Name: In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Lernen Sie die Elektroporation für Gentransfer auf Schwann-Zellen im Nager-Ischiasnerv. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Myelinisierungsmechanismen im peripheren Nervensystem.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie an M.I. (21229004 und 25221304) unterstützt.

Die Verwendung von Ratten für die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Ausschusses für Tierschutz gegründet von der University of Tokyo. 1. Herstellung von Plasmid-DNA <ol><li> Erzeugen DNA - Plasmiden für in vivo Elektroporation durch Subklonieren der cDNA oder shRNA - Sequenz in einem Expressionsplasmid für Säugerzellen 12. Verwenden Sie einen Cytomegalovirus Immediate Early - Enhancer und Huhn β-Aktin - Promotor Fusion (CAG) Promotor getriebene Plasmid 13 , weil es starke und stabile Expression ermöglicht. Zur Expression von shRNAs unter der Kontrolle eines CAG - Promotor, verwenden eine mir30 Basis shRNA Kassettensystem zum Subklonieren der shRNA 14. </li><li> Reinige Plasmid DNA mit einer maxi-prep Kits nach den Anweisungen des Herstellers, und Resuspendieren der DNA mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (140 mM NaCl, 0,75 mM Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Passen Sie die Konzentration von DNA ug / ul zu ≥ 4. </li><liBereiten Sie&gt;, um die Plasmid-DNA-Lösung auf eine Konzentration von 4 ug / ul, und fügen Sie eine minimale Menge an schnell grünen Farbstoff (Endkonzentration 0,01%) an der Injektionsstelle zu beschriften. Wenn gleichzeitige Elektroporation von mehreren Plasmiden erforderlich ist, stellen die Gesamtkonzentration der Plasmid-DNA-Lösung auf 4 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l. Anmerkung: Die optimale Zusammensetzung von Plasmid DNAs sollte entsprechend der Transfektionseffizienz von jedem Plasmid bestimmt werden. </li></ol> 2. Sterilisation von chirurgischen Instrumenten und Saline <ol><li> Autoklav chirurgischen Instrumenten und der 0,9% NaCl-Lösung. </li></ol> 3. Herstellung der Glasmikropipette <ol><li> Ziehen Glaspipetten mit einer Pipette Abzieher. Schneiden Sie die Spitze der Pipette auf einen Durchmesser von 30 bis 50 &amp; mgr; m. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Hitze, 600; Geschwindigkeit, 50; Zeit, 75. </li></ol> 4. Tierchirurgie, DNA-Injektion und Elektroporation Hinweis: Ein überAnsicht dieses Schrittes ist in Figur 1 beschrieben ist . Obwohl das Verfahren für die Rattenjungen hier beschrieben werden, ist das Verfahren auch anwendbar auf reiferen Tieren nach dem gleichen Verfahren. <ol><li> Anästhesieren die Ratte mit Isofluran in dem Induktionsfeld, bis das Tier durch Einstellen der Sauerstoffströmung auf 0,4 L / min und der Isofluran-Konzentration auf 4% (vol / vol) unbeweglich wird. Führen Zehen Kneifen richtigen anesthetization zu bestätigen. </li><li> Legen Sie die Ratte auf den vorgeheizten wärmer unter dem Binokular und Anästhesie aufrechtzuerhalten, indem kontinuierlich Isofluran durch die Gesichtsmaske verabreicht wird. Einstellen der Sauerstofffluss auf 0,2 L / min und der Isofluran-Konzentration auf 2% (vol / vol). Verwenden Sie Augentropfen Trockenheit Augen zu verhindern, wenn die Augen des Tieres geöffnet sind. </li><li> Befestigen Sie die Beine mit chirurgischen Band. </li><li> Reinigen Sie die Haut an der hinteren Oberschenkel mit PVP-Jod, und machen einen Schnitt mit dem Skalpell. Hinweis: Shave chirurgische Bereiche, wenn die chirurgische Bereiche mit h abgedeckt sindLuft. </li><li> Setzen Sie die Ischiasnerv durch eine Öffnung zwischen den Quadrizeps femoris zu schaffen und Bizeps femoris mit Nähnadeln. </li><li> Wet den Nerv mit 0,9% NaCl-Lösung. Absorbieren überschüssiges Wasser mit einem fusselfreien Papier. </li><li> Legen Sie die Basis einer Glasmikropipette auf flexible Schläuche, und füllen Sie die ausreichende Menge an DNA-Lösung (mindestens ein Mikroliter) in die Mikropipette vorsichtig abgesaugt. </li><li> Heben Sie den