Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten Protokolls zur seriellen Verdünnung von Peptidproben ist es, die Peptidabsorption an Kunststoffgefäße zu minimieren, um eine genaue Bestimmung der Wirkstoffpotenz in der Wirkstoffforschung zu ermöglichen. Diese Methode kann die Qualität und Reproduzierbarkeit der Daten verbessern, und das Entfernen des pipettierbasierten Abfüllens eliminiert zudem Probenüberschreitung, sodass Fehler nicht über die gesamte serielle Verdünnung hinweg weitergegeben werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Datenqualität erhöht, indem sie die Peptidabsorption an Kunststoffgefäße minimiert.

Dies ist besonders wichtig für die Ermittlung einer Struktur-Wirkungs-Beziehung oder die Identifizierung von Leitstrukturen in der Wirkstoffforschung. Nach der Zubereitung des Assay-Puffers und der Erstellung eines Dosierprogramms für einen Großdosierer gemäß dem schriftlichen Protokoll das Dosierkassettenrohr in Assay-Puffer eintauchen und mit Flüssigkeit vorbehandeln. Eine 384-Well-Platte mit geringem Volumen für den Assay auf einen Plattenhalter stellen.

Dann starten Sie. Geben Sie 25 Mikroliter 100-fach konzentrierter Peptidlösungen in die Spalten eins bis fünf einer akustisch geeigneten 384-Well-Flachboden-Polypropylen-Mikroplatte ab, die als Quellplatte A bezeichnet wird. Geben Sie 25 Mikroliter 100-fach konzentrierten Referenzkontrollstoffs in die Wells A23 und A24 ab. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Assaypuffer in die Spalten 11 bis 15 und 30 Mikroliter Assaypuffer in die Spalten 21 bis 22 ab.

Danach in die Spalten sechs bis 10 und 16 bis 20 einer zweiten akustisch qualifizierten 384-Well-Polypropylen-Mikroplatte, die als Quellplatte B bezeichnet ist, jeweils 10 Mikroliter Assaypuffer pipettieren. Die Quellplatten A und B bei 300 × g eine Minute lang zentrifugieren. Anschließend die Quell- und Assayplatten in den Plattenhotelabschnitt der Robotik einlegen.

Danach führen Sie die Robotersoftware gemäß dem schriftlichen Protokoll aus und verwenden akustische Flüssigkeitsdosierer, die in das System integriert sind, um drei aufeinanderfolgende 1:100-Zwischendilutionen herzustellen. Beginnen Sie damit, von den Spalten eins bis fünf der Quellplatte A in die Spalten sechs bis zehn der Quellplatte B zu übertragen. Nachdem die erste 1:100-Dilution hergestellt wurde, lässt die Automatisierung die Quellplatte B in eine integrierte Zentrifuge befördern und sie eine Minute lang mit 300 × g zentrifugieren, bevor die Platte zum akustischen Flüssigkeitsdosierer zurückgebracht wird. Danach, nach der Übertragung der Lösung von der Quellplatte B zur Quellplatte A für die zweite 1:100-Dilution, befördert die Automatisierung die Quellplatte A zur Zentrifuge, zentrifugiert sie und bringt die Platte anschließend zum Flüssigkeitsdosierer zurück.

Abschließend wird nach der automatisierten Übertragung der Lösung von Platte A nach B für die dritte Verdünnung im Verhältnis 1:100 die Platte B erneut zentrifugiert. Diese Peptidverdünnungen in der Quellplatte A und der Quellplatte B werden anschließend verwendet, um vollständige Konzentrations-Wirkungs-Kurven im Assay gemäß dem schriftlichen Protokoll vorzubereiten. Dieser Schritt ist entscheidend, da eine vergleichende, spitzenbasierte Methode zu einem erheblichen Verlust der Probentätigkeit aufgrund der Adsorption der Peptide an das Plastikmaterial führt.

