Name: Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Lernen Sie die Induzierte Somatische Sektoranalyse zur funktionellen Charakterisierung von Genen und Promotoren in sekundärem Baumstammgewebe. Diese effiziente Methode ermöglicht schnelle Erkenntnisse zur Holzbildung.

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Die Autoren möchten sich bei der finanziellen Unterstützung für einen Aspekt der Arbeit durch Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) und LP0211919 (GB) und die Industriepartner Sappi und Mondi sowie den Australian Postgraduate Award (EM) des Australian Research Council und den Young Innovators and Scientist Award durch das Australian Department of Agriculture (LT) bedanken. Wir danken auch Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan und Simon Southerton für die vielen Diskussionen und Ideen, die sie während der Entwicklung dieses Protokolls eingebracht haben, sowie Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel und Noemie Defaix für ihre Unterstützung bei der Laborarbeit.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die IVSS-Protokoll ist ein relativ einfaches und effizientes Verfahren zur Erzeugung transgener Stamm Gewebe in Baumarten in den Raum von ein paar Monaten für die Analyse von Genen und Promotoren von Interesse an Holz beteiligt und Bildung einzudämmen. Wenig Aufwand, über Pflanzen am Leben zu erhalten, ist erforderlich , transgene Stammgewebe nach der Impfung zu wachsen, die in - vitro - Verfahren im Gegensatz steht , wo umfangreiche Kultivierung erforderlich ist , Gewebe oder Pflanzen zu erhalten, wo ...

