Name: Experimentelle Infektion mit Listeria monocytogenes Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Erfahren Sie die experimentelle Infektion mit Listeria monocytogenes zur Untersuchung von Interferon-γ-Antworten bei C57BL/6J-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Reaktionen und Überlebensraten.

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<ol><li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).</li>
<li>Ranson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+V+alpha+14%2B+NKT+cells+participate+in+the+early+response+to+enteric+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).</li>
<li>Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+immunity%3A+a+T-cell-independent+pathway+of+macrophage+activation%2C+defined+in+the+scid+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse.</a> Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).</li>
<li>Soudja, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory-T-cell-derived+interferon-gamma+instructs+potent+innate+cell+activation+for+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity.</a> Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).</li>
<li>Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interferon-gamma+during+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.</a> Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+IL-12%2F23-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%3A+molecular%2C+cellular%2C+and+clinical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features.</a> Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).</li>
<li>Flynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Cooper, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+tuberculosis+in+interferon+gamma+gene-disrupted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice.</a> J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).</li>
<li>Dalton, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+of+immune+cell+function+in+mice+with+disrupted+interferon-gamma+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes.</a> Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).</li>
<li>Harty, J. T., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immunity+to+Listeria+monocytogenes+in+the+absence+of+IFN+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma.</a> Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+mice+that+lack+the+interferon-gamma+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor.</a> Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).</li>
<li>Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+effector+cells+default+to+the+Th2+pathway+in+interferon+gamma-deficient+mice+infected+with+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major.</a> J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).</li>
<li>Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+aroA-+infection+in+gene-targeted+immunodeficient+mice%3A+major+role+of+CD4%2B+TCR-alpha+beta+cells+and+IFN-gamma+in+bacterial+clearance+independent+of+intracellular+location%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location.</a> J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).</li>
<li>Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+IFN+gamma+in+protection+against+tumor+development+and+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).</li>
<li>Hodge, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+AU-rich+element+removal+promotes+chronic+IFN-gamma+expression+and+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice.</a> J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).</li>
<li>Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+and+lupus+nephritis+in+transgenic+mice+expressing+interferon+gamma+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis.</a> J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).</li>
<li>Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+interferon-gamma+and+interleukin-4+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus.</a> J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).</li>
<li>Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+affects+homing+of+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells.</a> J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).</li>
<li>Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Use+of+Interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical Use of Interferon-gamma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).</li>
<li>Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gammadelta+T+cells+in+alpha-galactosylceramide-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity.</a> J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).</li>
<li>Leonard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+single-dose+interleukin-12+exposure+on+interleukin-12-associated+toxicity+and+interferon-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.</a> Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).</li>
<li>Zenewicz, L. A., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%3A+a+short+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview.</a> Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).</li>
<li>Viegas, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+production+by+CD27%28%2B%29+NK+cells+exacerbates+Listeria+monocytogenes+infection+in+mice+by+inhibiting+granulocyte+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization.</a> Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).</li>
<li>Selvanantham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+and+Nod2+enhance+TLR-mediated+invariant+NKT+cell+activation+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection.</a> J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+9B.2+Listeria+monocytogenes%3A+cultivation+and+laboratory+maintenance%2C+Chapter+31B%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2013).</li>
<li>Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+animals+for+research--issues+to+consider+for+rodents+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits.</a> ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Obernier, J. A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+an+appropriate+period+of+acclimatization+following+transportation+of+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals.</a> ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).</li>
<li>BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf">http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf</a> (2007).</li>
<li>Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com/tutorials">http://www.flowjo.com/tutorials</a> (2016).</li>
<li>Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonizing+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+activity+enhances+Th1+immunity+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice.</a> J. Immunol. , (2015).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Amer+Stat+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nonparametric estimation from incomplete observations.</a> J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Brown, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+CD28-mediated+signals+in+T+helper+subset+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation.</a> J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+difference+in+anti-Listeria+resistance+of+C57BL%2F6+and+A%2FJ+mice+is+not+eliminated+by+active+immunization+or+by+transfer+of+Listeria-immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells.</a> Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%2C++Chapter+19%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li>
<li>Mekada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+among+C57BL%2F6+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Genetic differences among C57BL/6 substrains.</a> Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).</li>
<li>Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+transmission+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+via+ingestion+of+contaminated+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food.</a> J Vis Exp. (75), e50381(2013).</li>
<li>Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+in+E-cadherin+responsible+for+host+specificity+towards+the+human+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes.</a> Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).</li>
<li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129 (5), 891-902 (2007).</li>
<li>Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+Listeria+monocytogenes+to+CD8%2B+T+cells+requires+secretion+of+hemolysin+and+intracellular+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth.</a> J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).</li>
<li>Muraille, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dendritic+cell+activation+by+live+versus+killed+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes.</a> Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).</li>
<li>Datta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+Listeria+induces+protective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity.</a> Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).</li>
<li>Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+of+direct+ex+vivo+epitope+mapping+identifies+dominant+and+subdominant+CD4+and+CD8+T+cell+epitopes+from+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Listeria+monocytogenes+as+a+live+vaccine+vehicle+for+the+induction+of+protective+anti-viral+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).</li>
<li>Foulds, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+CD4+and+CD8+T+cells+are+intrinsically+different+in+their+proliferative+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.</a> J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes 25 bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J - Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo 31 eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenntnisse ...

