Name: Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte akustische Serienverdünnung von Peptid-Agonisten zur Minimierung der Adsorption an Kunststoffware. Diese Methode verbessert die Genauigkeit der Potenzbestimmung in der Arzneimittelforschung erheblich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Peptidserienverdünnung <ol><li> Bereiten Assaypuffer: Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS), supplementiert mit 25 mM HEPES, 0,1% BSA und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), pH 7,4. </li><li> Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender systematisch 5 ul Testpuffer hinzufügen zu jeder Vertiefung von fünf 384-Well-Low-Volume-Testplatten. <ol><li> Verwenden Sie den internen Software ein Abgabeprogramm für 5 ul Volumen zusätzlich zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte zu erstellen, wie Anweisungen des Herstellers. </li><li> Tauchen Abgabe Kassettenschläuche in Testpuffer und Prime Flüssigkeit. </li><li> Legen Sie 384-well geringem Volumen Assayplatte auf Plattenträger. </li><li> Drücke Start. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie alle Peptidproben, unabhängig von Speicher Fahrzeug, in Testpuffer ein 100x Peptid Lager herzustellen. HINWEIS: Peptides Screening erfordern , können in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) bereitgestellt werden , wie als angemessen erachtet wird (beispielsweise DMSO wkrank haben eine schädliche Wirkung auf Peptide mit sekundären Modifikationen wie PEGylierung). </li><li> Dispense 25 ul 100x Peptid Bestände in Spalten 1-5 von einem akustisch qualifizierten 384-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Diese Platte ist &#39;bezeichnet Source-Platte A&#39;. Stellen Sie sicher, dass die Quellplatten, aber nicht Zielplatten sind mit flachem Boden und entsprechen den spezifischen akustischen Toleranzen, wie vom Hersteller von akustischen Instrumenten definiert. </li><li> Dispense 25 ul 100x Referenzkontrolle in die Vertiefungen A23 und A24 von Quellenplatte A. </li><li> Dispense 10 &amp; mgr; l Testpuffer in Spalten 11 bis 15 und 30 &amp; mgr; l Testpuffer in Spalten 21-22 von Quellenplatte A. </li><li> Dispense 10 &amp; mgr; l Testpuffer in Spalten 6-10 und Spalten 16-20 eines zweiten akustisch qualifiziert 384-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Diese Platte wird &quot;Quellenplatte B &#39;bezeichnet. </li><li> Zentrifuge Quellenplatten A und B bei 300 × g für 1 min. Fügen Sie eine entsprechende Ausgleichsplatte. </li><li> Verwenden Sie akustische fluid Spender in ein automatisiertes Robotersystem integriert drei aufeinanderfolgenden 1 vorzubereiten: aus der Kolonne 100 Zwischenverdünnungen (in Testpuffer) der 100x-Peptid-Aktien 1 in Quelle A. HINWEIS: Die Programmierung erfordert Platte neu formatiert und Dosis - Wirkungs - Software (wie vom Hersteller des akustischen Flüssigkeitsspender zur Verfügung gestellt) drei akustische Übertragungen zwischen Quelle A und Quelle B zu ermöglichen (Abbildung 1 für Plattenlayouts sehen). Schritt 1.9 Details insbesondere die Verwendung von Fluidspender in diesem Labor unter automatisierten Robotersteuerung verwendet wird (siehe Materialien Table): <ol><li> Ladequellenplatten und Testplatten in Plattenhotelteil der Robotik. </li><li> Offene automatisierten Roboter-Software und Lastplatte neu formatiert und Dosis-Wirkungs-Programmerweiterung Protokolle. Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. HINWEIS: Automation weist einen akustischen Flüssigkeitsspender 250 nl von Spalten A 1-5 von Quellenplatte in Spalten zu übertragen 6-10 von Quellenplatte B und eine zweite Acoustic Flüssigkeitsspender der Lage, größere Flüssigkeitsvolumina Umgang mit 15 &amp; mgr; l Testpuffer zu verfüllen zu mischen. Automation überträgt dann Source-Platte B zu integrierten Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min (eine entsprechende Ausgleichsplatte ist für alle Zentrifugationsschritte enthalten). Source Platte B ist mit dem akustischen Fluidspender für die Übertragung von 250 nl zurück von Spalten 6-10 der Quellenplatte B in Spalten 11-15 der Quellenplatte A und Verfüllung mit 15 ul Assaypuffer zu mischen. Automation überträgt Quellenplatte A integrierte Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min. Quelle Platte A wird dann zu dem akustischen Flüssigkeitsspender für den Transfer von 250 nl von Spalten 11-15 der