Baum stammt eine erhebliche Menge der Planeten Biomasse umfassen und sind von immenser biologische, kulturelle und wirtschaftliche Bedeutung. Sekundäre Stielen Lebensraum schaffen, indem sie Ressourcen und Schutz für viele andere Lebensformen bieten. Sie liefern viele andere Dienstleistungen für die Ökosysteme, die sie bewohnen und wirken als nachwachsender Rohstoff für die Produktion von Holz, Zellstoff und Papier und andere Holz- und Nichtholzprodukten. Nebenschaft Entwicklung und insbesondere Holzbildung von komplexen molekularen System geregelt wird, das die Entwicklung von spezifischen Zelltypen, die biochemische Zusammensetzung ihrer Zellwände regulieren und wie sie angeordnet sind Gewebe und Organe zu bilden. Sezieren die molekulare Basis von Sekundärstammentwicklung und Holzbildung wird von vielen Faktoren ab, einschließlich der Variabilität von Holz und Stamm Eigenschaften verwechselt innerhalb und zwischen den Stämmen, lange Generationszeiten, out-Kreuzung Paarungssysteme, hohe Heterozygotie, hohe genetische Belastung, saisonale dormancy, lange reifenMerkmal Einrichtung Zeiten und die schiere physische Größe von ausgewachsenen Bäumen. Als Ergebnis, das Verständnis der Nebenschaft Entwicklung in Bezug auf die genaue Kenntnis der meisten anderen Aspekte der molekularen Kontrolle der Pflanzenentwicklung, ist immer noch in den Kinderschuhen. Eine Reihe von in vitro - Techniken verwendet wurden Nebenschaft Entwicklung, insbesondere Holz und sekundären Zellwandbildung zu untersuchen und zu verstehen. Diese Protokolle umfassen die Verwendung von ganzen Pflanze oder der Pflanzenteil Systemen, bei denen entweder transgene Pflanzen erzeugt werden oder spezifische Sekundärzellen oder Gewebe werden für die Untersuchung von spezifischen Aspekten der Holz transformiert und / oder sekundären Schaft Entwicklung 1. Transgene Pflanzen können Post genetische Transformation aus einer Vielzahl von Pflanzengeweben und Zelltypen jedoch wiederhergestellt werden, geht nur langsam voran, vor allem, wenn Züge Holzfasern aufgrund der langen Regenerations Analyse und Reifezeiten stammen (in der Größenordnung von Jahren), hohe technische und Arbeits demands, geringen Durchsatz von Kandidatengenen sowie Schwierigkeiten in einigen holzigen Pflanzenarten. Ähnliche Techniken wurden in nicht-holzigen Modellsystem wie Arabidopsis entwickelt , die erfolgreich einige dieser Einschränkungen zu überwinden, aber nicht alle sekundären Typen Stammzelle eine in diesen Stämmen und Eigenschaften der Saisonalität oder Langlebigkeit selbst können nicht in einer solchen Art 2 untersucht werden. Alternativ Anlagenteilsysteme, wie Pinu s radiata Kalluskulturen 3 die damit verbundenen Fristen zu reduzieren. Diese Verfahren sind jedoch auf die Untersuchung eines einzelnen Zelltyp beschränkt und leiden ähnliche Einschränkungen wie für in vitro Versuche festgestellt. In ähnlicher Weise wurden apikal Stammkulturen 4 beteiligt ganze Stamm Explantate gezeigt Versprechen , aber noch nicht für die Untersuchung spezifischer Gene oder Promotoren von Interesse angewendet wurden. In jüngster Zeit ist ein alternatives Protokoll Haarwurzelkulturen beteiligt hat für Eucalypten und wurde erfolgreich entwickelt5 angelegt, wobei dieses Verfahren beinhaltet jedoch in vitro - Kultivierung erfordert immer noch, eher zweitrangig Wurzeln als Stämme und es ist auf einer einzigen Baumart zu datieren. Induzierte somatischen Sektoranalyse (IVSS), wurde wie hier beschrieben, entwickelt eine mittlere bis hohe Durchsatz funktionelle Screening-Tool, einige dieser Probleme zu überwinden, für Gene und Promotoren mit Verdacht auf Rollen in Holzbildung und Nebenschaftgewebe Entwicklung. ISSA ist ein in vivo - Transformation und Screening - System , das entwickelt wurde , um die Zeit zu reduzieren , genommen , um transgene Zellen und Gewebe in einem intakten sekundären Schaft erzeugen , während Arbeits überwinden, technischen und Durchsatzbeschränkungen von routinemßig in vitro - Methoden verwendet. Die Protokolle hier beschrieben ermöglichen die gleichzeitige Schaffung von Hunderten von unabhängig transformierten Gewebe Sektoren und Zellen in sekundären innerhalb einer kurzen Zeit stammt, in der Baumarten und Gewebe von Interesse ohne genetic und / oder Umweltvariation innerhalb relativ kurzer Zeitrahmen und niedrigen Arbeitskosten. IVSS in - vivo - Techniken wurden zunächst für Sekundär Schaft 6 und Knospe 7 Gewebe beschrieben und seitdem in Nebenschaftgewebe durch Studien von Genen und / oder Promotoren in cambial Differenzierung beteiligt verfeinert worden und umfassen: Tubulin (TUB) 8, Fasciclin artigen Arabinogalactan ( FLA) 9, Cellulose - Synthase (CESA) 10, sekundäre Zellwand-assoziierten nac Domain (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 und wirklich interessante neue Gen (RING) H2 - Protein 13. Diese Studien wurden in sekundären geführt stammt von Pappeln und Eukalyptus Pflanzen und Einblicke in die Zellmorphologie, Zellwand Chemie und Genexpression. Die Protokolle hier beschriebenen sollen die Erfahrung ein zusammen zu bringennd gewonnenen Erkenntnisse durch die Entwicklung und Anwendung der IVSS aus einer Reihe von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Studien im letzten Jahrzehnt. Sie konzentrieren sich auf die in - vivo - Transformation von Nebenschaftgewebe 6 und konzentrieren sich auf Studien mit Populus alba &#39;pyramidalis&#39; Klon, Eucalyptus globulus sowie 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone. Dieses Dokument nimmt Forscher durch das Protokoll aus dem Anbau von Pflanzen und Bakterien, die Umwandlung von Stammzellen Gewebe, Wachstum und Ernte von Gewebe, die Identifizierung von transgenen Zellen und Geweben, die Vorbereitung auf phänotypische Einschätzungen und Verfahren zur Erhebung und Analyse von Daten. Während Techniken erfolgreich angewendet wurden Zellwand Monosaccharidzusammensetzung auch 9,11, aus Platzgründen zu messen, konzentriert sich dieses Dokument auf Techniken zur Messung der Zell- und Gewebemorphologie und das Verständnis von Genexpressionsmustern in sekundären st verwendetnur ems. Dementsprechend wird, wie das Protokoll zu denen weitere Einblicke in die Rolle und / oder Expression von Genen zur sekundären Stiele mit einem kostengünstigen, technisch einfach und mittlere bis hohe Durchsatzverfahren verknüpft zu gewinnen suchen geeignet skizziert.

