In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung eines Tiermodells, das es ermöglicht, die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Metastasierung direkt zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkung zu entschlüsseln. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf das Ewing-Sarkom konzentrieren, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumorarten angewendet werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss der Tumorhypoxie auf die Metastasierung im Tiermodell direkt zu testen. Diese Methode kann dazu beitragen, den Mechanismus zu identifizieren, der den prometastasierenden Effekten von Hypoxie zugrunde liegt, und potenzielle neue therapeutische Ziele zur Verhinderung der Tumordissemination. Zwei Vorteile dieser Technik sind die Möglichkeit, die Auswirkungen von Tumorhypoxie in vivo zu testen und die Schritte der Metastasierung und Zellinteraktionen, die bei Krebspatienten auftreten, zu rekapitulieren.

In unserem Modell wird die Tumorhypoxie durch eine Ligatur der Oberschenkelarterie erzeugt, die den tumortragenden Hilum der Maus mit Blut versorgt. Die anschließende Amputation der hinteren Gliedmaßen verhindert die Beweglichkeit, die mit einem wiederholten Wachstum des Primärtumors verbunden ist, und ermöglicht die Bildung von Metastasen. Jason Tilan, Sung-Kyeok Hung und Dr. Olga Rodriguez, Co-Direktorin des Preclinical Imaging Research Laboratory hier in Georgetown, werden das Verfahren vorführen.

Um die Ewing-Sarkomzellen zu injizieren, halten Sie eine vier bis sechs Wochen alte weibliche SCID-beige Maus vorsichtig fest und stabilisieren Sie das linke Bein zwischen dem vierten und fünften Finger, um die mediale Seite der unteren Hintergliedmaße freizulegen. Führen Sie eine 28 Gauge 1/2" Zoll Nadel in einem Winkel von etwa 30-45 Grad anterior in den Gastrocnemius-Muskel in Richtung Tibiakamm ein. Wenn die Nadelspitze den Kamm berührt, ziehen Sie die Nadel leicht zurück und injizieren Sie langsam 0,1 Milliliter der Ewing-Sarkomzellen, während Sie die Nadel weiter zurückziehen.

Messen Sie dann mit digitalen Messschiebern täglich die Wadengröße über die mediale/laterale und anteriore/hintere Länge, bis die Tumorgröße das gewünschte Volumen erreicht. Vor Beginn der Ligatur wird ein Analgetikum subkutan injiziert, gefolgt von der Verabreichung von Hypoxyprobe-1 zur Bestätigung der Hypoxie. Legen Sie anschließend die betäubte Maus auf ein Wärmekissen auf der Operationsfläche und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.

Strecken Sie dann die hintere Gliedmaße aus und sichern Sie sie mit einem Stück Klebeband etwa 45 Grad von der Mittellinie entfernt. Enthaaren Sie den Operationsbereich mit Haarentfernungscreme, entfernen Sie die Creme mit einem Ethanol-Vorbereitungspad nach 10 Sekunden und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit drei aufeinanderfolgenden 10%igen Povidon-Jod- und Ethanol-Tüchern. Übertragen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop und machen Sie einen 1 Zentimeter großen Schnitt in der Haut von der Mitte des Oberschenkels in Richtung Leistenregion.

Bürsten Sie mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten feinen Wattestäbchen das Unterhautfettgewebe, das den Oberschenkelmuskel umgibt, vorsichtig ab. Präparieren Sie dann vorsichtig das subkutane Fettgewebe, um die darunter liegende Oberschenkelarterie freizulegen. Stabilisieren Sie die Wunde und das Operationsfeld, um das Gefäßsystem des mittleren oberen Adduktorenmuskels freizulegen, und durchstechen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die membranöse Femurscheide, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen.

Präparieren und trennen Sie mit einer sauberen feinen Pinzette die Oberschenkelarterie von der Oberschenkelvene und dem Nerv an der proximalen Stelle in der Nähe der Leiste, distal des Leistenbandes. Führen Sie dann eine 6-0-Seidennaht unter der Oberschenkelarterie distal zum Brach der Arteria femoralis lateralis durch und verschließen Sie die Oberschenkelarterie mit Doppelknoten. Verschließen Sie den Schnitt mit 6-0 Polypropylen-Nähten und injizieren Sie subkutan 0,5 Milliliter warme Kochsalzlösung für die Flüssigkeitsausgleichstherapie.

Legen Sie das Tier dann auf ein drapiertes warmes Pad in den Auffangkäfig mit Überwachung, bis es vollständig genesen ist. Zu einem geeigneten Versuchszeitpunkt das Tier vorsichtig festhalten und mit einer Schermaschine die Haare von der tumortragenden Gliedmaße von der distalen Tibia bis zur Beckenregion rasieren. Injizieren Sie das Analgetikum und legen Sie das anästhesierte Tier in die richtige seitliche liegende Position auf ein steriles Tuch, das auf ein Wärmekissen gelegt wird.

Tragen Sie Salbe auf die Augen auf und desinfizieren Sie die Operationsstelle, wie gerade gezeigt. Legen Sie dann ein steriles Tuch über das Tier und machen Sie einen mittleren femoralen umlaufenden Hautschnitt, gefolgt von einer stumpfen Dissektion und proximalen Retraktion der Haut. Legen Sie den medialen femoralen neurovaskulären Stiel auf der Medianseite des Beins frei.

Verwenden Sie dann ein 4-0 Polyglactin 910 beschichtetes resorbierbares Nahtmaterial, um in der Nähe des Leistenbandes zu ligieren. Führen Sie mit einer Schere eine Durchtrennung des Muskels in der Mitte des Femurs durch, gefolgt von einer stumpfen Dissektion des Weichgewebes zum Coxofemoralgelenk. Führen Sie mit einem Knochenschneider eine mittlere Femurosteotomie durch, gefolgt von sanftem Druck auf die Osteotomiestelle mit einem resorbierbaren Gelatineschwamm, um die Blutung zu minimieren.