Quellplatte A in Spalten 16-20 der Quellplatte B und Verfüllung mit 15 &amp; mgr; l Testpuffer zu mischen. Automation überträgt dann Source-Platte B zu integrierten Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min. HINWEIS: Schließlich wird die Dosis-Wirkungs-Protokoll leitet akustische Ausgabe zu übertragendas erforderliche Volumen von jedem der vier seriell Source-Platte Brunnen verdünnt (sowohl in der Source-Platte A und Source-Platte B) 1.2 eine vollständige 11-Punkt-Kurve in zweifacher Ausfertigung in Assayplatten (gefüllt mit 5 &amp; mgr; l Testpuffer in Schritt zu konstruieren oben ). Automation Transfers Assayplatte integrierte Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min. </li></ol></li></ol> 2. Zellpräparation <ol><li> Auftau kryokonservierten Chinese hamster ovary (CHO) Zellen, die das Ziel Maus GLP-1-Rezeptor rasch in einem 37 ºC Wasserbad und Resuspendieren in 20 ml Assaypuffer exprimieren. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 200 xg bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie ein angemessenes Gleichgewicht. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml Assaypuffer. </li><li> Verdünnen Zelle Lager 1: 1 in Trypanblau und bestimmen Lebendzelldichte eine automatische Zellzähler verwendet wird. Die Zellen in Assaypuffer bei 1,6 x 10 6 Zellen pro ml (äquivalent zu 8000 Zellen pro well Assayplatten). </li><li> Verwenden einer Schütt Reagenzspender 5 &amp; mgr; l der Zellsuspension hinzugefügt zu jeder Vertiefung der Testplatten (mit seriell verdünnten Peptide in 5 &amp; mgr; l Assay-Puffer) und Inkubation für 30 min bei RT. </li></ol> 3. HTRF cAMP-Detection-Assay <ol><li> Bringen HTRF cAMP-Assay-Kit für 30 min auf RT vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie jede HTRF-Reagenz (Kryptat und d2) getrennt bei einer Verdünnung von 1:20 in Lysispuffer (eigene Formulierung, durch Hersteller von cAMP-Nachweistest zur Verfügung gestellt). HINWEIS: ACHTUNG: Lysepuffer enthält Kaliumfluorid (KF) , die toxisch ist und einen teratogen 13. Zur Entsorgung Assay-Platten, die KF sollte versiegelt und verbrannt werden, und jede flüssige Abfälle müssen mit Wasser vor der Entsorgung in den Ausguss auf &lt;1 mmol / l verdünnt werden. </li><li> Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender 5 ul Kryptat- Reagenz in alle Vertiefungen der Testplatten hinzuzufügen. </li><li> Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender 5 ul d2 Reagenz colum hinzufügenns 1-22 der Testplatten. </li><li> Unmittelbar Pipette manuell 5 &amp; mgr; l Lyse-Puffer in Vertiefungen A23-D24 der Testplatten nicht-spezifische Bindung (NSB) Kontrollvertiefungen zu geben, und 5 ul d2 Reagenz in die Vertiefungen E23-P24. </li><li> Zentrifugieren Sie die Testplatten für 1 min bei 200 × g bei RT die Brunnen zu mischen. </li><li> Decken Sie die Testplatten Verdunstung und Photobleaching zu minimieren und Inkubation bei RT für 1 Stunde. </li><li> Messen Sie Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Signal mit einer Anregung bei 320 nm und Emission bei 620 nm und 665 nm einen Plattenleser. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Verwenden Sie NSB bedeuten Hintergrund aus allen Wells abzuziehen. </li><li> Berechnen% Delta F aus dem 665 nm / 620 nm-Verhältnis wie folgt: Ratio = (A 665 nm / A 620nm) x 10 4 Delta F = ((Sample Ratio - Verhältnis NSB) / Ratio - NSB)) x 100 wo Verhältnis NSB = Vertiefungen ohne d2 Reagenz. </li><li> Berechnen% betätigendesIonen zwischen unstimulierten Zellen und Zellen mit maximaler GLP-1-Liganden stimuliert, wie folgt: % Aktivierung = (% Delta fSAMPLE -% DeltaFunstimulated Zellen) / (% DeltaFGLP-1 stimulierten Zellen -% DeltaF unstimulierten Zellen) x 100 </li><li> Analysieren Sie Konzentrations-Wirkungs - Kurven über 4-Parameter logistische Analyse und grafische Darstellung in% Aktivierung , wie durch Bezugssteuerung 1 definiert. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von automatisierten akustischen Ausgabe zu seriell Peptidproben über einen Konzentrationsbereich von 3 x 10 6 , die weniger als 1 ul Probe verdünnen. Der große Vorteil dieser Methode ist, über reduzierte Exposition von Proben zu experimentellen Behälter und Kunststoffgeschirr (wie Pipettenspitzen) Datenqualität durch Minimierung Peptid Adsorption an Kunststoffprodukte zu erhöhen, die für Reagenztransfer und Mischen normalerweise erforderlich sind. Während...