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums 5 entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ - Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen 6 Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ - Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien 7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, S. typhimurium 13 und bestimmte Viren 11. Neben der Bekämpfung von Krankheitserregern, IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen Tumoren 14. Obwohl höhere Produktion von IFN-γ im Rahmen einer Infektion oder Krebs nützlich ist, verlängerte Produktion dieses Zytokins wurde t verknüpfto der Entwicklung von systemischer Autoimmunität 15-17 und der Beschleunigung von Diabetes Typ I in dem nicht-fettleibigen diabetischen Maus - Modell 18. Die Hauptquellen von IFN-γ sind : NK - Zellen, NKT - Zellen, γδ - T - Zellen, T - Helfer 1 (Th1) -Zellen, und zytotoxischen T - Lymphozyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ erhöht sowohl angeborenen und erworbenen Immunität durch: (1) Hochregulieren Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und II-Expression, (2) die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen zu erhöhen, (3) Verbesserung der Makrophagen Phagozytose und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und mikrobizide Faktoren (beispielsweise Stickstoffmonoxid und reaktive Sauerstoffspezies), (4) die Förderung der Differenzierung von naiven CD4 + T - Zellen in Th1 - Effektorzellen, (5) Förderung der Antikörperklasse Umschaltung auf Immunglobulin ( Ig) 2a und IgG3 (in der Maus), (6) Induzierung der Produktion von Chemokinen Immunzellen-Stellen von i zu rekrutierennfection und (7) Verbesserung der NK - Zellen und CTL - Antworten 5,19. Aufgrund der entscheidenden Bedeutung der IFN-γ in der Wirtsantwort auf Pathogene und Tumore, rekombinantes IFN-γ wurde als Behandlung für verschiedene Infektionen und Malignitäten (in 19 überprüft) getestet. Da jedoch die systemische Verabreichung von IFN-γ oder Th1 Zytokin Förderung Interleukin-12 (IL-12) mit Nebenwirkungen verbunden ist und dosisabhängige Toxizität 19,21 besteht ein Interesse alternative Strategien bei der Entwicklung von IFN-γ - Produktion zu erhöhen , indem Immunzellen. Entwicklung neuer Biologika und kleinen Molekülen erfordert in vivo Screening - Tools zu testen , ob solche Mittel während einer Immunantwort IFN-γ Produktion zu erhöhen , und ob dies in einer sinnvollen biologischen Wirkungen wie Erhöhung der das Überleben der Tiere. Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem grampositiven Bakterium L. monocytogenes ist ein Instrumental - Modell seitEntschlüsselung der Rolle von IFN-γ in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger 1,22. Infektion von Mäusen mit dem Pathogen intravenös oder intraperitoneal (ip) führt zur schnellen Verbreitung der Bakterien an der Milz und der Leber, wo sie von Makrophagen und Hepatozyten mit peak bakterielle Belastungen in der Milz internalisiert zwischen 3 und 4 Tage auftretenden post- Infektion 1,3,22. Produktion von IFN-γ durch NK - Zellen ist wichtig für die Makrophagenaktivierung und frühen Widerstand gegen den Erreger 3; jedoch bei hohen Infektionsdosen, die Produktion von IFN-γ kann auch auf Erreger - Clearance 23 schädlich sein. NKT - Zellen sind auch eine Quelle von IFN-γ in der Milz und Leber während der frühen Kontrolle von Pathogenen 2,24 und diese Produktion wurde 2 gezeigt , IFN-γ - Produktion durch andere Zelltypen , einschließlich NK - Zellen verstärken. Auf der anderen Seite, die später wirkenden adaptive T - Lymphozyten, CD8 + T - Zellen in partidere sind wichtig für das Spiel des Erregers zu vermitteln und den Schutz gegen eine erneute Infektion 1,4,22 bereitstellt. Diese Infektionsmodell wurde für eine Reihe von Gründen für Forscher attraktiv war ( beschrieben in 1). Erstens, eine Infektion mit dem Pathogen ist in hohem Maße reproduzierbar und induziert eine starke Th1 und zellulären Immunantwort. Zweitens, während subletalen Infektion wird bakterielle Belastung in der Leber und der Milz konzentriert, wo es kann leicht gemessen werden. Drittens kann der Erreger sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen behandelt werden. Viertens der Organismus und die Immunantwort, dass es weitgehend charakterisiert worden erzeugt. Schließlich wurde eine Vielzahl von Mutanten und genetisch veränderte Stämme entwickelt, die für die Verwendung zur Verfügung stehen. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für die Impfung von C57BL / 6J - Mäuse mit dem EGD Stamm von L. monocytogenes und 25 für IFN Messung - γ reAntworten von NK, NKT und adaptive Lymphozyten nach der Infektion. Beschrieben ist , wie bakterielle Belastung in der Milz und Leber nach subletalen Infektion zu messen , und die Überlebensstudien nach der Infektion durchgeführt werden mit einer modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens. Schließlich werden repräsentative Daten gezeigt, wie kann dieses Protokoll verwendet werden , um die Wirkung neuer Therapien auf IFN-γ - Antworten und das Überleben der Mäuse zum Screening von L. monocytogenes Infektion.