<table><tbody><tr><td>Pflanzen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Bitte wenden Sie sich bei Bedarf an die örtlichen Baumschullieferanten für Pflanzen</td></tr><tr><td>Agrobacterium Stamm</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Es gibt viele Möglichkeiten, Agrobactrium-Stämme zu erhalten. Wir empfehlen Ihnen, sich in Ihrer lokalen Forschungsgemeinschaft zu erkundigen, da es in Ihrem Land und Ihrer Region Einschränkungen bei der Beschaffung der Bakterien geben kann.</td></tr><tr><td>Binärer Vektor (Gen und Promotor)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Wir haben eine Reihe von Vektoren entwickelt, die dem ISSA-Protokoll entsprechen, indem wir das Gateway-Rekombinase-System verwenden. Dazu gehören Überexpression, RNAi-Knockouts und Promotor-Fusionsvektoren, die auf modifizierten pCAMBIA-Vektoren basieren und bei Bedarf gerne zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus gibt es viele Vektoren, die der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung stehen.</td></tr><tr><td>LB-Medien</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>LB-Medien mit</td><td>Agar Sigma</td><td>L2897</td><td>Ein ähnliches Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>Die Katalognummer hängt von dem Antibiotikum ab, das Sie benötigen, da eine Reihe von Antibiotika für die bakterielle Selektion in binären Vektoren verwendet werden. Dieses Produkt könnte stammen von a&nbsp; 50</td></tr><tr><td>ml Schraubröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>2 ml Microtube</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>Skalpellklinge Nr. 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma bezogen werden</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Dies ist das beste Produkt, um die Erstellung von kambialen Fensterpfosten zu binden&nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Das gleiche Produkt stammt von einer anderen Firma</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC direct</td><td></td><td>Sie müssen auf die Website gehen, um zu bestellen - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid(III)</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen</td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid(II)</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen</td></tr><tr><td>Lackmuspapier</td><td>Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>Doppelschneidige Rasierklinge</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>REM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>Probenfläschchen mit Schraubverschluss</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>LR weiß</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>Das gleiche Produkt könnte von einer anderen Firma stammen</td></tr><tr><td>Einbettungsform</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Wir empfehlen diese Sorte, es gibt jedoch viele verfügbare Optionen</td></tr><tr><td>Wasser Soulable Einbettmedien</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Ein Beispiel für ein Eindeckmedium, das verwendet werden könnte, aber es gibt auch andere Optionen, die ausgelotet werden könnten.</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen bezogen werden</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen bezogen werden</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Ein ähnliches Produkt könnte von einem anderen Unternehmen stammen</td></tr><tr><td>Quanta Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Dies ist das Instrument, das in einem Teil dieser Studie verwendet wurde, aber jedes andere REM mit einem Niedrigvakuummodus kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Die ImageJ-Bildgebungssoftware</td><td></td><td></td><td>kann von der folgenden URL bezogen werden: http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

die verwendung von induced somatic sektoranalyse (ivss) in holzbildung und nebenschaft entwicklung beteiligten gene und promotoren studieren

