Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung von aus Fett gewonnenen Stammzellblättern in Kombination mit künstlicher Haut auf die Wundheilung bei einem großen Hautdefekt in voller Dicke bei diabetischen Ratten zu überprüfen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Heilung chronischer Wunden zu beantworten, wie z. B. diabetische große Wunden mit freiliegendem Knochen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen mit Hilfe der Zellblatttechnologie in festen Schichten in die Wunde transplantiert werden, und das Ergebnis ist ein lebensfähiges, stabiles Transplantat.

Planen Sie für einen Fettpolsterspender die Verwendung von acht bis 33 Wochen alten Lewis-Ratten. Halten Sie an der Operationsstelle mehrere sterile Applikatoren mit Wattespitze, Gaze, ein Skalpell, einen Nadelhalter, eine Operationsschere, eine Pinzette und 5-0 Nylonnaht bereit. Befüllen Sie für die vorübergehende Gewebeplatzierung eine 100-Milliliter-Petrischale mit 10 Millilitern PBS.

Wiegen Sie die mit PBS beladene Schale, um später die Masse des entnommenen Gewebes zu ermitteln. Nachdem Sie die Ratte betäubt haben, positionieren Sie sie in Rückenlage auf einem sterilen Abdecktuch. Rasieren Sie dann den Operationsbereich und schrubben Sie die freiliegende Haut mit mehreren abwechselnden Peelings mit 70 % Ethanol.

Machen Sie nun einen drei Zentimeter großen Hautschnitt im seitlichen Unterbauch. Als nächstes legen Sie den äußeren schrägen Muskel frei und präparieren ihn. Legen Sie dann das Nebenhodenfettgewebe frei, das den Nebenhoden umgibt.

Als nächstes schneiden Sie vorsichtig das Nebenhodenfettgewebe heraus. Vermeiden Sie Schäden an Nebenhoden, Hoden und Nebenhoden-Blutgefäßen. Übertragen Sie das Gewebe in die Schale mit PBS.

Schließen Sie dann die Spenderratte und befolgen Sie die üblichen postoperativen Pflegepraktiken. Isolieren Sie die ASCs aus zwei bis drei Gramm entnommenem Fettgewebe. Verdauen Sie das Gewebe eine Stunde lang in 0,1 % Kollagenase Typ A, um die stromale Gefäßfraktion (SVF) zu erhalten.

Nach der Reinigung des SVF suspendieren Sie den SVF in 20 Millilitern Medium. Teilen Sie die Suspension in zwei 60 Quadratzentimeter große Kulturschalen auf und kultivieren Sie sie 24 Stunden lang unter Standardbedingungen. Waschen Sie die Platten am nächsten Tag dreimal mit PBS, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen.

Nach der letzten Wäsche wieder frisches Complete Medium hinzufügen. Fahren Sie dann mit der Passage der Zellen fort, bis sie am dritten Tag der Kultivierung fast subkonfluent sind. Verwenden Sie dann einen Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA in einer kurzen Inkubation.

Entferne die Zellen von der Platte. Lassen Sie die Zellen nicht länger als 10 Minuten aktivem Trypsin ausgesetzt werden. Nachdem Sie die Zellen beobachtet und gezählt haben, subkultivieren Sie sie bei einer Dichte von 1.700 pro Quadratzentimeter.

Passieren Sie dann alle drei Tage die Zellen und absolvieren Sie drei Durchgänge, bevor Sie fortfahren. Nachdem die subkultivierten Ratten-ASCs zum dritten Mal passiert wurden, werden 150.000 Zellen auf eine temperaturempfindliche Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern und zwei Milliliter Kulturmedium gegeben. Kulturieren Sie die Schale drei Tage lang in einem Inkubator, um ein einheitliches Zellblatt herzustellen.