Verwenden Sie dann chirurgische Wundclips, um die darüber liegende Haut zu verschließen, und injizieren Sie subkutan 0,5 Milliliter warme Kochsalzlösung für die Flüssigkeitshaushaltstherapie. Mindestens zweimal pro Woche den Kopf, den Hals, die Achselregion sowie die kontralateralen Hintergliedmaßen der tumorinjizierten Tiere vorsichtig abtasten. Prüfen Sie über die abdominale Dehnung auf Metastasen der inneren Organe und über den sanften Xiphoid-Prozessdruck mit dem Zeigefinger auf das Vorhandensein von Lungenmetastasen.

Um die Metastasierung der inneren Organe durch MRT zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten zu beurteilen, schalten Sie die Pumpe ein, die an ein Warmwasserzirkulationssystem angeschlossen ist, um die Maus auf einer physiologischen Körpertemperatur zu halten. Platzieren Sie dann den Atemsensor in Kontakt mit dem Oberbauch des Tieres und schalten Sie das Atemüberwachungsgerät von BIOPAC Systems ein. Legen Sie die anästhesierte Maus auf einen speziell entwickelten stereotaktischen Maushalter und tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf.

Um Bewegungsartefakte und Geräusche zu reduzieren, wählen Sie die Gating-Option im MRT-Protokoll, um die Datenerfassung mit dem Atemzyklus zu synchronisieren. Führen Sie dann eine zweidimensionale T2-gewichtete anatomische Bildgebungssequenz durch, um die Metastasen abzubilden. Für die Primärtumorzellkultur nach einer Amputation, Inzision oder Autopsie werden zwei bis drei 2-3 Millimeter große Segmente von nassem, glänzendem rosa-rotem lebensfähigem Tumorgewebe aus jeder Gewebeprobe von Interesse entnommen und die isolierten Segmente in 6 Zentimeter große Zellkulturplatten mit frischem Primärkulturmedium gelegt.

Übertragen Sie dann das Gewebe in einen Zellkultur-Inkubator für die entsprechende Zellwachstumsphase. Nach der Injektion der Ewing-Sarkomzellen in den Musculus gastrocnemius lässt man die Primärtumoren bis zu einer Wadengröße von 250 Kubikmillimetern anwachsen. Kontrolltumoren bei diesem Volumen weisen ein relativ geringes Maß an endogener Hypoxie ausschließlich in den vom Gefäßsystem entfernten Zellen auf, wie durch Hypoxyprobe-1-Färbung bestimmt.

Im Gegensatz dazu induziert die Ligatur der Arteria femoralis eine tiefgreifende Hypoxie in der überwiegenden Mehrheit der Tumorzellen, auch in denjenigen proximal zu den Blutgefäßen. Die Wirksamkeit der Ligatur der Oberschenkelarterie wird durch die vollständige Hemmung des Primärtumorwachstums über den Zeitraum von drei Tagen zwischen der Ligatur der Oberschenkelarterie und der Amputation unterstützt. Die histopathologische Analyse zeigt ausgedehnte Nekrosebereiche in mit der Ligatur der Oberschenkelarterie behandelten Primärtumoren, die drei Tage nach der Operation entnommen wurden.

Dennoch gibt es innerhalb des Tumorgewebes Gruppen von lebensfähigen Tumorzellen, die sich an den Rändern des Tumors in der Nähe des Gefäßsystems befinden. Diese verbleibenden lebensfähigen Tumorzellen sind hochinvasiv, was sich in ihrer massiven Intravasation zeigt. Viele Zellen im Gefäßlumen sind Hypoxyprobe-1-positiv, was darauf hindeutet, dass Zellen, die hypoxisch nach der Ligatur der Arteria femoralis sind, möglicherweise eine Angioinvasion eingeleitet haben.

In diesen Experimenten erhöhte Hypoxie signifikant die Häufigkeit und Vielzahl der Metastasen, die bei Mäusen mit Kontrolltumoren häufig an nicht betroffenen Stellen beobachtet wurden. Einmal gemeistert, kann jeder chirurgische Eingriff, einschließlich Vorbereitung, Anästhesie und Genesung, in 30 Minuten pro Tier abgeschlossen werden. Die Länge des gesamten Experiments hängt von der verwendeten Zelllinie und ihren Wachstums- und Metastasenraten ab.

Die Zeitpläne für MRT und Euthanasie variieren je nach Latenz der Metastasen und müssen in einem Pilotversuch für jede einzelne Zelllinie ermittelt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, nach dem Eingriff eine angemessene Schmerzbehandlung und Tierüberwachung aufrechtzuerhalten. Wenn der Eingriff perfekt durchgeführt wird, sollten keine schwerwiegenden Nebenwirkungen oder Todesfälle im Zusammenhang mit der Operation beobachtet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Gewebe und Zellen aus Kontroll- und hypoxischen Primärtumoren sowie aus ihren entsprechenden Metastasen einer weiteren Analyse unterzogen werden, einschließlich eines globalen Genexpressionsprofils zur Identifizierung der Mechanismen der Hypoxie-induzierten Metastasierung. Diese Technik kann für die Forscher auf dem Gebiet der Krebsmetastasierung verwendet werden, um die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Krankheitsverbreitung direkt zu testen. Obwohl wir uns hier auf das Ewing-Sarkom konzentriert haben, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumoren angewendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Tiermodell für Tumorhypoxie erstellt und wie man die resultierenden Metastasen sowohl in vivo als auch ex vivo überwacht.