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Sekundäre Stengelwachstum in den Bäumen und die damit verbundenen Holzbildung sind signifikant sowohl von biologischen und wirtschaftliche Perspektiven. Jedoch relativ wenig über die molekularen Kontrolle bekannt, die ihre Entwicklung steuert. Dies ist zum Teil aufgrund physikalischer, Ressourcen- und Zeitbegrenzungen oft mit dem Studium der sekundären Wachstumsprozessen in Verbindung gebracht. Eine Reihe von in - vitro - Techniken verwendet wurden , sowohl in der holzigen und nicht holzigen Pflanzenarten entweder Pflanzenteil oder ganze Pflanze System beteiligt sind . Jedoch Fragen über ihre Anwendbarkeit für die Untersuchung der Nebenschaftwachstumsprozesse, die Widerspenstigkeit bestimmter Arten und Arbeitsintensität sind oft unerschwinglich für mittlere bis hohe Durchsatzanwendungen. Auch wenn an Nebenschaft Entwicklung und Holzbildung suchen die spezifischen untersuchten Merkmale könnten nur messbar werden spät in einem Baum des Lebenszyklus nach mehreren Jahren des Wachstums. In diesen Herausforderungen Alternative in vivo p Adressierungrotocols wurden entwickelt, mit dem Namen Induced Somatic Branchenanalyse, die die Schaffung von transgenen somatischen Gewebe Sektoren direkt in der Anlage Nebenschaft einzubeziehen. Das Ziel dieses Protokolls ist eine effiziente, einfach und relativ schnell Mittel zur Verfügung zu stellen transgene sekundären Pflanzengewebe für Gen und Promotor funktionelle Charakterisierung zu erstellen, die in einer Reihe von Baumarten verwendet werden können. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass transgene Nebenschaft Sektoren in allen lebenden Geweben und Zelltypen erstellt werden, in der Sekundär einer Vielzahl von Baumarten stammt, und dass Holz als auch morphologische Merkmale als Promotor-Expressionsmuster in sekundären leicht mittel bis hoch eingeschätzt werden können Stiele erleichtern Durchsatz funktionelle Charakterisierung.

Dieses Protokoll mit allen Live - Sekundär Stammzellen und Gewebetypen A. als anfällig erwiesen haben tumefaciens Transformationen und wurden in Sektortypen basierend auf dem Zelltyp zunächst umgewandelt und nachfolgende Entwicklungswachstumsmuster definiert. Sektor - Typen gehören periderm, Bast, cambial, Wund Parenchym und Tylose (Abbildung 1b, 1c, 1d) und kann hier gefunden werden in Einklang Standorten in den Rest d...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die funktionelle Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen mit mittlerem bis hohem Durchsatz innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume ermöglicht. Es ist effizient, einfach zu bedienen und vielseitig einsetzbar für eine Reihe von Baumarten.