Die GLP-1R ist ein etabliertes Medikament Ziel bei der Behandlung von Typ - 2 - Diabetes 2. Das native Peptid - Agonisten für diesen Rezeptor, GLP-1, hat eine in vivo Halbwertszeit von 2-3 min 3. Die Bindung von GLP-1 an seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptorziel Ergebnisse in der stromabwärtigen Herstellung des second messenger cAMP durch native G-Protein-Kopplung an die Aktivierung von Adenylatcyclase. Die Messung des akkumulierten cAMP stellt eine robuste Test-Rezeptoraktivierung zu überwachen und für die aktive GLP-1-Analoga mit bevorzugten physikalisch-chemischen Eigenschaften zu screenen. Ein solcher Assay erfordert die serielle Verdünnung der Testproben Konzentrations-Reaktions-Kurven zu konstruieren, und dies ist besonders kompliziert, wenn Peptidproben reichte. Mögliche Fehler von der Spitze-basierten seriellen Verdünnung Vorbereitung wurden zuvor 1,4,5 beschrieben. Peptide werden auf Kunststoffgeschirr, was zu unzuverlässigen Potenz Schätzungen adsorbieren. Peptidverlust kann durch t minimiert werdener die Aufnahme von Rinderserumalbumin (BSA) in Puffer und die Verwendung von silikonisierten Kunststoffgeschirr, noch Proteinbindungs ​​bleibt unvorhersehbar. Insbesondere wurde die Änderung der Bindung von GLP-1 an Versuchsbehältern wurde 6 beschrieben. Es gibt eine weitere Komplikation bei , dass die Stabilisierungsmittel in Laborkunststoffprodukte verwendet wird, kann von den Spitzen und Mikrotiterplatten in wßriges Assaypuffer auslaugen und stören Proteinfunktion 7, 8. Daher Methoden Exposition gegenKunstStoffGeschirr zu reduzieren , sind notwendig , um die Genauigkeit der Messungen zu erhöhen. Akustische Flüssigkeitsspender konzentriert eines hochfrequenten akustischen Signals auf der Oberfläche einer Flüssigkeitsprobe, wodurch der Ausstoß von Tröpfchen präzise Nanoliter- in eine benachbarte Testplatte 9. Die Verwendung von akustischen Ausstoß ist in der pharmazeutischen Industrie für die Herstellung und das Screening von großen synthetischen Substanzbibliotheken Standard, und die Technologie für kleine molecul gut validiert wurdees 10. Unseres Wissens sind wir die erste Gruppe akustische Abgabe zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptide zu beschreiben , und wir haben bereits berichtet , die eine verbesserte Genauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Tipp-basierten Methoden 1. Dieser Artikel beschreibt die Integration der Herstellung von Peptid serielle und direkte Verdünnungen von berührungslosen akustischen Übertragung auf eine vollautomatische Plattenrobotersystem Handhabung. Eine Anzahl von Verfahren umfasst Akustisches von Proben wurden zuvor 11 beschrieben. Wir verwenden ein zweistufiges Verfahren zur Zwischenstammkonzentrationen herzustellen und zu seriell Peptidanaloga für die Erzeugung der vollen Dosis-Wirkungskurve verdünnen. Die hergestellten Peptide werden inkubiert mit den Zellen des Ziel Maus GLP-1R exprimieren, und wir verwenden eine im Handel erhältliche homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) -Assay cAMP-Akkumulation in diesen Zellen als eine Auslesung von Peptid-Agonist aktiv zu messen,keit. Der Assay ist robust und zugänglich für ein Hochdurchsatz - 384-Well - Format und routinemäßig sowohl Assay - Entwicklung angewendet und Wirkstoff - Screening - Projekte 12.