<table><tbody><tr><td>Gehirn Herz Infusionsbrühe, modifiziert</td><td>BD</td><td>299070</td><td>jede Marke sollte passend sein</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>jede Marke sollte passend sein</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>jede Marke sollte passend sein</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>jede Marke sollte passend sein</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (NH3Cl)</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td></td><td></td><td>jede Marke sollte angemessen sein</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte angemessen sein</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td>jede Marke sollte angemessen sein</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>Vor Gebrauch bei 56° Hitze inaktivieren; C für 30 min</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>GolgiStop Protein Transport Inhibitor (enthält Monensin)BD</td><td></td> <td>554724</td><td>verwenden 4 &mu; l in 6 ml Zellkultur</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehye</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Verdünnung auf 4 % PFA in ddH2O oder 1x PBS</td></tr><tr><td>10x Perm/Wash Puffer</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Verdünnung 1x in ddH2O Fc-Block</td></tr><tr><td>, Anti-Maus CD16/CD32 Aufgereinigt</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Verdünnung 1:50</td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>1:1.000 verdünnen (wir haben auch Viabilitätsfarbstoffe von Molecular Probes verwendet)</td></tr><tr><td>anti-Maus CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>15-0041</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD8-FITC (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>PBS57/mCD1d tetramer-APC</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td>N/A</td><td>Bezogen als Geschenk von der Einrichtung</td></tr><tr><td>anti-Maus TCR&beta;-PE-Cy7 (H56-597)</td><td>eBioscience</td><td>25-5961</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>Anti-Maus NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td><td>eBioscience</td><td>47-3351</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 PE-Cyanin7 (30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0451</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>Anti-Maus IFN gamma-PE (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>12-7311</td><td>Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.</td></tr><tr><td>OneComp</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-1111</td><td>Verwenden Sie einen Tropfen pro Färbung</td></tr><tr><td>Maus IFN Gamma ELISA-Kit</td><td>eBioscience</td><td>88-7314</td><td>Wird zur Messung des Interferon-Gammas im Kulturüberstand</td></tr> verwendet <tr><td>50 ml belüftete Röhrchen für die Kultur</td><td></td><td></td><td>Wird für die Kultivierung der Bakterien verwendet, jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>bakterielle Petrischalen</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>2 ml Cyroviale</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>UV-Spektrometer</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Sicherheitsnadeln</td><td></td><td></td> Jede <td>Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratorien</td><td>Lager # 000664</td><td>Bestellen für Ankunft in 7 Wochen</td></tr><tr><td>Bleiche</td><td></td><td></td><td>Für die Dekontamination</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Für die Dekontamination</td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td></td><td></td><td>jeder Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor</td><td></td><td></td><td>, Eimer, Eimerabdeckungen.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td>jeder Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Steriles Glycerin</td><td>jede Marke sollte geeignet sein</td>Pipettenspitzen <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>70 Mikron Siebe</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>3 ml Spritze</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Pipettenpistole</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Filtrationseinheiten</td><td></td><td></td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td></td><td></td><td>Verdünnt 1 bis 9 in ddH2O, jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td>jeder Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr>Platten <td></td><td></td> mit<td>rundem Boden</td><td>Jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>FACs Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>Jedes Durchflusszytometer kann für die Erfassung verwendet werden, das über eine geeignete Laserkonfiguration und einen Filtersatz verfügt, um die Fluorochorme zu diskriminieren</td></tr><tr><td>Flowjo Software</td><td>Treestar</td><td></td><td>Wird für die Datenanalyse verwendet. Andere Arten von Datenanalysesoftware sind ebenfalls geeignet</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipetten (0 - 300 & Mikro; l)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Wird zum Waschen von Zellen und zum Hinzufügen von Antikörpern während der Durchflusszytometrie-Färbung verwendet</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td></td><td></td><td>Wird zum Waschen von Glasperlen verwendet, jede Marke sollte geeignet sein</td></tr><tr><td>Mikrobank Bakterielles Konservierungssystem</td><td>Pro-lab Diagnostik</td><td></td><td>Wird als Alternative zu Glycerinvorräten für die Langzeitlagerung von Bakterien verwendet</td></tr></tbody></table>