freiliegenden Nerv durch sanft die distale Seite des Nerven ziehen mit einer Nadel. Hinweis: Legen Sie keine Spannung auf die Nerven mechanische Belastung zu minimieren. </li><li> Legen Sie die Glasmikropipette in die distale Stelle auf die Nerven, und injizieren durch Druck der DNA - Lösung (dh durch in das offene Ende des flexiblen Schlauchs weht). Injizieren DNA-Lösung, bis die Nerven grün (1 ul maximal) erscheint. Da häufiges Einsetzen des Mikro die Nerven schädigen können, legen Sie nicht die Mikropipette mehr als doppelt so hoch. </li><li> Legen Sie eine TWEezer-Typ Platinelektrode etwa 1-2 mm vom Nerv. Füllen Sie die Lücke zwischen der Elektrode und dem Nerven mit 0,9% NaCl-Lösung. Hinweis: Schließen Sie den Nerv mit der Elektrode nicht länger auf die Nerven mechanische Belastung zu vermeiden. </li><li> Übernehmen von elektrischen Impulsen auf die Injektionsstelle eine Elektroporator mit der Elektrode. Nach dem ersten Impuls gesetzt, um die Elektrode zu invertieren und einen weiteren Impuls Satz anzuwenden. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Spannung, 50 V; Pulsdauer von 5 ms; Impulsintervall 100 ms; Pulszahl, 4 mal. </li><li> Reinigen Sie die Elektroporation Stelle mit 0,9% NaCl-Lösung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,11 auf der Gegenischiasnerv. </li></ol> 5. Post-Elektroporation <ol><li> Schließen Sie die Schnitte mit Sekundenkleber. </li><li> Nach den Leim trocknen, reinigen Sie die Wunde mit PVP-Jod. </li><li> Lassen Sie den Welpen aus der Gesichtsmaske. Wärmen Sie den Welpen auf einem wärmeren zumindest für eine Stunde, um es zu ermöglichen, vollständig aus der Narkose zu erholen. Do nicht den Welpen unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat. </li><li> Nach der Erholung von der Anästhesie, kehren den Welpen der Mutter Ratte. Sie nicht den Welpen zurück, bis vollständig erholt. </li></ol> 6. Post-Chirurgie <ol><li> Haus die Rattenjungen in den Käfig , bis der Durchführung der Experimente 11 (siehe Beispiele in Abbildung 3). Verabreichen Carprofen (5 mg / kg, IP), ein nicht-steroidales entzündungshemmendes Medikament, oder Buprenorphin (0,1 mg / kg, sc), ein Opioid-Analgetikum, falls erforderlich. Hinweis: Wenn die Rattenjungen nicht gut wachsen oder Entzündung ist rund um die Operationsstelle beobachtet, ausschließen, das Tier aus den Experimenten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode, die einen in vivo Gentransfer zu myelinisierenden SCs im Ischiasnerv der Ratte mittels Elektroporation ermöglicht. Diese Methode ermöglicht eine hochselektive Genexpression in myelinisierenden SCs, indem einfach elektrische Impulse an den Plasmid-DNA-injizierten Ischiasnerv angelegt werden. Da die molekularen Mechanismen der Myelinisierung und Demyelinisierung im peripheren Nervensystem noch unklar sind, wird die vorliegende in vivo Elektroporationsmethode ein leistungsfähiges Werkzeug sein, um die Rolle mehrerer Gene von Interesse bei lebenden Tieren zu klären.
Eine wichtige Voraussetzung für diese Methode ist es, die Schädigung des Nervs während der Operation auf ein Minimum zu beschränken. Sollte eine chirurgische Schädigung eine übermäßige Entzündung verursachen, kann der Ischiasnerv degenerieren. Um dies zu vermeiden, muss man die Operation mit äußerster Sorgfalt durchführen, um die Blutgefäße um den Nerv herum nicht zu beschädigen. Auch mechanische Belastungen des Nervs während der Operation können eine Ursache für Nervenschäden sein. Um die mechanische Belastung zu minimieren, sollte das Anheben des freiliegenden Nervs so sanft wie möglich erfolgen und die Pinzettenelektrode berührungslos in der Nähe des Nervs platziert werden. Darüber hinaus können zu starke elektrische Impulse zu unerwünschten großen Beinbewegungen führen, die zu mechanischer Belastung führen, oder den Nerv verbrennen. Werden signifikante Schäden an den Nerven beobachtet, empfehlen wir, die elektrischen Impulsintensitäten zu reduzieren oder die Elektrode weiter vom Nerv entfernt zu platzieren.
