie in das 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Gericht. Zellsuspensionen aus verschiedenen Schalen können kombiniert werden, um die Probenzahl und den Plastikmüll zu reduzieren.

Anschließend zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 1.000 x g bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig abgießen. Resuspendieren Sie jedes Pellet in zehn Millilitern eiskaltem 1x PBS.

Konsolidieren Sie die resuspendierten Pellets mit bis zu fünf pro 50-Milliliter-Tube. Waschen Sie die leeren Tuben mit 10 Millilitern PBS. Geben Sie die Lösung zu den konsolidierten Proben und zentrifugieren Sie wie zuvor.

Nach dem Entfernen des Überstands das Pellet in 10 Millilitern eiskaltem 1x PBS resuspendieren. Nehmen Sie den Kolben aus einer 20-Milliliter-Spritze und legen Sie ihn beiseite. Verschließen Sie die Düse der Spritze, legen Sie die Spritze in ein 50-Milliliter-Röhrchen und übertragen Sie die Zellsuspension dorthin.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1000 x g, vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette mit feiner Spitze, die an einem Vakuumfallensystem befestigt ist, bis die oberste Zellschicht aufgesaugt wird. Das Ergebnis ist ein Nasszellen-Pellet.

Öffnen Sie die Kappe der Spritze, setzen Sie den Kolben ein und tropfen Sie die Zellen direkt in ein großes Plastikbecherglas, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist und in einem Flüssigstickstoffbad in einer Styroporbox gehalten wird. Tauchen Sie die restlichen Zellen gewaltsam aus der Spritze. Gießen Sie anschließend die gefrorenen Zellen in 50-Milliliter-Röhrchen.

Verschließen Sie die Röhrchen locker, damit überschüssiger flüssiger Stickstoff verdampfen kann. Lagern Sie sie über Nacht bei 80 Grad Celsius. Ziehen Sie die Verschlüsse am nächsten Tag vollständig fest.

Die gefrorenen Zellen können auf diese Weise bei 80 Grad Celsius bis zur Kryomahlung gelagert werden. Nehmen Sie die Zellkügelchen aus dem 80 Grad Celsius Gefrierschrank und legen Sie sie in einen 50-Milliliter-Röhrchenhalter in ein Flüssigstickstoffbad. Kühle ein 50-Milliliter-Glas, zwei 20-Millimeter-Kugeln und den Glasdeckel in einem sauberen, rechteckigen Eiskübel mit flüssigem Stickstoff vor.

Kühlen Sie außerdem einen PTFE-Isolator vor. Verwende entweder einen Satz Pucks oder einen Sleeve-and-Puck. Stellen Sie das entsprechende Gegengewicht auf die Fräse.

Legen Sie mit einer Pinzette die beiden vorgekühlten 20-Millimeter-Mahlkugeln und die gefrorenen Zellen in das vorgekühlte Mahlglas. Geben Sie flüssigen Stickstoff in das bis zur Hälfte gefüllte Glas, setzen Sie den Deckel auf das Glas und übergeben Sie die Montage in die Mühle. Klemmen Sie die Baugruppe fest und führen Sie drei Fräszyklen mit einem Programm von 400 U/min, drei Minuten, einer Rückwärtsdrehung pro Minute und ohne Intervallunterbrechung durch.

Es ist wichtig, die Kugeln während des Mahlens rasseln zu hören, dies deutet darauf hin, dass die Kugeln kollidieren und das Material pulverisieren. Wenn Sie dieses Geräusch nicht hören, bedeutet dies, dass kein Fräsen stattfindet. Bewegen Sie das Glas nach Abschluss von drei Mahlzyklen wieder auf flüssigen Stickstoff und lassen Sie es kurz abkühlen.

Nehmen Sie den Deckel vorsichtig ab. Entfernen Sie die Kugeln mit einer Pinzette und geben Sie das Pulver mit einem vorgekühlten Spatel in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Zugabe von flüssigem Stickstoff in das Glas dazu beitragen kann, Pulver zu entfernen, das auf den Kugeln verkrustet ist.

Wiegen Sie für die Herstellung von Zellextrakten 100 Milligramm Zellpulver in ein vorgekühltes 1,5- oder Zwei-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen ab. Tarieren Sie eine Analysenwaage mit dem leeren Mikrofugenröhrchen. Geben Sie das Zellpulver mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Löffel oder Spatel in das Röhrchen.

Überprüfen Sie die Masse des im Röhrchen abgegebenen Pulvers auf der Analysenwaage, bevor Sie das Röhrchen wieder in flüssigen Stickstoff umwandeln. Öffnen Sie das Röhrchen mit dem Zellpulver und lassen Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur stehen, um den Druck im Röhrchen abzulassen und ein sofortiges Einfrieren des Extraktionspuffers zu verhindern, wenn er dem Pulver zugesetzt wird. Geben Sie 400 Mikroliter Extraktionsmittel, ergänzt mit Proteasehemmern, in das Röhrchen.