experimentelle infektion mit<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; als modell für die untersuchung host-interferon-γ antworten

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers 1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ - Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion 4. Die L. monocytogenes - Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ - Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J - Mäusen zu führen und IFN-γ - Produktion durch NK - Zellen, NKT - Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 5 CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR &amp; agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkontrolle b...

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Die allgemeinen Ziele dieses Protokolls bestehen darin, C57 Blacksix-Mäuse mit dem EGG-Stamm von Listeria monocytogenes zu infizieren und die bakterielle Belastung, die Interferon-gamma-Antwort sowie das Überleben und die Reaktion auf die Infektion mit diesem Pathogen zu messen. Dieses Protokoll kann Forschern helfen, Wirkstoffe oder Gene zu identifizieren, die einen Einfluss auf die Interferon-gamma-Antwort und das Überleben der Tiere nach bakterieller Infektion haben. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie im Labor relativ einfach einzurichten ist.Auch für Personen mit wenig Erfahrung in der Kultivierung von Bakterien. Die Verfahrensweise wird außerdem von Jennifer Ahn, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, eine sterile Pipettenspitze in eine bei Raumtemperatur aufgetaute Glycerin-Stammlösung des L. monocytogenes EGG-Stamms einzutauchen.Und streichen Sie die Spitze sofort hin und her über einen Bereich einer Brain-Heart-Infusion- oder BHI-Platte. Dies ist der primäre Strich. Drehen Sie die Platte um 90 Grad und ziehen Sie eine frische Pipettenspitze durch den ersten Strich, um die Kultur auf das nächste Viertel der Platte zu verteilen.Dies ist der sekundäre Strich. Drehen Sie dann die Platte und verteilen Sie den sekundären Strich auf einem dritten Viertel der Platte, um den tertiären Strich anzulegen. Drehen Sie die Platte nun um und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius über Nacht. Einzeln stehende, gleichförmige Kolonien sollten zwischen 16 und 24 Stunden in der letzten Strichreihe sichtbar sein. Sobald die Kolonien erscheinen, geben Sie 10 Milliliter steriles BHI-Brühe in ein steriles, belüftetes 50-Milliliter-Röhrchen und übertragen mithilfe einer sterilen Pipettenspitze eine L. monocytogenes-Kolonie von der Platte in die Brühe. Kultivieren Sie die beimpfte Brühe über Nacht bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute in einem schüttelnden Inkubator, bis der OD600 den Wert eins erreicht.Für die Herstellung des experimentellen L. monocytogenes-Infektionsinokulums pipettieren Sie im Sicherheitswerkbank 100 Mikroliter der Übernachtkultur in ein Röhrchen mit BHI-Medium. Nach einer weiteren Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, bis der gewünschte OD600 erreicht ist, überführen Sie die Kultur in ein steriles Zentrifugenröhrchen zur Zentrifugation. Saugen Sie den Überstand mithilfe eines Vakuums, das an einen Fangkolben mit Bleichmittel angeschlossen ist, ab.Das Pellet zwei Mal unter denselben Zentrifugierbedingungen mit PBS waschen. Nach dem zweiten Waschschritt die