Tauen Sie kryokonservierte CHO-Zellen, die den Ziel-Maus-GLP1-Rezeptor exprimieren, schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und resuspendieren Sie sie in 20 mL Assaypuffer. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL Assaypuffer.

Mit Trypanblau die Zellbestandslösung eins zu eins verdünnen und einen automatisierten Zellzähler verwenden, um die lebensfähige Zelldichte zu bestimmen. Anschließend die Zellen mit Assaypuffer auf eine Konzentration von 1,6 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendieren. Mithilfe eines Großreagenzien-Dispensers fünf Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung der Assayplatte geben, die seriell verdünnte Peptide enthält, und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Um den cAMP-Nachweis durchzuführen, verwenden Sie den Lysepuffer, um 1:20-Verdünnungen jedes homogenen zeitlich aufgelösten Fluoreszenz- oder HTRF-Reagenz herzustellen. Geben Sie mithilfe eines Großreagenzien-Dispensers jeweils fünf Mikroliter Cryptat-Reagenz in alle Vertiefungen der Assay-Platten. Anschließend geben Sie fünf Mikroliter D2-Reagenz in die Spalten eins bis 22 der Platte.

Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter D2-Reagenz in die Vertiefungen E23 bis P24 hinzu. Geben Sie unverzüglich mit einer manuellen Pipette fünf Mikroliter Lysepuffer in die Vertiefungen A23 bis D24, die als Kontrollvertiefungen für unspezifische Bindung verwendet werden. Zentrifugieren Sie die Testplatten bei 200 × g und Raumtemperatur für eine Minute, um die Ansätze in den Vertiefungen zu mischen.

Anschließend die Platten abdecken und eine Stunde lang inkubieren. Nach der Inkubation mithilfe eines Plattenlesegeräts das FRET-Signal bei einer Anregung von 320 Nanometern und einer Emission von 620 und 665 Nanometern messen. Die Daten gemäß dem Textprotokoll analysieren.

Der erste Schritt bei der akustischen Übertragung für den cAMP-Nachweis-Assay besteht darin, vier Zwischenverdünnungen der Peptid-Stammlösungen in zwei Quellplatten wie hier gezeigt herzustellen. Im zweiten Schritt verdünnt der akustische Dispenser die Stammlösungen aus den Quellplatten A und B weiter, um für jedes Testpeptid einen 11-Punkte-Konzentrationsbereich in Duplikaten für insgesamt 16 verschiedene Peptide zu erzeugen. Eine Nachfüllung mit Assaypuffer wird durchgeführt, um ein konstantes Volumen pro Mulde auf der Assayplatte sicherzustellen.

Hier ist eine Wärmekarte für eine Beispielplatte mit 16 Peptiden, die im cAMP-Akkumulationstest in Duplikaten durchgeführt wurden. Niedrige Werte, dargestellt in Lila, repräsentieren eine hohe cAMP-Konzentration. Diese Konzentrations-Wirkungs-Kurven veranschaulichen die Reproduzierbarkeit der Duplikate.

Probe eins stellt eine positive Kontrolle für den Assay dar. Die Proben zwei, drei und vier waren inaktiv und werden durch die flachen Linien im Diagramm dargestellt. Die Proben fünf bis 16 repräsentieren aktive Testpeptide.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Erstellung vollständiger Konzentrations-Wirkungs-Kurven über einen breiten Potenzbereich. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden, wobei dies von der Anzahl der vorzubereitenden Proben abhängt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass Peptide biologische Proben sind und entsprechend behandelt werden sollten.

Um ihre Integrität zu bewahren, sollten wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen vermieden werden. Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Peptid-Wirkstoffentdeckung neue Wege eröffnen und ermöglicht genaue Vorhersagen der Wirksamkeit, die zur Aufklärung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die automatisierte akustische Dosierung bei der seriellen Verdünnung von Peptiden haben, wodurch der Peptidverlust durch Absorption minimiert und die Genauigkeit Ihrer Messungen erhöht wird.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit biologisch aktiven Peptiden mit Pikomolar-Potenzien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung stets getroffen werden sollten.