In unserem vorliegenden Protokoll wurden CAG-Promotor-getriebene Plasmide als Expressionsvektoren verwendet. CAG-Promotor-getriebene Plasmide ermöglichen eine hohe Genexpression in myelinisierenden SCs in vivo. Wir haben auch einen CMV-Promotor ausprobiert, einen weiteren weit verbreiteten universellen Promotor für die Genexpression von Säugetieren, aber die Expression des Genprodukts war sehr schwach. Dies steht im Einklang mit früheren Ergebnissen, in denen eine Elektroporations-vermittelte Transfektion im embryonalen Gehirn durchgeführt wurde20. Daher empfehlen wir die Verwendung von CAG-Promotor-getriebenen Plasmiden für die in vivo Elektroporationsmethode.
Da die axonale Signalübertragung ein Schlüsselfaktor bei der Myelinisierung/Demyelinisierung ist21, ist auch die Genmodifikation in Neuronen wichtig. Die Verabreichung von Transgenen mit unserer in vivo Elektroporationsmethode ist jedoch auf SCs beschränkt. Es wurde berichtet, dass die Genübertragung in Ischiasnervenaxone erreicht werden kann, wenn in vivo Elektroporation auf Neuronen des Spinalganglion (DRG) bei erwachsenen Ratten angewendet wird22. Dies deutet darauf hin, dass die Abgabe von Plasmid-DNA an den Zellkörper wahrscheinlich entscheidend für die in vivo Transfektion peripherer Axone ist. Um die Beteiligung axonaler Moleküle an der Myelinisierung/Demyelinisierung zu untersuchen, sollten Forscher daher neuronenspezifische genetische Methoden wie genetisch veränderte Tiere, neuronenspezifische virale Vektoren oder in vivo Elektroporation zu DRG-Neuronen verwenden.
Im Vergleich zu derzeitigen Methoden, wie der Erzeugung genetisch veränderter Tierlinien23 und der Verabreichung von Transgenen durch virale Vektoren4-6, ist die Genmodifikation von SCs durch In-vivo-Elektroporation einfacher. Diese Methode benötigt nur einige Tage für den Aufbau der Plasmid-DNA und einen Tag für die Elektroporationsoperation. Für die Konstruktion von Plasmid-DNA ist kein biologischer Gefahrenraum erforderlich, der normalerweise für den Umgang mit viralen Vektoren unerlässlich ist. Darüber hinaus ist einer der Vorteile der Elektroporationsmethode die Fähigkeit zur gleichzeitigen Expression mehrerer Genprodukte unter Verwendung eines einfachen Protokolls. Unsere neuartige Technik wird nützlich sein, um die Interaktion einer Vielzahl von Signalmolekülen zu analysieren, die an der Myelinisierung und Demyelinisierung beteiligt sind. Insbesondere durch die Kotransfektion einer Reihe verschiedener intrazellulärer Fluoreszenzsonden sollte unsere Methode ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der intrazellulären Signaldynamik in SCs mit Hilfe von Live-Imaging-Experimenten sein.

Die schnelle Übertragung von sensorischen und motorischen Informationen im peripheren Nervensystem wird durch die Myelinscheide ermöglicht, die von myelinisierenden Schwann-Zellen (SCs)1 gebildet wird. Die Isolierung der Axone durch die Myelinscheide ermöglicht die saltatorische Leitung, die die Geschwindigkeit der Nervenimpulse erhöht. Bei Erkrankungen, bei denen die Entwicklung oder der Erhalt der Myelinscheide beeinträchtigt ist, ist die Geschwindigkeit der Nervenleitung reduziert. Die Folge ist eine Neuropathie mit motorischer und sensorischer Dysfunktion. Obwohl es viele Studien zu den molekularen Mechanismen der Myelinisierung und Demyelinisierung im peripheren Nervensystem gibt, ist die Rolle der zahlreichen Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, unklar.