Bakterien in PBS resuspendieren und auf die geeignete Konzentration verdünnen. Um die gewünschte Kolonie-bildende Einheit (CFU) in einem Volumen von 200 Mikrolitern jedem Maus zu verabreichen.Mischen Sie die Suspension anschließend gründlich mit einer sterilen Pipettenspitze, um eine gleichmäßige Verteilung der Bakterien sicherzustellen. Ziehen Sie dann 200 Mikroliter Inokulum in eine sicherheitstechnisch optimierte Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Greifen Sie nun mit der weniger dominanten Hand den Nacken eines Mäuses am losen Hautgewebe über den Schultern. Injizieren Sie alle 200 Mikroliter des Inokulums in das untere Quadrant des Abdomens, knapp lateral zur Mittellinie, um die Blase zu schonen, wobei für jedes Tier eine neue Nadel und ein neuer Spritzenkolben verwendet werden. Um die maximale bakterielle Belastung während der Infektion zu bestimmen, fixieren Sie am dritten Tag nach der Infektion die Gliedmaßen eines Versuchstieres in Rückenlage auf einem Präparationsbrett. Desinfizieren Sie anschließend die Haut mit 70 Prozent Ethanol.Unter Verwendung steriler, robuster Scheren einen Schnitt von der Brust bis zur Leiste anlegen. Anschließend je einen Schnitt von der mittleren Leiste zum Knie und von der mittleren Brust zum Ellbogen führen. Die Haut stumpf dissezieren und zurückklappen, dabei mit Nadeln der Stärke 25 fixieren.Desinfizieren Sie die Muskelschicht mit weiterem 70-prozentigem Ethanol. Anschließend führen Sie mit sterilen feinen Scheren einen medianen Schnitt in der Bauchdecke durch. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Xiphoidfortsatz zu fassen.Erstellen Sie Einschnitte in der Bauchdecke, beginnend am Schwertfortsatz und seitlich auf jeder Seite entlang. Folgen Sie dem Rippenbogen bis knapp unter das Zwerchfell. Dadurch wird die Leber sichtbar.Verwenden Sie anschließend sterile Scheren, um ein etwa 100 Milligramm schweres Stück aus einem Lappen herauszuschneiden. Legen Sie das Gewebe in eine vorab gewogene 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre, die 0,2 bis 0,3 Gramm sterile, säuregewaschene Glasperlen mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 Millimetern enthält. Benutzen Sie die Pinzette, um vorsichtig die Organe auf der linken Seite der Bauchhöhle beiseitezuschieben, um die Milz sichtbar zu machen.Greifen Sie mit der Pinzette vorsichtig auf die Milz zu, schneiden Sie das umgebende Bindegewebe ab, um das Organ aus der Bauchhöhle zu lösen. Legen Sie die Milz in ein anderes Röhrchen als die Leber und bringen Sie die Gewebe in einem auslaufsicheren Behälter mit Eis in das Labor. Schütteln Sie die Röhrchen unter Verwendung eines Kugelmühlen-Homogenisators drei Minuten lang mit einer Frequenz von 30 Hertz.Danach bereiten Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe der Homogenate in 0,1 Prozent Trident X-100 in PBS vor. Anschließend verteilen Sie mit einem sterilen Glasstrich 100 Mikroliter jeder verdünnten Probe auf einer BHI-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator.Behalten Sie die Platten, die bis zu 300 Kolonien pro Platte enthalten. Zählen Sie die Kolonien auf jeder Platte. Um CD4 in den Interferon-gamma-Antworten von CT8-T-Zellen zu messen, gewinnen Sie die Milzen von Mäusen, die wie eben gezeigt mit zwei Zehnteln in die vierte Potenz CFU des Erregers infiziert wurden.Verarbeiten