Wirbeln Sie das Rohr kurz vor und halten Sie es dann auf Eis. Verwenden Sie ein Ultraschallgerät mit Mikrospitze, um der Probe einen kurzen Impuls mit niedriger Energie zu geben und alle Aggregate zu dispergieren. Klären Sie den Extrakt durch Zentrifugation.

Entfernen Sie abschließend den Überstand und fahren Sie mit der Affinitätserfassung fort. Um das Affinitätsmedium vorzuwaschen, legen Sie die Röhrchen mit antikörpergekoppelten paramagnetischen Kügelchen auf den Magneten. Die Kügelchen sammeln sich innerhalb von Sekunden an der Seite der Tube an, so dass die Aufbewahrungslösung entfernt werden kann.

Geben Sie dann 500 Mikroliter Extraktionspuffer zu den Kügelchen. Zum Mischen kurz bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen. Drehen Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge, um den gesamten Inhalt auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln.

Legen Sie dann die Röhrchen auf den Magneten und saugen Sie die Lösung an. Initiieren Sie die Affinitätserfassung, indem Sie den geklärten Zellextrakt kurz in die Röhrchen mit dem vorgewaschenen Affinitätsmedium und dem Vortex übertragen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit kontinuierlichem, sanftem Mischen auf einem Rotatorrad.

Die Kügelchen sollten während der gesamten Inkubation in der Schwebe bleiben. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter Kaltextraktionspuffer. Um die Proteine zu eluieren, fügen Sie SDS-Seiten-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel hinzu, um die Freisetzung von Antikörperketten aus den Kügelchen zu verringern.

Fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren. Sammeln und bewahren Sie den Überstand auf, dann unterziehen Sie die Proben einer SDS-Seite, gefolgt von einer Proteinfärbung mit Standardtechniken. Einzelne Proteinbanden können zur Identifizierung herausgeschnitten werden, oder die gesamte Probe kann in einer einzigen Analyse charakterisiert werden, indem die Probe nur kurz elektrophoresiert wird.

Das Material, aus dem das unlösliche Medium besteht, das für die Affinitätserfassung verwendet wird, kann das wiederhergestellte Proteom beeinflussen. Hier sind magnetische Kügelchen, eisenimprägnierte Agarose und traditionelle Agarose zu sehen. Jedes Medium wurde an anti-FLAG M2-Antikörper gekoppelt und verwendet, um FLAG-markierte bakterielle alkalische Phosphatase einzufangen, die in Extrakten aus kryogemahlenen HEK 293-Zellen gespickt wurde.

Magnetische Kügelchen im Mikrometerbereich zeigten das sauberste Profil, was auf ein relativ geringes Maß an unspezifischer Proteinadsorption hinweist. Die Methode der Zelllyse kann auch das wiedergewonnene Proteom beeinflussen. Hier wurde ein endogener Proteinkomplex einem Affinitäts-Capture aus kryogemahlenen oder beschallten Zellextrakten unterzogen.

Weniger Massenverunreinigungen wurden beobachtet, wenn der Zellextrakt aus kryogemahlenem Zellpulver hergestellt wurde. Auch wenn magnetische Medien einen geringeren Hintergrund aufweisen können als andere Medien, kann der Antikörper selbst die Adsorption falsch positiver Kontaminationen erleichtern, insbesondere in Abwesenheit seines Zielantigens. Um die Hintergrundbindung zu bestimmen, die durch das magnetische Anti-FLAG-Medium beigesteuert wird, wenn Antikörper-Paratope besetzt sind oder nicht, wurden Mock-Affinity-Capture-Experimente mit HEK 293T-Zellextrakten in Gegenwart oder Abwesenheit eines 3x FLAG-Peptid-Spike-ins durchgeführt.

In Abwesenheit seines verwandten Epitops fängt das alpha FLAG-Medium eine nachweisbare Menge an Hintergrundproteinen ein, die kompetitiv mit dem 3x FLAG-Peptid umgangen und in größerem Maße durch SDS-Seiten-Probenpuffer umgangen werden können. Eine dominante Schadstoffspezies wurde bei 37 bis 50 Kilodalton beobachtet. In Gegenwart eines konkurrierenden Epitops sind sowohl 3x-FLAG- als auch SDS-basierte Elutionen vergleichbar frei von Hintergrundproteinbindungen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig, schnell und präzise zu arbeiten. Behalten Sie den Überblick über Ihre Verfahren und alle beobachteten Abweichungen, um zu erfahren, welche Schritte für Ihre Ergebnisse am wichtigsten sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Massenspektrometrie, ratenzonale Zentrifugation und Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, um die Zusammensetzung des Gemisches, seinen Homogenitätsgrad sowie die Größe und Form der makromolekularen Komplexe, aus denen er besteht, zu analysieren.

Nach seiner Entwicklung ebnete die Affinitätserfassung den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteomik, um die Zusammensetzung physiologischer Proteinkomplexe in beispielloser Detailgenauigkeit zu erforschen, was nach wie vor eine fortlaufende globale Forschungsanstrengung ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Säugetierzellen für die Kryomahlung vorbereitet und wie man die Affinitätserfassung eines Proteins von Interesse durchführt.