Um die molekularen Mechanismen der SC-Myelinisierung/Demyelinisierung in vivo zu untersuchen, wurden genetische Ansätze verwendet, um die Genexpression bei Tieren zu modifizieren. Ein wirksamer Ansatz ist die Verwendung von Knockout/Knockin oder transgenen Tieren. Die Zeugung dieser Tiere ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Für die SC-spezifische Genmanipulation sind die Kreuzung von floxierten Stämmen mit Cre-Mäusen oder andere bedingte Genexpressionsmethoden erforderlich. Das ist wiederum mühsam und zeitintensiv. In den letzten Jahren hat eine hochmoderne Gentechnologie, das CRISPR-Cas9-System, die Erzeugung genetisch veränderter Mäuse viel schneller gemacht (etwa 4 Wochen)2,3, aber diese Methode wird durch Einschränkungen der Zielsequenz behindert und leidet unter Off-Target-Effekten. Als alternative Methode ist der virale Vektor-vermittelte Gentransfer eine schnellere und einfachere Methode, um einen Gentransfer in SCs in vivo4-6 zu erreichen. In der Tat ist die Erzeugung viraler Vektoren kostengünstiger und dauert kürzer (innerhalb weniger Wochen), und die Genmanipulation von SCs kann einfach durch Injektion von manipulierten viralen Vektoren wie adenoviralen Vektoren, adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren und lentiviralen Vektoren in den Ischiasnerv erreicht werden. Da diese viralen Vektoren unterschiedliche Eigenschaften haben, müssen die Benutzer denjenigen auswählen, der für ihren Zweck am besten geeignet ist. Adenovirale Vektoren infizieren Axone und SCs sowohl in jungen als auch in reifen Ischiasnerven. Insbesondere weisen adenovirale Vektoren eine höhere selektive Empfindlichkeit für nicht-myelinisierende SCs auf als myelinisierende SCs. Adenoviren können Immunreaktionen hervorrufen, weshalb immundefiziente Stämme verwendet werdensollten 5. AAV-Vektoren sind derzeit die am weitesten verbreiteten viralen Vektoren und ermöglichen in vivo einen Gentransfer mit geringerer Toxizität7. AAV kann sowohl Axone als auch SCs durch direkte Injektion in die Nervenfasern transduzieren8,9. Die AAV-vermittelte Proteinexpression benötigt jedoch in der Regel 3 Wochen oder länger, um die Höchstwerte7,9 zu erreichen. Daher ist es schwierig, die Myelinisierung zu analysieren, die während der zweiwöchigen postnatalen Periode aktiv fortschreitet. Lentivirale Vektoren haben eine höhere selektive für myelinisierende SCs als nicht-myelinisierende SCs und haben keine toxischen Wirkungen auf Ischiasnerven. Lentivirale Vektoren infizieren jedoch keine SCs in reiferen Nerven5 und sind daher für die Analyse von Ereignissen wie dem Demyelinisierungsprozess ungeeignet.