Sie die Milzen zu einer einzigen Suspension lebender roter Blutkörperchen. Resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem RPMI-Medium mit FCS auf eine Konzentration von vier mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter. Anschließend geben Sie je ein Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung in eine 24-Loch-Platte, zusammen mit einer gleichen Volumenmenge aufgetauter, hitzeinaktivierter L. monocytogenes, und stellen die kalten Kulturen in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator.Nach 20 Stunden 0,66 Mikroliter pro Milliliter Proteinentransportinhibitor zu den Vertiefungen geben und die Platte erneut in den Inkubator stellen. Vier Stunden später im Sicherheitswerkbank 500 Mikroliter Kulturüberstand sammeln und die Proben bei minus 80 Grad Celsius einfrieren, um später die Interferon-gamma-Konzentration mittels ELISA zu bestimmen.Anschließend die Zellen in ein einzelnes steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführen, die Vertiefungen mit PBS waschen und die Waschflüssigkeit mit den gesammelten Zellen vereinigen, um eine Durchflusszytometrie-Färbung und -Analyse durchzuführen. Die maximale bakterielle Belastung tritt zwei bis drei Tage nach der Infektion in der Milz auf und wird durch die Gabe eines PPAR-Alpha-Antagonisten vor der Infektion deutlich verringert.Sieben Tage nach der Infektion führt die Reizstimulation von CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen aus der Milz ex vivo mit hitzeinaktiviertem Erreger zu einer positiven Interferon-gamma-Antwort von CD4-positiven und CD8-positiven Zellen, die mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Die Behandlung mit dem PPAR-alpha-Antagonisten vor der Infektion verstärkt die Interferon-gamma-Antworten der CD4- und CD8-Zellen. Darüber hinaus erhöht die Behandlung mit dem PPAR-alpha-Antagonisten die Überlebensrate nach Infektion mit der LD50-Dosis des Erregers, was die Eignung dieses Modells zur Untersuchung des Einflusses neuer Wirkstoffe, die die Interferon-gamma-Antwort modulieren, auf das Überleben infizierter Tiere verdeutlicht.Wenn einmal beherrscht, können alle Verfahren in diesem Protokoll bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb mehrerer Wochen die gewünschten Daten liefern. Die Technik kann weiter angepasst werden, indem Mäuse mit Stämmen von Listeria monocytogenes infiziert werden, die Modellantigene exprimieren, und MAC-Klasse-I- und -II-Tetramer-Reagenzien verwendet werden, die spezifisch für diese Antigene sind. Dies ermöglicht es, die Expansion von T-Zellen nach der Infektion zu messen.Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik zu einem entscheidenden Modell, um die Rolle von Interferon-gamma bei der Wirtsimmunität gegenüber intrazellulären Pathogenen zu entschlüsseln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C57 Blacksix-Mäuse kultiviert und mit Listeria monocytogenes infiziert, sowie wie man die Belastung durch die Infektion und die darauf folgenden Interferon-gamma-Antworten misst.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Listeria monocytogenes für immungeschwächte Personen wie schwangere Frauen, Kleinkinder oder ältere Menschen gefährlich sein kann. Daher sollte der Erreger nur von immunkompetenten Personen unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei gehandhabt werden.

