Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt, Mittelmeerfruchtfliege

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Nukleinsäuren in die Embryonen von Ceratitis Capitata, einem wichtigen landwirtschaftlichen Schädling, zu bringen, um letztendlich den Werkzeugkasten für seine Bekämpfung zu erweitern. Diese Methode hilft bei der funktionellen Korrektur von Genen in einem immobilen Organismus sowie bei der Erzeugung transgener Stämme. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine sehr geringe Menge an Nukleinsäuren injiziert wird, um die gewünschten Effekte zu erzielen.

Halten Sie alle Lebensstadien der Medfly-Kolonie bei 25 Grad Celsius mit 65% Luftfeuchtigkeit und einer 12-stündigen Hell-/Dunkel-Photoperiode mit einer Photophase ab 8 Uhr morgens. Führen Sie einen Schwammstreifen durch eine kleine Öffnung im Boden des Käfigs ein, um die Fliegen durch Kapillarwirkung mit Wasser zu versorgen. Sie richten einen Sechs-Liter-Käfig ein und beladen ihn mit 1.500 bis 2.000 Puppen.

Beladen Sie den Käfig mit etwa 45 Gramm einer Mischung aus Hefe und Zucker von ein bis 10 Gramm. Um Eier zu sammeln, stellen Sie einen mit Wasser gefüllten Teller unter den Käfig. Die Weibchen legen Eier durch das Netz ab, die sich dann im Wasser sammeln.

Da jungfräuliche Weibchen Eizellen setzen können, stellen Sie sicher, dass die Eier alle befruchtet sind, indem Sie warten, bis die Fliegen mindestens eine Woche alt sind, bevor Sie Eier sammeln. Um Eier zu sammeln, filtrieren Sie das Wasser mit einem feinen Sieb. Übertragen Sie dann die Eier mit einer Pasteuralpipette in eine Plastikbox, die mit etwa 0,5 Litern Standardlarvenfutter beladen ist.

Wenn nicht genügend Eier gelegt wurden, erhöhen Sie den Hefegehalt des Futters des Erwachsenen auf bis zu 25 %Legen Sie jede Schachtel in einen durchsichtigen Behälter, der eine Schicht Kleie enthält, um die Verpuppung zu begünstigen. Decken Sie den Behälter mit einem Netzdeckel ab, um die Luftzirkulation zu ermöglichen. Überprüfen Sie nach etwa 10 Tagen auf Larven des dritten Stadiums, die zur Verpuppung in die Kleieschicht gesprungen sind.

Sobald Sie es gefunden haben, bereiten Sie sich darauf vor, an den folgenden Tagen nach Puppen zu suchen. Um die Puppe zu sammeln, fegen Sie sie mit einer weichen Bürste aus dem Behälter. Sammeln Sie zunächst die Puppen in einem kleinen Becher.

Nachdem die Entnahme abgeschlossen ist, setzen Sie die Puppen in einen neuen Käfig für erwachsene Tiere um. Die erwachsenen Tiere sollten in etwa 10 Tagen schlüpfen. Für die Mikroinjektion sollten Sie im Voraus Objektträger vorbereiten.

Befestigen Sie einen zwei Zentimeter langen Streifen doppelseitiges Klebeband an einem Objektträger und markieren Sie die Ränder mit einem Porzellanmarker, um eine Wand für eine Ölschicht zu bilden, die die Embryonen mit Feuchtigkeit versorgt. Um frisch gelegte Embryonen zu entnehmen, lassen Sie junge befruchtete Weibchen 30 Minuten lang auf einer neuen Schale eizellen ablegen und entnehmen Sie dann die Embryonen. Um das Chorion aus den Embryonen zu entfernen, tauchen Sie das Sieb und die Eier fünf Sekunden lang in eine handelsübliche 50%ige Bleichlösung.

Es ist wichtig, die Embryonen nicht zu stark zu bleichen. Waschen Sie die gebleichten Embryonen sofort, indem Sie das Sieb vorsichtig in sauberes, ultrareines Wasser tauchen. Tun Sie dies mindestens viermal.

Bewahren Sie dann das Sieb in klarem, reinstem Wasser auf und injizieren Sie die Embryonen innerhalb von zwei Stunden. Als nächstes sammeln Sie mit einem feinen Pinsel etwa 50 Embryonen und legen sie auf eine Scheibe aus schwarzem Filterpapier, die mit Wasser getränkt ist. Rudern Sie die Embryonen unter einem Präparier-Stereomikroskop auf das doppelseitige Klebeband eines präparierten Objektträgers.

Richten Sie alle Embryonen in die gleiche Richtung aus. Es ist wichtig, die Embryonen vorsichtig zu manipulieren, da das Durchstechen der Embryonalmembran mit dem Pinsel Schäden verursachen kann, die das Überleben des Embryos verringern. Bedecken Sie nun die Embryonen mit einer Schicht Chlor-Trifloro-Etholene-Öl.

