Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, spontan aktive Sinusknotenmyozyten aus Mäusen für kurz- oder mittelfristige elektrophysiologische oder bildgebende Experimente zu isolieren. Isolierte Sinusknoten-Myozyten sind wichtig für die Untersuchung kardialer Schrittmachermechanismen, insbesondere für die Untersuchung spezifischer Ionenströme oder des Zeitpunkts der intrazellulären Kalziumfreisetzung. Aber relativ wenige Labore verwenden isolierte Sinusmyozyten von Mäusen, zum Teil, weil es sehr schwierig ist, das Verfahren allein mit schriftlichen Methoden zu lernen.

Nachdem Sie alle erforderlichen Lösungen für die Isolierung vorbereitet haben, entfernen Sie das Fell mit einer Schere von der Brust des Tieres. Durchschneiden Sie dann den Brustkorb, um die Brusthöhle mit einer externen Gewebezange und einer Präparierschere freizulegen. Spülen Sie die Brusthöhle mit zwei Millilitern erwärmten kompletten Tyrode's mit Heparin.

Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig die Lunge und den Thymus mit einer internen Schere und einer Präparierzange. Während Sie die Herzspitze vorsichtig festhalten, schneiden Sie vorsichtig die untere Hohlvene und die Aorta ab, um das Herz aus der Brusthöhle zu entfernen. Übertragen Sie dann das Herz in eine der Silikon-Sezierschalen und spülen Sie es dann mit zwei bis vier Millilitern erwärmten heparinisierten kompletten Tyrode's aus.

Richten Sie das Herz so aus, dass die hinteren Gefäße sichtbar sind und nach oben zeigen. Als nächstes immobilisieren Sie das Herz, indem Sie es durch die Spitze in die Silikon-Sezierschale stecken. Lokalisieren Sie anschließend die Rille zwischen den Ventrikeln und den Vorhöfen.

Machen Sie mit der internen Präparierschere einen Schnitt an der Rinne, während Sie sie nahe an den Ventrikeln halten. Spülen Sie die Rille und den Schnitt nach Bedarf mit zusätzlich erwärmten heparinisierten kompletten Tyrode's, um eine freie Sicht auf die Vorhöfe und die Klappen zu ermöglichen. Schneiden Sie dann weiter entlang der Rille, um die Vorhöfe von den Ventrikeln zu trennen.

Übertragen Sie anschließend das Vorhofgewebe in die zweite Silikondissektionsschale und spülen Sie sie mit drei Millilitern erwärmten heparinisierten vollständigen Tyroden aus. Anschließend wird das Präparat vorsichtig gedehnt und das Gewebe durch die untere Hohlvene gesteckt. Drehen Sie dann das Taschentuch so um, dass sich der rechte Vorhof des Tieres nun auf der linken Seite des Experimentators und der linke Vorhof auf der rechten Seite des Experimentators befindet.

Es ist sehr wichtig, die Orientierung zu erhalten und zu erkennen, um das richtige Gewebe zu isolieren. Fahren Sie fort, das Gewebe durch die obere Hohlvene und dann durch die rechten und linken Vorhofanhänge zu stecken. Entfernen Sie restliches Fett oder anderes Gewebe, um eine klare Sicht auf das Präparat zu ermöglichen.

Öffnen Sie anschließend die Vorderwand der Vorhöfe, indem Sie die Hohlvene durchschneiden. Drehen Sie die Schale nach Bedarf, um sowohl die obere als auch die untere Hohlvene zu präparieren. Positionieren Sie die Stifte nach Bedarf neu, um das interatriale Septum sichtbar zu machen.

Schneiden Sie dann entlang des interatrialen Septums, um den linken Vorhof zu entfernen. Stecke das Präparat wieder fest, dehne es vorsichtig und entferne das Fett hinter dem Sinusknoten. Danach entfernen Sie das rechte Vorhofohr und befreien dann den Sinusknoten, indem Sie entlang der Crista terminalis schneiden, die als dunkelorangefarbener Streifen erscheint, der an das Vorhofohr grenzt.

Stecken oder lösen Sie das Knotengewebe wieder und schneiden Sie es seitlich ab, um drei gleich große Streifen zu erhalten. Bei diesem Verfahren werden mit der schmalen, feuerpolierten Pipette drei Streifen Sinusknotengewebe in das erste der drei kleinen Röhrchen mit rundem Boden mit 2,5 Millilitern kalziumarmer Magnesium-Tyrode übertragen und fünf Minuten lang inkubiert. Übertragen Sie die Gewebestreifen nach fünf Minuten in das zweite kleine Röhrchen mit rundem Boden, das 2,5 Milliliter kalziumarme Magnesium-Tyroden enthält.

