Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Das übergeordnete Ziel der induzierten somatischen Sektoranalyse besteht darin, ein mittleres bis hohes Durchsatzverfahren zur funktionalen Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen darüber zu beantworten, wo und wann Gene exprimiert werden, die an biologisch wichtigen Prozessen wie der Holzbildung und der Entwicklung des sekundären Stammes beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es effizient, einfach und relativ schnell ist und auf eine breite Palette von Baumarten anwendbar ist.

Bereiten Sie zunächst ein sauberes 50-Milliliter-Schraubglas mit 19 Milliliter frischem LB-Medium bei 28 Grad Celsius, das mit den geeigneten Antibiotika für die bakterielle Selektion versetzt ist, vor. Geben Sie 1 Milliliter A.tumefaciens-Kultur hinzu und messen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 Nanometern. Falls die OD über 0,1 liegt, verdünnen Sie die Kultur weiter mit warmem LB. Inkubieren Sie die A.tumefaciens-Kultur in einem Schüttelinkubator, bis die OD600 zwischen 0,4 und 0,6 liegt.

Wenn dies erreicht ist, zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius und 1.000 × g. Gießen Sie die Flüssigkeit aus dem Röhrchen ab und resuspendieren Sie das Zellpellet sofort mit einem Milliliter gekühltem MS-Medium. Überführen Sie die Suspension in ein sauberes Mikroröhrchen mit zwei Milliliter Volumen und lagern Sie sie bei Bedarf auf Eis.

Beginnen Sie das Experiment im Frühjahr oder Frühsommer und wählen Sie Pflanzen mit einem aktiven und schnell wachsenden Kambium. Dies ist bestätigt, wenn das Phloem leicht vom Xylem abgezogen werden kann. Identifizieren Sie einen geraden Stängelabschnitt nahe der Basis der Pflanze und entfernen Sie alle Blätter oder Äste.

Erstellen Sie mit einem scharfen Skalpell ein ein Quadratzentimeter großes kambiales Fenster, indem Sie zwei parallele, 20 Millimeter lange Einschnitte durch das Phloem in einem Abstand von fünf Millimetern anbringen und anschließend einen einzelnen horizontalen Schnitt führen, der die beiden vertikalen Schnitte an ihrem basalen Ende kreuzt. Heben Sie den Phloemstreifen nach oben, um das sich entwickelnde Xylemgewebe freizulegen. Geben Sie dann mithilfe einer Pipette ausreichend Inokulationsmedium hinzu, um die Oberfläche des exponierten Xylems vollständig zu benetzen.

Setzen Sie den Phloemstreifen unverzüglich zurück in den Stamm und fixieren Sie ihn fest mit Parafilm. Wiederholen Sie diese Inokulationsschritte für alle Gene oder Promotoren der Untersuchung, wobei neue kambiale Fenster mindestens einen Zentimeter über oder unter bestehenden Fenstern und um 90 Grad versetzt angelegt werden. Inokulieren Sie zusätzlich Fenster mit den positiven und negativen Kontrollvektoren am selben Stamm oder an denselben Stämmen wie die experimentellen Inokulate.

Überwachen Sie das Stammwachstum regelmäßig und entnehmen Sie das Gewebe für einen Beta-Glucuronidase- oder GUS-Assay, sobald ein radiales Wachstum von mindestens fünf Millimetern beobachtet wurde. Um das Testmaterial zu entnehmen, schneiden Sie zunächst das kambiale Fenster aus dem Stamm aus und entfernen Sie jegliches Gewebe, das nicht Teil des neuen Wachstums ist. Bei Studien zur Morphologie reifer Xylem- und Phloemzellen oder -gewebe lösen Sie das Phloem vom Xylem ab.

Alternativ, für Untersuchungen, bei denen die Kambialzone intakt bleiben muss oder bei denen Promotor-Expressionsmuster analysiert werden sollen, schneiden Sie das Kambialfenster mit einer Rasierklinge quer in Scheiben von 0,5 bis einem Millimeter Dicke. Geben Sie das gewonnene Kambialfenzergewebe in einzelne Röhrchen mit rundem Boden (14 ml) und spülen Sie es zweimal mit 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) je fünf Minuten lang, wobei sichergestellt werden muss, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Achten Sie am Ende des zweiten Spülschritts darauf, jegliche überschüssige Lösung vollständig zu entfernen.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter GUS-Reagenz zu jedem Reagenzglas hinzu. Falls die Gewebeprobe dadurch nicht vollständig bedeckt ist, geben Sie weiteres Reagenz hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen zehn Minuten lang bei 55 Grad Celsius im Dunkeln.

