Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Nukleinsäuren in die Embryonen von Ceratitis capitata, einem bedeutenden landwirtschaftlichen Schädling, einzubringen, um letztendlich die Methoden zur Bekämpfung dieses Organismus zu erweitern. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Korrektur von Genen in einem immobilisierten Organismus sowie die Erzeugung transgener Stämme. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sehr geringe Mengen an Nukleinsäuren injiziert werden müssen, um die gewünschten Effekte zu erzielen.

Halten Sie alle Entwicklungsstadien der Mittelmeerfruchtfliege bei 25 Grad Celsius mit 65 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-Licht-/12-Stunden-Dunkel-Photoperioden aufrecht, wobei die Lichtphase um 8 Uhr morgens beginnt. Führen Sie einen Schwammband durch eine kleine Öffnung im Boden des Käfigs ein, um den Fliegen Wasser durch Kapillarwirkung bereitzustellen. Richten Sie einen sechs Liter fassenden Käfig ein und befüllen Sie ihn mit zwischen 1.500 und 2.000 Puppen.

Für die Nahrung füllen Sie den Käfig mit etwa 45 Gramm einer Mischung aus Hefe und Zucker im Verhältnis 1 zu 10. Um Eier zu sammeln, stellen Sie eine mit Wasser gefüllte Platte unter den Käfig. Die Weibchen legen die Eier durch das Netz, wo sie anschließend im Wasser gesammelt werden.

Da unbefruchtete Weibchen Eier ablegen können, stellen Sie sicher, dass alle Eier befruchtet sind, indem Sie warten, bis die Fliegen mindestens eine Woche alt sind, bevor Sie die Eier sammeln. Um die Eier zu sammeln, filtrieren Sie das Wasser mit einem feinen Sieb. Überführen Sie die Eier dann mit einer Pasteur-Pipette in eine Plastikbox, die mit etwa 0,5 Litern Standard-Larvennahrung gefüllt ist.

Wenn nicht genügend Eier gelegt wurden, erhöhen Sie den Hefegehalt der Nahrung der erwachsenen Tiere bis auf 25 %. Stellen Sie jeden Behälter in einen transparenten Behälter, der eine Schicht Kleie enthält, um die Verpuppung zu begünstigen. Decken Sie den Behälter mit einem Netzdeckel ab, um eine Luftzirkulation zu ermöglichen. Überprüfen Sie nach etwa 10 Tagen, ob sich Larven im dritten Larvenstadium in die Kleieschicht zum Verpuppen hineingeworfen haben.

Wenn sie gefunden wurden, bereiten Sie sich darauf vor, in den folgenden Tagen auf Puppen zu prüfen. Um die Puppe zu sammeln, verwenden Sie einen weichen Pinsel, um sie aus dem Behälter zusammenzukehren. Sammeln Sie die Puppen zunächst in einem kleinen Becher.

Nach Abschluss der Sammlungen überführen Sie die Puppen in einen neuen Erwachsenenkäfig. Die Erwachsenen sollten in etwa 10 Tagen schlüpfen. Für die Mikroinjektion bereiten Sie Objektträger im Voraus vor.

Befestigen Sie einen zwei Zentimeter langen Streifen doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger und markieren Sie die Ränder mit einem Porzellanstift, um eine Wand für eine Ölschicht zu schaffen, die die Embryonen feucht hält. Um frisch gelegte Embryonen zu sammeln, lassen Sie junge befruchtete Weibchen 30 Minuten lang auf einer neuen Schale Eier ablegen und sammeln Sie anschließend die Embryonen. Um die Chorionhülle von den Embryonen zu entfernen, tauchen Sie das Sieb mit den Eiern fünf Sekunden lang in eine handelsübliche 50 %ige Bleichmittel-Lösung ein.

Es ist entscheidend, die Embryonen nicht zu stark zu bleichen. Spülen Sie die gebleichten Embryonen sofort, indem Sie das Sieb vorsichtig in sauberes, ultrareines Wasser eintauchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens viermal.

Danach den Sieb in klarem, ultrareinem Wasser aufbewahren und die Embryonen innerhalb von zwei Stunden injizieren. Anschließend mit einem feinen Pinsel etwa 50 Embryonen sammeln und auf eine mit Wasser getränkte Scheibe schwarzen Filterpapiers legen. Unter einem Stereomikroskop die Embryonen auf das doppelseitige Klebeband einer vorbereiteten Objektträgerplatte ausrichten.

Orientieren Sie alle Embryonen in dieselbe Richtung. Es ist wichtig, die Embryonen vorsichtig zu manipulieren, da das Durchstechen der Embryonalhülle mit dem Pinsel Schäden verursachen kann, die die Überlebensfähigkeit des Embryos verringern. Bedecken Sie die Embryonen nun mit einer Schicht aus Chlor-Trifluor-Ethylengasöl.