<table><tbody><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Hergestellt als 0,5 M Stamm in DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) amid</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Hergestellt als 1 mg/ml Vorrat in PBS, bezeichnet als "100x Referenzkontrolle"</td></tr><tr><td>Testpeptide</td><td>Inhouse hergestellt bei MedImmune</td><td></td><td>Geliefert in verschiedenen Konzentrationen in DMSO oder PBS je nach Bedarf</td></tr><tr><td>100x Peptidbestand</td><td>Inhouse bei MedImmune</td><td></td><td>hergestellt Testpeptid verdünnt in Assay-Puffer auf die 100x erforderliche Endkonzentration</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Zellanalysator</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-Well-Platten, geringes Volumen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo-qualifizierte 384-Well-Polypropylen-Mikroplatte</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Echo-qualifiziertes Reservoir</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Tröpfchentransfervolumen in Schritten von 2,5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Tröpfchentransfervolumen in Schritten von 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Laborautomatisierung Planungssoftware für Life Science Robotik</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagenzienspender</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Bezeichnet als "Bulk Reagent Dispenser"</td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automatische acoustic verzicht für die serielle verdünnung von peptid-agonisten im potency bestimmung assays

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Wie bei Entdeckung kleines Molekül als Wirkstoff, erfordert das Screening für Peptid-Agonisten die serielle Verdünnung von Peptiden Konzentrations-Wirkungs-Kurven zu erzeugen. Screening Peptide bietet eine zusätzliche Ebene der Komplexität als herkömmliche Spitzenbasis Probenhandhabungsverfahren Peptide zu einer großen Oberfläche von Plastikmaterialien belichten, eine erhöhte Chance für Peptidverlust durch Adsorption bereitstellt. Verhindern übermäßigen Exposition gegenüber Kunststoffgeschirr reduziert Peptidverlust durch Festhalten an Kunststoffen und minimiert somit Ungenauigkeiten in Potenz Vorhersage, und wir haben zuvor beschrieben die Vorteile von akustischen berührungslosen Abgabe für in vitro High-Throughput - Screening von Peptidagonisten 1. Hier diskutieren wir eine vollständig integrierte Automatisierungslösung zur berührungslosen akustischen Herstellung von Peptid-Reihenverdünnungen in Mikrotiterplatten unter Verwendung der beispielsweise zum Screenen von Peptidagonisten an der Maus Glucagon-like Peptid-1-Rezeptor (GLP-1R). Unsere Methoden ermöglichen hohe-throughput zellbasierten Assays zum Screenen auf Agonisten und sind leicht skalierbar erhöhten Probendurchsatz zu unterstützen, oder für eine erhöhte Anzahl von Kopien Testplatte (beispielsweise für eine Gruppe von mehreren Zielzelllinien) zu ermöglichen.

<html> Wir verwenden routinemäßig einen zweistufigen Verfahren Peptide über akustische Übertragung zu verdünnen. Für den ersten Schritt wird ein akustisches Spender mit Automatisierungs fluchtet verwendet vier Stammpeptidzwischenverdünnungen über zwei Quellenplatten (1a, b) zu erzeugen. Für den zweiten Schritt, verwenden wir einen akustischen Spender zur weiteren Stammverdünnungen von der Quelle Platten A verdünnen und B eine 11-Punkt - Konzentrationsbere...

Die Adsorption von Peptiden an Kunststoffwaren während herkömmlicher spitzenbasierter serieller Verdünnungen kann die Wirksamkeitsbestimmung erheblich beeinflussen und das Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen verwirren, die für die Leitstrukturidentifizierung und Leitstrukturoptimierungsphasen der Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier werden Verfahren zur automatisierten akustischen berührungslosen seriellen Verdünnung von Peptidproben beschrieben.