Danach die Röhrchen weitere 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius im Dunkeln unter leichtem Schütteln in einem Schüttler inkubieren. Nach Entnahme aus dem Inkubator eine zufällige Teilmenge der Röhrchen entnehmen und den pH-Wert des GUS-Reagenz mithilfe von Lackmuspapier mit einem pH-Bereich von null bis sieben überprüfen. Falls einer von ihnen einen pH-Wert unter sechs aufweist, diese kennzeichnen und den Rest der Röhrchen überprüfen.

Etikettieren Sie alle Röhrchen mit einem pH-Wert unter sechs und schließen Sie sie aus. Gießen Sie das GUS-Reagenz aus den Röhrchen ab und ersetzen Sie es durch ausreichend 70 Prozent Ethanol, um das Gewebe zu bedecken. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Entfernen Sie mit einer sauberen Pinzette das gesamte Kambialfenstergewebe aus einem Probenröhrchen und legen Sie es zur mikroskopischen Sichtbarmachung auf ein kleines Tablett oder eine Petrischale. Legen Sie die Probe unter das Objektiv eines Stereomikroskops mit einer Vergrößerung zwischen 1X und 4X und identifizieren und zählen Sie die Anzahl der Zellen oder Gewebe, die eine intensive blaue Färbung aufweisen. In Fällen, in denen das Phloem entfernt wurde, zählen Sie die Anzahl der Sektoren im Kambialgewebe, die an der Oberfläche des sich entwickelnden Xylems zu finden sind.

Bei Proben, die in Scheiben geschnitten wurden, zählen Sie die Anzahl der Sektoren in den verschiedenen Zell- oder Gewebetypen. Stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Scheibe betrachtet werden und dass Sektoren, die sich über zwei Scheiben erstrecken, einander zugeordnet werden, um eine Überschätzung der Zahlen zu vermeiden. Legen Sie nur das Gewebe, das Sektoren enthält, zurück in das Röhrchen mit 70 Prozent Ethanol und lagern Sie es, bis es benötigt wird.

Wiederholen Sie die Analyse für alle zusätzlichen gewonnenen kambialen Fenster, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Um die genaue Identifizierung und Klassifizierung von Sektoren zu erleichtern, empfehlen wir, sich mit der sekundären Stängelanatomie und -entwicklung sowie mit den Reaktionen des Stängels auf Verletzungen vertraut zu machen. Diese Abbildung zeigt mehrere erfolgreiche Transformationen, die hier als Bereiche bläulicher Färbung sichtbar sind.

Ein Beispiel für ein Phloem-Peel-Fenster zeigt mehrere transformierte Sektoren, und aus zwei Baumarten gewonnene Scheiben zeigen Transformationssektoren und anschließendes radiales Wachstum. Die Transformation einer Reihe von Gewebetypen kann ebenfalls beobachtet werden. Hier sind Sektoren am Stamm im Periderm, Phloem, Wundparenchym und mehreren anderen Geweberegionen der Weißen Pappel zu sehen.

Dieses Bild zeigt die Ergebnisse der Gen-Promotor-Expression in kambialen Derivaten. In diesem Beispiel sehen wir den Anteil der Färbung in jedem Gewebetyp in einem Versuch mit einer Reihe von CesA-Promotoren aus Eucalyptus grandis, die in Stängel von Eukalyptus-Hybriden transformiert wurden. Die Expression im Phloem sowie im sich entwickelnden und ausgebildeten Xylem ist in Prozent angegeben.

Durchschnittliche Anzahl von Transformationsereignissen pro Zentimeter infiziertem Kambium kann ebenfalls für jeden Promotor oder jedes Gen von Interesse berechnet werden. Diese Tabelle zeigt die Daten für typische Sektoren, die bei Eukalyptus- und Pappelproben identifiziert wurden, die mit einem positiven Kontroll- oder einem Promotor von Interesse transformiert wurden und mit der Scheibenerntemethode analysiert wurden. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie eine schnelle, effiziente und breit anwendbare Methode bieten, um die komplexe Natur der kambialen Differenzierung mit Bildung in der sekundären Stängelentwicklung zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pflanzen und Bakterien vorbereitet, wie man Stämme transformiert, kultiviert und erntet sowie wie man transgenes Gewebe zur phänotypischen Beurteilung identifiziert und klassifiziert.