Das Öl sollte durch die mit dem Porzellanstift gezogenen Begrenzungen eingeschlossen werden. Die Begrenzungen dürfen nicht überschritten werden. Laden Sie mittels einer Mikropipette die Injektionsnadel mit wenigen Mikrolitern Nukleinsäurelösung mit einer Konzentration von ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter.

Verbinden Sie dann die Nadel mit der Mikroinjektionsvorrichtung und stellen Sie diese so ein, dass sie eine halbe Sekunde lang bei 800 Hektopascal injiziert, bei einem Gegendruck von 150 Hektopascal. Verwenden Sie zum Injizieren einen Fußpedal-Auslöser und steuern Sie die Nadel mithilfe des Mikromanipulators, während Sie mit den Bühnensteuerungen die Probe bewegen. Überprüfen Sie, ob der Injektionsbolus ordnungsgemäß ausgestoßen wird, und richten Sie anschließend die Nadel an dem hinteren Pol des ersten Embryos in der Reihe aus.

Durch Bewegen des Stages die Nadel in das Embryo einführen und die Bolusgabe an Nukleinsäuren injizieren. Die injizierte Flüssigkeit führt zu einem Anstieg des Innendrucks, was eine leichte Bewegung des Embryos zur Folge hat. Das Pedal loslassen und die Nadel sofort, aber vorsichtig, aus dem Embryo entfernen.

Ein wenig Zytoplasma tritt an der Injektionsstelle aus. Dies ist normal. Wenn die Embryonen bei der Injektion platzen, lassen Sie sie vor dem Abdecken mit Öl einige Minuten lang austrocknen.

Nach der Injektion die Objektträgerin eine Petrischale überführen. Eine Scheibe Filterpapier in den Deckel der Schale legen. Das Filterpapier mit Wasser tränken und die Petrischale mit Parafilm verschließen.

Die Kammer bei 25 Grad Celsius inkubieren. Zwei Tage nach der Injektion mehrmals am Tag die Objektträger auf geschlüpfte Larven überprüfen. Larven im Öl suchen und mit einem feinen Pinsel in eine Petrischale mit karottenbasierter Larvennahrung überführen.

Befüllen Sie jede Schale mit bis zu 200 Larven. Die Larve kann nicht lange im Öl überleben, daher häufig suchen. Inkubieren Sie die Larven mit weitgehend geschlossenem Deckel, sodass weiterhin Luftzirkulation für die Larven gewährleistet ist.

Überprüfen Sie die Petrischalen täglich und bereiten Sie nach einer Woche die Sammlung der Larven vor, indem Sie die Schalen in einen Behälter mit Kleie stellen. Sammeln Sie die Puppen und erwarten Sie kurz danach ihr Schlüpfen. Betäuben Sie die geschlüpften Tiere anschließend mit Kohlendioxid und untersuchen Sie sie auf Transformation.

Bei der Aussiebung kann die Mobilisierungsmethode entscheidend sein. Ceratitis-capsulata-Adulte können mit Eis oder CO2 anästhesiert werden, aber eine längere Exposition könnte die Überlebensfähigkeit anderer beeinträchtigen. Überprüfen Sie das Vorhandensein roter Fluoreszenz mithilfe eines DS-rot-Breitbandfilters.

Oder überprüfen Sie die grüne Fluoreszenz mithilfe eines EYFP-Filters. Überführen Sie die transformierten Individuen in einen kleinen Käfig mit Wildtyp-Adulten des entgegengesetzten Geschlechts, um eine heterozygote Stammzucht aufzubauen. In einem Experiment wurde doppelt gefärbte RNA verwendet, um die Expression des inx5-Gens zu unterdrücken.

Die adulte Keimbahn von nicht injizierten Kontrollen erscheint wie erwartet normal, während behandelte Individuen unterentwickelte Testes und Ovarien aufwiesen. Die Quantifizierung der inx5-Transkriptmenge in den Abdomen von Individuen beider Geschlechter bestätigte die signifikant geringere Genexpression im Vergleich zu den Kontrollen. In einem zweiten Experiment wurden zwei Stämme mit markierten Spermien erzeugt, wobei der Beta-2-Tubulin-Promotor verwendet wurde, um unterschiedliche fluoreszierende Marker anzusteuern.

Transgene Männchen zeigten ein charakteristisches Fluoreszenzmuster im Körper und in den Hoden. Mit diesem Video stellen wir unsere optimierten Protokolle zur Zucht und Mikroinjektion von Nukleinsäuren in Mediterranfruchtfliegen-Embryonen bereit. Wenn die Technik beherrscht ist, können bis zu 1.000 Embryonen an einem achtstündigen Arbeitstag injiziert werden.

Mit diesem Verfahren können andere Metalle wie thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine eingesetzt werden, um eine neue Generation von Mittelmeerfruchtfliegen-Stämmen zu entwickeln.