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten Protokolls zur seriellen Verdünnung von Peptidproben ist es, die Peptidabsorption an Kunststoffgefäße zu minimieren, um eine genaue Bestimmung der Wirkstoffpotenz in der Wirkstoffforschung zu ermöglichen. Diese Methode kann die Qualität und Reproduzierbarkeit der Daten verbessern, und das Entfernen des pipettierbasierten Abfüllens eliminiert zudem Probenüberschreitung, sodass Fehler nicht über die gesamte serielle Verdünnung hinweg weitergegeben werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Datenqualität erhöht, indem sie die Peptidabsorption an Kunststoffgefäße minimiert.Dies ist besonders wichtig für die Ermittlung einer Struktur-Wirkungs-Beziehung oder die Identifizierung von Leitstrukturen in der Wirkstoffforschung. Nach der Zubereitung des Assay-Puffers und der Erstellung eines Dosierprogramms für einen Großdosierer gemäß dem schriftlichen Protokoll das Dosierkassettenrohr in Assay-Puffer eintauchen und mit Flüssigkeit vorbehandeln. Eine 384-Well-Platte mit geringem Volumen für den Assay auf einen Plattenhalter stellen.Dann starten Sie. Geben Sie 25 Mikroliter 100-fach konzentrierter Peptidlösungen in die Spalten eins bis fünf einer akustisch geeigneten 384-Well-Flachboden-Polypropylen-Mikroplatte ab, die als Quellplatte A bezeichnet wird. Geben Sie 25 Mikroliter 100-fach konzentrierten Referenzkontrollstoffs in die Wells A23 und A24 ab. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Assaypuffer in die Spalten 11 bis 15 und 30 Mikroliter Assaypuffer in die Spalten 21 bis 22 ab.Danach in die Spalten sechs bis 10 und 16 bis 20 einer zweiten akustisch qualifizierten 384-Well-Polypropylen-Mikroplatte, die als Quellplatte B bezeichnet ist, jeweils 10 Mikroliter Assaypuffer pipettieren. Die Quellplatten A und B bei 300 × g eine Minute lang zentrifugieren. Anschließend die Quell- und Assayplatten in den Plattenhotelabschnitt der Robotik einlegen.Danach führen Sie die Robotersoftware gemäß dem schriftlichen Protokoll aus und verwenden akustische Flüssigkeitsdosierer, die in das System integriert sind, um drei aufeinanderfolgende 1:100-Zwischendilutionen herzustellen. Beginnen Sie damit, von den Spalten eins bis fünf der Quellplatte A in die Spalten sechs bis zehn der Quellplatte B zu übertragen. Nachdem die erste 1:100-Dilution hergestellt wurde, lässt die Automatisierung die Quellplatte B in eine integrierte Zentrifuge befördern und sie eine Minute lang mit 300 × g zentrifugieren, bevor die Platte zum akustischen Flüssigkeitsdosierer zurückgebracht wird. Danach, nach der Übertragung der Lösung von der Quellplatte B zur Quellplatte A für die zweite 1:100-Dilution, befördert die Automatisierung die Quellplatte A zur Zentrifuge, zentrifugiert sie und bringt die Platte anschließend zum Flüssigkeitsdosierer zurück.Abschließend wird nach der automatisierten Übertragung der Lösung von Platte A nach B für die dritte Verdünnung im Verhältnis 1:100 die Platte B erneut zentrifugiert. Diese Peptidverdünnungen in der Quellplatte A und der Quellplatte B werden anschließend verwendet, um vollständige Konzentrations-Wirkungs-Kurven im Assay gemäß dem schriftlichen Protokoll vorzubereiten. Dieser Schritt ist entscheidend, da eine vergleichende, spitzenbasierte Methode zu einem erheblichen Verlust der Probentätigkeit aufgrund der Adsorption der Peptide an das Plastikmaterial führt.Tauen Sie kryokonservierte CHO-Zellen, die den Ziel-Maus-GLP1-Rezeptor exprimieren, schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und resuspendieren Sie sie in 20 mL Assaypuffer. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL Assaypuffer.Mit Trypanblau die Zellbestandslösung eins zu eins verdünnen und einen automatisierten Zellzähler verwenden, um die lebensfähige Zelldichte zu bestimmen. Anschließend die Zellen mit Assaypuffer auf eine Konzentration von 1,6 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendieren. Mithilfe eines Großreagenzien-Dispensers fünf Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung der Assayplatte geben, die seriell verdünnte Peptide enthält, und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Um den cAMP-Nachweis durchzuführen, verwenden Sie den Lysepuffer, um 1:20-Verdünnungen jedes homogenen zeitlich aufgelösten Fluoreszenz- oder HTRF-Reagenz herzustellen. Geben Sie mithilfe eines Großreagenzien-Dispensers jeweils fünf Mikroliter Cryptat-Reagenz in alle Vertiefungen der Assay-Platten. Anschließend geben Sie fünf Mikroliter D2-Reagenz in die Spalten eins bis 22 der Platte. Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter D2-Reagenz in die Vertiefungen E23 bis P24 hinzu. Geben Sie unverzüglich mit einer manuellen Pipette fünf Mikroliter Lysepuffer in die Vertiefungen A23 bis D24, die als Kontrollvertiefungen für unspezifische Bindung verwendet werden. Zentrifugieren Sie die Testplatten bei 200 × g und Raumtemperatur für eine Minute, um die Ansätze in den Vertiefungen zu mischen.Anschließend die Platten abdecken und eine Stunde lang inkubieren. Nach der Inkubation mithilfe eines Plattenlesegeräts das FRET-Signal bei einer Anregung von 320 Nanometern und einer Emission von 620 und 665 Nanometern messen. Die Daten gemäß dem Textprotokoll analysieren.Der erste Schritt bei der akustischen Übertragung für den cAMP-Nachweis-Assay besteht darin, vier Zwischenverdünnungen der Peptid-Stammlösungen in zwei Quellplatten wie hier gezeigt herzustellen. Im zweiten Schritt verdünnt der akustische Dispenser die Stammlösungen aus den Quellplatten A und B weiter, um für jedes Testpeptid einen 11-Punkte-Konzentrationsbereich in Duplikaten für insgesamt 16 verschiedene Peptide zu erzeugen. Eine Nachfüllung mit Assaypuffer wird durchgeführt, um ein konstantes Volumen pro Mulde auf der Assayplatte sicherzustellen.Hier ist eine Wärmekarte für eine Beispielplatte mit 16 Peptiden, die im cAMP-Akkumulationstest in Duplikaten durchgeführt wurden. Niedrige Werte, dargestellt in Lila, repräsentieren eine hohe cAMP-Konzentration. Diese Konzentrations-Wirkungs-Kurven veranschaulichen die Reproduzierbarkeit der Duplikate.Probe eins stellt eine positive Kontrolle für den Assay dar. Die Proben zwei, drei und vier waren inaktiv und werden durch die flachen Linien im Diagramm dargestellt. Die Proben fünf bis 16 repräsentieren aktive Testpeptide.Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Erstellung vollständiger Konzentrations-Wirkungs-Kurven über einen breiten Potenzbereich. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden, wobei dies von der Anzahl der vorzubereitenden Proben abhängt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass Peptide biologische Proben sind und entsprechend behandelt werden sollten.Um ihre Integrität zu bewahren, sollten wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen vermieden werden. Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Peptid-Wirkstoffentdeckung neue Wege eröffnen und ermöglicht genaue Vorhersagen der Wirksamkeit, die zur Aufklärung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die automatisierte akustische Dosierung bei der seriellen Verdünnung von Peptiden haben, wodurch der Peptidverlust durch Absorption minimiert und die Genauigkeit Ihrer Messungen erhöht wird.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit biologisch aktiven Peptiden mit Pikomolar-Potenzien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung stets getroffen werden sollten.

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Ein Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen in komplexen biologischen Flüssigkeiten mit automatisierten Immuno-MALDI (iMALDI)-Technologie präsentiert.

Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

Dieses Protokoll zeigt die Echtzeitaufzeichnung von volldosierten Reaktionsbeziehungen für die agonistisch-induzierte GPCR-Aktivierung von einer einzelnen Zellschicht, die auf einer einzelnen Mikroelektrode mit etikettenfreien Impedanzmessungen angebaut wird. Das neue Dosierschema erhöht den Durchsatz deutlich, ohne dass die Zeitauflösung verloren geht.

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Erfahren Sie die automatisierte akustische Serienverdünnung von Peptid-Agonisten zur Minimierung der Adsorption an Kunststoffware. Diese Methode verbessert die Genauigkeit der Potenzbestimmung in der Arzneimittelforschung erheblich.

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

Weitere Videos entdecken