Waschen Sie die Gewebestreifen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken oder mit der schmalen Pipette vorsichtig pipettieren. Drehen Sie das Rohr nicht um. Übertragen Sie dann die Gewebestreifen in das dritte kleine Röhrchen mit rundem Boden, das 2,5 Milliliter kalziumarme Magnesium-Tyroden enthält, und wiederholen Sie den Waschschritt.

Übertragen Sie anschließend die Streifen in das große runde Bodenröhrchen, das 2,5 Milliliter kalziumarme Magnesium-Tyroden mit Enzymen enthält. Mischen Sie alle fünf Minuten, indem Sie die Tube vorsichtig schwenken. Nach dem Enzymaufschluss werden die Gewebestreifen mit einer schmalen, feuerpolierten Pipette vorsichtig in das erste der drei kleinen Röhrchen mit rundem Boden mit der modifizierten KB-Lösung überführt.

Übertragen Sie dann die Streifen durch das zweite und dritte kleine Röhrchen mit rundem Boden, um das Gewebe zu waschen, bevor Sie es in das große Röhrchen mit rundem Boden übertragen, das die KB-Lösung enthält. Mit der größeren, feuerpolierten Pipette dissoziieren Sie die Zellen in dem großen Röhrchen mit rundem Boden durch ständiges Verreiben, wobei Sie darauf achten, dass das Dissoziationsröhrchen in das 35 Grad Celsius heiße Wasserbad eingetaucht bleibt und keine Blasen in die Lösung gelangen. Wir haben festgestellt, dass ein gewaltsames Ausstoßen der Lösung mit einer Frequenz von etwa einem pro Sekunde oder einem Hertz am besten funktioniert.

Geben Sie nun 75 Mikroliter Natriumchlorid-Calciumchlorid-Anpassungslösung in das Gewebe. Zum Mischen vorsichtig schwenken und fünf Minuten lang inkubieren. Fügen Sie weiterhin Kalzium in Schritten hinzu, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Nach der Calcium-Readaptation sammeln Sie die Sinusmyozyten, indem Sie sie etwa 10 Minuten lang absetzen lassen oder indem Sie drei Minuten lang bei 2.000 g zentrifugieren. Bei akut isolierten Zellen etwa fünf Milliliter des Überstands vorsichtig mit einer Transferpipette entfernen und verwerfen. Lagern Sie die Zellen dann bis zu acht Stunden bei Raumtemperatur für Patch-Clamp-Experimente.

Anschließend können funktionelle Beurteilungen der isolierten sinoatrialen Myozyten mittels Patch-Clamp-Aufzeichnungen für spontane Aktionspotentiale und Membranströme durchgeführt werden. Spontan aktive sinusale Myozyten können bis zu sechs Tage in Kultur gehalten werden. Die kultivierten Zellen behalten eine Gesamtmorphologie bei, die der der akut isolierten Sinusmyozyten sehr ähnlich ist, ohne signifikante Veränderungen in der durchschnittlichen Länge, Breite, Querschnittsfläche oder Membrankapazität der kultivierten Zellen im Vergleich zu den akut isolierten Zellen.

Die Zellen eignen sich für eine Reihe von experimentellen Studien, wie z. B. Strom- und Spannungszangenaufzeichnungen. Beispielhaft sind hier spontane Handlungspotentiale und die lustige Strömung dargestellt. Sobald Sie die Sinusknotendissektion, die Isolierung und die Wiedereinführung von Kalzium gemeistert haben, können Sie die Zellen für Ihre Experimente bereit haben.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Ausrichtung des Gewebes entscheidend für eine gute Dissektion ist und dass die enzymatischen und mechanischen Dissoziationsschritte optimiert werden sollten, wie im Text beschrieben. Nach diesem Verfahren können die isolierten Sinusknotenmyozyten für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden, einschließlich Einzelzell-Elektrophysiologie, Kalzium-Bildgebung und Immunzytochemie. Die Zellen können auch in Kultur für Experimente aufbewahrt werden, die eine Genmanipulation oder die Expression von Reportermolekülen erfordern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Sinusmyozyten von erwachsenen Mäusen isoliert. Viel Glück bei Ihren Experimenten.