Das Öl sollte an den Grenzen der Porzellanmarkierung enthalten sein. Überlaufen Sie nicht die Ränder. Befüllen Sie die Injektionsnadel mit einer Mikropipette mit einigen Mikrolitern Nukleinsäurelösung in einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter.

Verbinden Sie dann die Nadel mit dem Mikroinjektionsgerät und stellen Sie es so ein, dass es eine halbe Sekunde lang bei 800 Hektopascal und einem Gegendruck von 150 Hektopascal einspritzt. Verwenden Sie zum Injizieren einen Fußpedalauslöser und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel zu steuern, während Sie die Stage-Regler verwenden, um den Schieber zu bewegen. Vergewissern Sie sich, dass der Injektionsbolus richtig ausgestoßen wird, und richten Sie die Nadel dann auf den hinteren Pol des ersten Embryos in der Reihe aus.

Indem Sie den Tisch bewegen, führen Sie die Nadel in den Embryo ein und injizieren Sie den Bolus aus Nukleinsäuren. Die injizierte Flüssigkeit induziert einen Anstieg des Innendrucks, was zu einer leichten Bewegung des Embryos führt. Lassen Sie das Pedal los und entfernen Sie die Nadel sofort, aber vorsichtig aus dem Embryo.

An der Injektionsstelle tritt ein wenig Zytoplasma aus. Das ist normal. Wenn die Embryonen durch die Injektion platzen, lassen Sie die Embryonen einige Minuten trocknen, bevor Sie sie mit Öl bedecken.

Übertragen Sie den Objektträger nach der Injektion in eine Petrischale. Legen Sie eine Scheibe Filterpapier in den Deckel der Schale. Tränken Sie den Filter mit Wasser und verschließen Sie die Petrischale mit Paraffinfolie.

Inkubieren Sie die Kammer bei 25 Grad Celsius. Kontrollieren Sie zwei Tage nach der Injektion die Objektträger mehrmals am Tag auf geschlüpfte Larven. Suchen Sie im Öl nach Larven und geben Sie sie mit einem feinen Pinsel in eine Petrischale mit Larvenfutter auf Karottenbasis.

Befüllen Sie jede Schale mit bis zu 200 Larven. Die Larve kann im Öl nicht lange überleben, also oft suchen. Bruten Sie die Larven mit meist geschlossenem Deckel aus, damit die Larven noch Luft strömen können.

Überprüfen Sie das Geschirr täglich und bereiten Sie sich nach einer Woche auf das Sammeln von Larven vor, indem Sie das Geschirr in einen Behälter mit Kleie legen. Sammeln Sie die Puppen und erwarten Sie bald, dass sie schlüpfen. Später betäuben Sie geschlüpfte Erwachsene mit Kohlendioxid und untersuchen sie auf Transformation.

Beim Screening kann diese Mobilisierungsmethode entscheidend sein. Medfly-Erwachsene können mit Eis oder CO2 betäubt werden, aber eine längere Exposition kann das Überleben anderer verringern. Überprüfen Sie, ob rote Fluoreszenz mit einem DS Rot-Breitfilter

Oder prüfen Sie die grüne Fluoreszenz mit einem EYFP-Filter. Bringen Sie die transformierten Individuen in einen kleinen Käfig mit Wildtyp-Erwachsenen des anderen Geschlechts, um einen heterozygoten Stamm zu etablieren. In einem Experiment wurde doppelt gestreckte RNA verwendet, um die inx5-Genexpression zum Schweigen zu bringen.

Die adulte Keimbahn der nicht injizierten Kontrollen scheint wie erwartet normal zu sein, während die behandelten Personen unterentwickelte Hoden und Eierstöcke aufwiesen. Die Quantifizierung der Inx5-Transkripthäufigkeit im Abdomen von Individuen beiderlei Geschlechts bestätigte die signifikant geringere Expression des Gens im Vergleich zu den Kontrollen. In einem zweiten Experiment wurden zwei Stämme mit markierten Spermien unter Verwendung des Beta-2-Tubulin-Promotors erzeugt, um verschiedene Fluoreszenzmarker anzutreiben.

Transgene Männchen zeigten ein ausgeprägtes Fluoreszenzmuster im Körper und in den Hoden. Mit diesem Video stellen wir unsere optimierten Protokolle für die Aufzucht und Mikroinjektion von Nukleinsäuren in medfly-Embryonen vor. Sobald sie gemeistert sind, können bis zu 1.000 Embryonen an einem achtstündigen Arbeitstag injiziert werden.

Nach diesem Verfahren können andere Metalle wie thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine durchgeführt werden, um eine neue Generation von Medfly-Stämmen zu entwickeln.