Elektroporation ist ein weiterer schnellerer und einfacherer Ansatz, um einen in vivo Gentransfer zu erreichen. Es wurde berichtet, dass eine In-vivo-Transfektion von SCs erreicht werden kann, wenn Elektroporation auf durchtrennte Ischiasnerven der Ratte angewendet wird10. Da bei dieser Methode jedoch eine Nervendurchtrennung für den Gentransfer erforderlich ist, beschränkt sich die Anwendung auf die Analyse der geschädigten Nerven. In dieser Arbeit beschreiben wir eine alternative Methode, die es ermöglicht, Transgene in myelinisierende SCs in intakten Ischiasnerven der Ratte mittels Elektroporationeinzubringen 11. Diese Methode erfordert eine Plasmidkonstruktion, die in der Regel innerhalb einer Woche abgeschlossen werden kann. Durch einfaches Abgeben von elektrischen Impulsen an die Stelle am Ischiasnerv, an der die Plasmid-DNA injiziert wurde, kann eine hochselektive Transfektion von myelinisierenden SCs sowohl bei Neugeborenen als auch bei reiferen Tieren erreicht werden. Durch die Elektroporation mehrerer Plasmide kann die gleichzeitige Expression einer Vielzahl von Genen leicht erreicht werden. Die Fähigkeit, mehrere Moleküle gleichzeitig zu exprimieren, wie z. B. Signalproteine, Short-Hairpin-RNAs (shRNAs) und funktionelle Sonden, ist entscheidend für die Untersuchung komplexer Prozesse wie Myelinisierung und Demyelinisierung. Die neuartige In-vivo-Elektroporationsmethode, die in dieser Arbeit beschrieben wird, wird ein leistungsfähiges Werkzeug sein, das es Forschern ermöglicht, die Funktion einer Vielzahl von Molekülen und ihre Wechselwirkungen in myelinisierenden SCs zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td><td>Roche</td><td>03 143 422 001</td><td>Plasmid DNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>Fast Green CFC</td><td>WAKO</td><td>069-00032</td><td>Farbstoff für die DNA-Injektion</td></tr><tr><td>GC 150T-10</td><td>HARVARD APPARATUS</td><td>30-0062</td><td>Glaskapillar-Saugschlauch</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>05-2000-00</td><td>Saugschlauch für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>MODELL P-97</td><td>SUTTER INSTRUMENT Ko.</td><td>Mikropipettenabzieher</td><td></td></tr><tr><td>CUY21 Einzelzelle</td><td>BEX</td><td>Elektroporator CUY21 Einzelzelle</td><td>Impulsgenerator</td></tr><tr><td>Elektrischer Wärmer</td><td>KODEN</td><td>CAH-6A</td><td>Wärmer während der Operation</td></tr><tr><td>Isofluolan</td><td>Mylan</td><td>1119701G1076</td><td>Anästhetikum</td></tr></tbody></table>

in vivo - gentransfer auf schwann - zellen in der nagerischiasnerv durch elektroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Die Bildung der Myelinscheide durch Schwann-Zellen (SCs) ist essentiell für die schnelle Weiterleitung von Nervenimpulsen entlang der Axone im peripheren Nervensystem. Die SC-selektive genetische Manipulation bei lebenden Tieren ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen der SC-Myelinisierung und Demyelinisierung in vivo. Knockout/Knockin- und transgene Mäuse sind zwar leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der SC-Biologie, aber diese Methoden sind kostspielig und zeitaufwändig. Die virale Vektor-vermittelte Einführung des Transgens in den Ischiasnerv ist eine einfachere und weniger mühsame Methode. Virale Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. Toxizität, Einschränkungen der Transgengröße und Infektiosität, die auf bestimmte Entwicklungsstadien beschränkt sind. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die eine selektive Transfektion von myelinisierenden SCs im Ischiasnerv des Nagetiers mittels Elektroporation ermöglicht. Durch das Anlegen elektrischer Impulse an den Ischiasnerv an der Stelle der Plasmid-DNA-Injektion können interessante Gene in SCs sowohl bei Neugeborenen als auch bei reiferen Tieren leicht zum Schweigen gebracht oder überexprimiert werden. Darüber hinaus ermöglicht diese in vivo Elektroporationsmethode eine hocheffiziente gleichzeitige Expression mehrerer Transgene. Unsere neuartige Technik sollte es Forschern ermöglichen, die SC-Genexpression effizient zu manipulieren und Studien zur Entwicklung und Funktion von SC zu erleichtern.