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Das übergeordnete Ziel der induzierten somatischen Sektoranalyse besteht darin, ein mittleres bis hohes Durchsatzverfahren zur funktionalen Charakterisierung von Gen- und Promotorkonstrukten im sekundären Stammgewebe von Bäumen innerhalb vergleichsweise kurzer Zeiträume bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen darüber zu beantworten, wo und wann Gene exprimiert werden, die an biologisch wichtigen Prozessen wie der Holzbildung und der Entwicklung des sekundären Stammes beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es effizient, einfach und relativ schnell ist und auf eine breite Palette von Baumarten anwendbar ist.Bereiten Sie zunächst ein sauberes 50-Milliliter-Schraubglas mit 19 Milliliter frischem LB-Medium bei 28 Grad Celsius, das mit den geeigneten Antibiotika für die bakterielle Selektion versetzt ist, vor. Geben Sie 1 Milliliter A.tumefaciens-Kultur hinzu und messen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 Nanometern. Falls die OD über 0,1 liegt, verdünnen Sie die Kultur weiter mit warmem LB. Inkubieren Sie die A.tumefaciens-Kultur in einem Schüttelinkubator, bis die OD600 zwischen 0,4 und 0,6 liegt.Wenn dies erreicht ist, zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius und 1.000 × g. Gießen Sie die Flüssigkeit aus dem Röhrchen ab und resuspendieren Sie das Zellpellet sofort mit einem Milliliter gekühltem MS-Medium. Überführen Sie die Suspension in ein sauberes Mikroröhrchen mit zwei Milliliter Volumen und lagern Sie sie bei Bedarf auf Eis.Beginnen Sie das Experiment im Frühjahr oder Frühsommer und wählen Sie Pflanzen mit einem aktiven und schnell wachsenden Kambium. Dies ist bestätigt, wenn das Phloem leicht vom Xylem abgezogen werden kann. Identifizieren Sie einen geraden Stängelabschnitt nahe der Basis der Pflanze und entfernen Sie alle Blätter oder Äste.Erstellen Sie mit einem scharfen Skalpell ein ein Quadratzentimeter großes kambiales Fenster, indem Sie zwei parallele, 20 Millimeter lange Einschnitte durch das Phloem in einem Abstand von fünf Millimetern anbringen und anschließend einen einzelnen horizontalen Schnitt führen, der die beiden vertikalen Schnitte an ihrem basalen Ende kreuzt. Heben Sie den Phloemstreifen nach oben, um das sich entwickelnde Xylemgewebe freizulegen. Geben Sie dann mithilfe einer Pipette ausreichend Inokulationsmedium hinzu, um die Oberfläche des exponierten Xylems vollständig zu benetzen.Setzen Sie den Phloemstreifen unverz&uuml;glich zur&uuml;ck in den Stamm und fixieren Sie ihn fest mit Parafilm. Wiederholen Sie diese Inokulationsschritte f&uuml;r alle Gene oder Promotoren der Untersuchung, wobei neue kambiale Fenster mindestens einen Zentimeter &uuml;ber oder unter bestehenden Fenstern und um 90 Grad versetzt angelegt werden. Inokulieren Sie zus&auml;tzlich Fenster mit den positiven und negativen Kontrollvektoren am selben Stamm oder an denselben St&auml;mmen wie die experimentellen Inokulate.Überwachen Sie das Stammwachstum regelmäßig und entnehmen Sie das Gewebe für einen Beta-Glucuronidase- oder GUS-Assay, sobald ein radiales Wachstum von mindestens fünf Millimetern beobachtet wurde. Um das Testmaterial zu entnehmen, schneiden Sie zunächst das kambiale Fenster aus dem Stamm aus und entfernen Sie jegliches Gewebe, das nicht Teil des neuen Wachstums ist. Bei Studien zur Morphologie reifer Xylem- und Phloemzellen oder -gewebe lösen Sie das Phloem vom Xylem ab.Alternativ, für Untersuchungen, bei denen die Kambialzone intakt bleiben muss oder bei denen Promotor-Expressionsmuster analysiert werden sollen, schneiden Sie das Kambialfenster mit einer Rasierklinge quer in Scheiben von 0,5 bis einem Millimeter Dicke. Geben Sie das gewonnene Kambialfenzergewebe in einzelne Röhrchen mit rundem Boden (14 ml) und spülen Sie es zweimal mit 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) je fünf Minuten lang, wobei sichergestellt werden muss, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Achten Sie am Ende des zweiten Spülschritts darauf, jegliche überschüssige Lösung vollständig zu entfernen.Fügen Sie anschließend fünf Milliliter GUS-Reagenz zu jedem Reagenzglas hinzu. Falls die Gewebeprobe dadurch nicht vollständig bedeckt ist, geben Sie weiteres Reagenz hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen zehn Minuten lang bei 55 Grad Celsius im Dunkeln.Danach die Röhrchen weitere 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius im Dunkeln unter leichtem Schütteln in einem Schüttler inkubieren. Nach Entnahme aus dem Inkubator eine zufällige Teilmenge der Röhrchen entnehmen und den pH-Wert des GUS-Reagenz mithilfe von Lackmuspapier mit einem pH-Bereich von null bis sieben überprüfen. Falls einer von ihnen einen pH-Wert unter sechs aufweist, diese kennzeichnen und den Rest der Röhrchen überprüfen.Etikettieren Sie alle Röhrchen mit einem pH-Wert unter sechs und schließen Sie sie aus. Gießen Sie das GUS-Reagenz aus den Röhrchen ab und ersetzen Sie es durch ausreichend 70 Prozent Ethanol, um das Gewebe zu bedecken. Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden.Entfernen Sie mit einer sauberen Pinzette das gesamte Kambialfenstergewebe aus einem Probenröhrchen und legen Sie es zur mikroskopischen Sichtbarmachung auf ein kleines Tablett oder eine Petrischale. Legen Sie die Probe unter das Objektiv eines Stereomikroskops mit einer Vergr&ouml;&szlig;erung zwischen 1X und 4X und identifizieren und z&auml;hlen Sie die Anzahl der Zellen oder Gewebe, die eine intensive blaue F&auml;rbung aufweisen. In F&auml;llen, in denen das Phloem entfernt wurde, z&auml;hlen Sie die Anzahl der Sektoren im Kambialgewebe, die an der Oberfl&auml;che des sich entwickelnden Xylems zu finden sind.Bei Proben, die in Scheiben geschnitten wurden, zählen Sie die Anzahl der Sektoren in den verschiedenen Zell- oder Gewebetypen. Stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Scheibe betrachtet werden und dass Sektoren, die sich über zwei Scheiben erstrecken, einander zugeordnet werden, um eine Überschätzung der Zahlen zu vermeiden. Legen Sie nur das Gewebe, das Sektoren enthält, zurück in das Röhrchen mit 70 Prozent Ethanol und lagern Sie es, bis es benötigt wird.Wiederholen Sie die Analyse für alle zusätzlichen gewonnenen kambialen Fenster, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Um die genaue Identifizierung und Klassifizierung von Sektoren zu erleichtern, empfehlen wir, sich mit der sekundären Stängelanatomie und -entwicklung sowie mit den Reaktionen des Stängels auf Verletzungen vertraut zu machen. Diese Abbildung zeigt mehrere erfolgreiche Transformationen, die hier als Bereiche bläulicher Färbung sichtbar sind.Ein Beispiel für ein Phloem-Peel-Fenster zeigt mehrere transformierte Sektoren, und aus zwei Baumarten gewonnene Scheiben zeigen Transformationssektoren und anschließendes radiales Wachstum. Die Transformation einer Reihe von Gewebetypen kann ebenfalls beobachtet werden. Hier sind Sektoren am Stamm im Periderm, Phloem, Wundparenchym und mehreren anderen Geweberegionen der Weißen Pappel zu sehen.Dieses Bild zeigt die Ergebnisse der Gen-Promotor-Expression in kambialen Derivaten. In diesem Beispiel sehen wir den Anteil der Färbung in jedem Gewebetyp in einem Versuch mit einer Reihe von CesA-Promotoren aus Eucalyptus grandis, die in Stängel von Eukalyptus-Hybriden transformiert wurden. Die Expression im Phloem sowie im sich entwickelnden und ausgebildeten Xylem ist in Prozent angegeben.Durchschnittliche Anzahl von Transformationsereignissen pro Zentimeter infiziertem Kambium kann ebenfalls für jeden Promotor oder jedes Gen von Interesse berechnet werden. Diese Tabelle zeigt die Daten für typische Sektoren, die bei Eukalyptus- und Pappelproben identifiziert wurden, die mit einem positiven Kontroll- oder einem Promotor von Interesse transformiert wurden und mit der Scheibenerntemethode analysiert wurden. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie eine schnelle, effiziente und breit anwendbare Methode bieten, um die komplexe Natur der kambialen Differenzierung mit Bildung in der sekundären Stängelentwicklung zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pflanzen und Bakterien vorbereitet, wie man Stämme transformiert, kultiviert und erntet sowie wie man transgenes Gewebe zur phänotypischen Beurteilung identifiziert und klassifiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine Methode der konfokalen Raman Mikroskopie basiert vorgestellt, bietet label-free-Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten.

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das beschreibt, wie Holzproben für die Gesamtbewertung ihrer Wachstumsstrukturen beprobt werden. Makro- und mikroskopische Präparations- und Visualisierungstechniken, die zur Generierung eines gut replizierten und hochaufgelösten anatomischen und dendroökologischen Holzdatensatzes erforderlich sind, werden beschrieben und beschrieben.

Technischer Sicht in Modern Jahrringforschung - Wie Dendroökologische und Holz anatomische Herausforderungen zu meistern

Das Lateral Root Inducible System (LRIS) ermöglicht die synchrone Induktion von Seitenwurzeln und wird für Arabidopsis thaliana und Mais vorgestellt.

Seitenwurzel induzierbaren Systems in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Und Mais

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir die Erzeugung und Anwendung einer Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana Linien förderliches induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck in den drei wichtigsten Meristeme, schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium.

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Lernen Sie die Induzierte Somatische Sektoranalyse zur funktionellen Charakterisierung von Genen und Promotoren in sekundärem Baumstammgewebe. Diese effiziente Methode ermöglicht schnelle Erkenntnisse zur Holzbildung.

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren (Video) | JoVE Journal

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

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