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Listeria monocytogenes ist ein Modellorganismus für die Untersuchung Immunreaktionen und die genetische Anfälligkeit für Bakterien bei Mäusen intrazellulär. Diese Methode ermöglicht ein bis bakterielle Belastung zu messen und generieren Single-Cell-Suspensionen der Leber und Milz von Mäusen für FACS-Analyse auf Veränderungen in Immunzellen durch Listeria-Infektion zu bestimmen.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Quelle: Seman, B. G. et al. Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)Das Video demonstriert ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung systemischer Infektionen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien. Neugeborene Welpen werden mit hoch- oder niedrigdosierten bakteriellen Suspensionen injiziert und zur Nachsorge zu ihrer Mutter zurückgegeben. Die gekapselten Bakterien entgehen der frühen Immundetektion, breiten sich systemisch aus und werden...

Modellierung von Infektionen bei neonatalen Mäusen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien

Quelle: Radulovic, K., et al. Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, um das Eindringen mikrobieller Produkte nach dem Durchbruch der Darmbarriere nachzuahmen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur intraperitonealen Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) in Mäuse, um systemische Entzündungen zu induzieren.

Intraperitoneale Injektion von bakteriellem Lipopolysaccharid bei Mäusen zur Untersuchung systemischer Immunantworten

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Dieses Video zeigt eine bildgebende Methode zur Visualisierung der in situ Interferon-gamma (IFN-γ) Sekretion in der Milz der Maus. Nach einer bakteriellen Infektion und der Induktion der IFN-γ-Akkumulation in T-Zellen und natürlichen Killerzellen wird die Milz aus der Maus entnommen. Nach der Entnahme von Gewebeschnitten wird eine Immunfärbung durchgeführt, um IFN-γ in den Zellen sichtbar zu machen.

Assay zur Identifizierung der Interferon-gamma-Sekretion in lymphatischen Organen der Maus

Dieses Video zeigt die Quantifizierung der infektiösen Bakterienlast aus dem perfundierten Mäusegehirn, das mit Listeria monocytogenes infiziert ist.

Beurteilung der bakteriellen Besiedlung in einem Mäusegehirn nach einer Infektion mit Listeria monocytogenes

Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren für die orale Infektion von Mäusen...

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Hier beschreiben wir eine einfache konfokale Bildgebungsmethode, um die In-situ-Lokalisierung von Zellen zu visualisieren, die das Zytokin Interferon-Gamma in murinen sekundären Lymphorganen absondern. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung anderer Zytokine in verschiedenen Geweben erweitert werden.

Bildgebung der In Situ Interferon Gamma Produktion in der Maus Milz nach Listeria monocytogenes Infektion

Erfahren Sie die experimentelle Infektion mit Listeria monocytogenes zur Untersuchung von Interferon-γ-Antworten bei C57BL/6J-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Reaktionen und Überlebensraten.

Experimentelle Infektion mit

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