Ein Beispiel eines Ischiasnervs mit rot fluoreszierendes Protein (RFP) transfiziert exprimierenden Plasmids ist in 2A gezeigt. Die Zellen bipolare Morphologie zeigt, ein Merkmal von SCs wurden spärlich mit RFP transfiziert. Keine RFP-Fluoreszenz wurde in Axonen nachgewiesen. Wir finden in der Regel ~ 100 transfiziert SCs in jedem Nerv. Diese Transfektionseffizienz scheint ähnlich zu der in vivo Wirksamkeit SC - Infektion unter Verwendung von lentiviralen Vektoren 4. Immunfärbungsexperimente zeigten , dass die meisten (~ 96%) RFP-positive Zellen bei P7 co-markiertem für S100, eine SC - Marker (Figur 2B), und 91% der RFP-positive Zellen bei P14 co-markiertem für MBP, einem myelinisierenden SC marker (2C), was darauf hindeutet , dass Gentransfer durch Elektroporation ist hochselektiv für myelinisierenden SCs. Einführung mehrerer Gene in SCs <em&gt; in vivo wird sehr nützlich sein für die Mechanismen der Myelinisierung / Demyelinisierung zu untersuchen. Ein wesentlicher Vorteil der in - vivo - Elektroporation hier beschriebenen Verfahrens ist die Fähigkeit , mehrere Gene , die mit einem einfachen Verfahren zu übertragen. Figur 2D zeigt ein repräsentatives Bild eines Ischiasnervs mit einer Mischung von GFP transfiziert und RFP-exprimierenden Plasmiden in vivo Elektroporation verwendet. Über 97% der SCs waren GFP und RFP doppelt positiv, was darauf hindeutet, dass hocheffiziente Lieferung mehrerer Gene können durch einfaches Elektroporation Mischungen aus mehreren Plasmiden erreicht werden. postnatal, und dann allmählich abnimmt Bei Nagetieren initiiert Myelinisierung rund um die Geburt, dramatisch während der ersten zwei Wochen zu erhöhen. Somit ist es durch genetisch SCs während dieser Entwicklungszeitfenster zu manipulieren, die Mechanismen, die diesen verschiedenen Stadien der Myelinisierung zugrunde liegen kann klären. Lentivirale Vektoren sind ein gutes Werkzeug für eineMyelinisierung nalyzing, vor allem , da sie eine minimale Toxizität, aber Lentiviren nur neonatalen 5,6 Ischiasnerven zu infizieren. Im Vergleich dazu arbeitet Elektroporation-vermittelte Gentransfer auch bei der Transfektion auf P3 (2E, oben) oder P14 (2E, unten) durchgeführt wird. Die Anwendungen des neuartigen In - vivo - Elektroporation Verfahren werden hier beschrieben. 3A zeigt lichtmikroskopische Bilder der GFP-exprimierenden myelinisierenden SCs in verschiedenen Entwicklungsstadien (P7, P14, P21 und P31). Durch lichtmikroskopische Analyse Änderungen in morphologischen Parameter, wie Länge und Durchmesser, kann beurteilt werden. Beachten Sie, dass diese Parameter ähnliche Werte im Vergleich zu intakten Ratte peripheren Nerven 15,16 haben, was darauf hindeutet , dass die elektroporierten Nerven entwickeln , ohne erhebliche schädliche Wirkungen. 3B zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme von LacZ-expressing myelinisierenden SCs. In diesem Fall wurde die LacZ als Expressionsmarker verwendet. β-Galactosidase - Färbung unter Verwendung bluO-gal, ein Ethanol-unlöslichen Substrat, ermöglicht die Analyse der Myelinstruktur transfizierter SCs durch Elektronenmikroskopie 11,17. In diesen Versuchen kann die Rolle der Signalmoleküle durch Silencing oder Erweiterung ihrer Expression untersucht werden, wodurch die Analyse der loss-of-function oder gain-of-function-Effekte. Zusätzlich zu der Analyse von fixierten Gewebes, in vivo Elektroporation-vermittelte Gentransfer kann auch auf Live - Imaging - Experimente angewendet werden. Beispielsweise zeigt 3C eine myelinisierenden SC Coexpression G-GECO1.1 18, ein grün fluoreszierendes cytosolischen Ca 2+ Indikator und R-GECO1mt 19 ein rot fluoreszierendes mitochondrialen Ca 2+ Indikator. Durch diese Indikatoren zum Ausdruck, identifizierten wir einen Signalweg, der 2+ Konzentrationen zytosolischen und mitochondrialen Ca steuert SCs in myelinisierende<html> . Somit kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine Vielzahl von Signalisierungsmechanismen zu untersuchen, insbesondere, wenn genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden verfügbar sind, die Signale von Interesse zu detektieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig1.jpg" /> Abb . 