Wechseln Sie drei Tage später das Medium und fügen Sie 16,4 Mikrogramm pro Milliliter AA hinzu. Kultivieren Sie dann die Zellen und wechseln Sie das AA-Medium jeden zweiten Tag. Nach vier oder fünf Tagen auf dem AA-haltigen Medium ist die Proliferation der ASCs zu überprüfen. Achte auf Lücken zwischen den Zellen und dem angrenzenden Zellblatt.

Sobald ein zusammenhängendes Zellblatt etabliert ist, können die Zellen für das Modell verwendet werden. Sammeln Sie bei Bedarf das Zellblatt, indem Sie die Platte 15 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur platzieren. Da die Platte temperaturempfindlich ist, lösen sich die Zellen spontan als zusammenhängende Folie, und die Folie kann mit einer Pinzette entfernt werden.

Verwenden Sie für das Modell zur Wundheilung bei Fettleibigkeit erwachsene männliche ZDF-Ratten im Alter von 16 bis 18 Wochen mit einem Gewicht zwischen 500 und 600 Gramm. Positionieren und betäuben Sie die Ratte auf dem Operationsfeld und reinigen Sie den Kopf vor der Rasur mit 70% Ethanol. Rasieren Sie dann den Operationsbereich und reinigen Sie die freiliegende Haut mit abwechselnden Peelings mit 70 % Ethanol.

Übertragen Sie um diese Zeit die temperaturempfindliche Platte mit den Fettstammzellen auf die Laborbank. Bevor sich das Zellblatt von der Platte löst, entfernen Sie das Medium und waschen Sie das Zellblatt dreimal mit PBS. Nachdem Sie das Zellblatt gesammelt haben, weichen Sie es bis zur Verwendung in PBS ein.

Sobald die Zellen fertig sind, machen Sie einen 15 x 10 Millimeter großen Hautdefekt in voller Dicke am Kopf der Ratte. Entfernen Sie zunächst das Hautgewebe bis zum Periost. Entfernen Sie dann die Haut und das Hautgewebe mit einem Skalpell und einer chirurgischen Schere.

Um den Defekt zu vervollständigen, entfernen Sie das Periost mit dem Periost-Raspatorium. Legen Sie dann das Zellblatt über den Defekt. Das Stammzellblatt ist weich und flexibel.

Verwenden Sie eine Pinzette, um sie in jede Ecke des Defekts zu verlängern. Decken Sie nun das Zellblatt und den Defekt mit einem 10 x 15 Millimeter großen Pflaster künstlicher Haut ab, das unmittelbar vor der Anwendung in Kochsalzlösung getränkt ist, und schließen Sie die Wunde mit etwa 10 Stichen mit 5-0-Nylonnaht. Um die Wunde zu schützen, verwenden Sie eine 5-0-Nylonnaht, um ein 15 x 20 Millimeter großes Pflaster aus nicht klebendem Verband über der künstlichen Haut zu befestigen.

Plane ein, den Verband jeden zweiten Tag zu beobachten, da die Ratte ihn ausnahmslos entfernen wird, und wenn nötig, den Verband sofort zu wechseln. In zwei Gruppen von sechs Zucker-diabetischen Fettratten wurde das beschriebene Protokoll verwendet, um einen Schädeldefekt zu erzeugen. Experimentelle Ratten wurden mit einem Fettstammzellblatt der Ratte behandelt, die Kontrollen nicht.

Nach 14 Tagen waren die Wunden der Behandlungsgruppe signifikant kleiner als die der Kontrollgruppe. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bei Ratten eine große Wunde mit freiliegendem Knochen macht und diese Wunde dann mit aus Fett gewonnenen Stammzellen behandelt. Achten Sie beim Versuch dieses Verfahrens darauf, dass Sie während des gesamten Prozesses der Verwendung von temperaturempfindlichen Kulturschalen ein strenges Temperaturmanagement anwenden.

Andernfalls könnten sich Zellen spontan von den Schalen lösen und Ihre Experimente verzögern.