1: Schematische Darstellung des i n vivo Elektroporation Methode Zuerst den Ischiasnerv der narkotisierten Ratten ausgesetzt ist . Zweitens wird Plasmid-DNA in den Ischiasnerv injiziert. Dritte, elektrische Impulse werden an der Injektionsstelle durch die zangenförmige Elektrode geliefert. Schließlich wird die Wunde mit Klebstoff verschlossen. Dieses Verfahren kann auf der kontralateralen Nerv wiederholt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse auf Transfizierte Hüftnerven (A) Ein repräsentatives Bild eines transfizierten Ischiasnerv.. Der Nerv wurde mit RFP-exprimierenden Plasmid an P3 transfiziert und bei P7 fixiert. (B) Ein repräsentatives Bild eines RFP-transfizierten Zelle bei P7 zeigt Kolokalisation mit S100, einem SC - Marker. (C) Ein repräsentatives Bild eines RFP-transfizierten Ischiasnerv bei P14 Kolokalisation mit MBP zeigt eine myelinisierenden SC Marker. (D) Ein repräsentatives Bild eines Ischiasnervs cotransfiziert mit GFP und RFP-exprimierenden Plasmide. Transfizierte SCs ausgedrückt gleichzeitig GFP und RFP. (E) Ein Bild von SCs bei P31 transfiziert bei P3 myelinisierenden, wenn Myelinisierung beginnt (oben) und ein Bild von myelinisierenden SCs bei P31 auf P14 transfiziert, als die meisten großen Axone myelinated werden (unten), was darauf hindeutet , dass transfection von myelinisierenden SCs kann nicht nur in Neugeborenen-Nerven erreicht werden, sondern auch in den reiferen Nerven. Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m (A); 50 um (BE). Diese Zahl wurde von unserer früheren Veröffentlichung geändert 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Anwendung von in vivo Elektroporation (A) Eine lichtmikroskopische Analyse der Entwicklung von SCs myelinisierenden.. Ischiasnerven wurden mit GFP-exprimierenden Plasmid an P3 elektroporiert, und wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien (P7, P14, P21 und P31) festgelegt. Repräsentative Bilder von GFP-positiven SCs sind auf der linken Seite gezeigt. Die durchschnittliche Länge und Durchmesser sind als Mittelwert ± SEM zusammengefasst (n = 30-47 von 3 Nerven) auf der rechten Seite. Die Länge und der Durchmesser von myelinisierenden SCs zunimmt, wenn die Entwicklung fortschreitet. (B) Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Ischiasnerv mit einem Plasmid - Codierung LacZ transfiziert. Transfizierte SC (weiße Stern, links) wurde fein mit Ausscheidungen der β-Galactosidase Reaktionsprodukt bezeichnet. (C) Ein Bild von einem SC cotransfiziert mit G-GECO1.1, einem grün fluoreszierenden cytosolischen Ca 2+ Indikator, und R-GECO1mt, ein rot fluoreszierendes mitochondrialen Ca2 + Indikator. Die Regionen innerhalb der weißen gepunkteten Rechtecke sind in den Platten auf der rechten Seite vergrößert dargestellt. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m (A und C); 1 um (B). Diese Zahl wurde von unserer früheren Veröffentlichung geändert 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier präsentieren wir eine in vivo Technik für den Gentransfer zu Schwann-Zellen (SCs) im Ischiasnerv der Nagetiere. Diese einfache Technik ist nützlich, um Signalmechanismen zu untersuchen, die an der Entwicklung und Aufrechterhaltung myelinisierender SCs beteiligt sind.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Das übergeordnete Ziel dieses neuen experimentellen Protokolls besteht darin, mittels Elektroporation eine effiziente in-vivo-Genübertragung auf Schwann-Zellen in den Nervus-sciaticus von Nagetieren durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise die molekularen Mechanismen der Myelinisierung und der Demyelinisierung im peripheren Nervensystem. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass Chirurgen eine in-vivo-Transfektion von Schwann-Zellen mit einem einfachen Verfahren durchführen können.Um das Verfahren zu beginnen, autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und die 0,9-%-Natriumchloridlösung. Ziehen Sie anschließend einige Glaspipetten mit einem Pipettenzieher und schneiden Sie die Spitze jeder Pipette auf einen Durchmesser von 30 bis 50 Mikron zu. Nachdem ein Rattenjunges mit Isofluran in einer Induktionskammer anästhesiert wurde, platzieren Sie die Ratte unter einem Binokularmikroskop auf einer vorgewärmten elektrischen Heizplatte.Führen Sie eine Zehenquetschung durch, um die korrekte Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie dann einen Augensalbe auf beide Augen auf, um Austrocknung während der Operation zu verhindern. Halten Sie die Anästhesie aufrecht, indem Sie kontinuierlich Isofluran über eine Gesichtsmaske verabreichen.Fixieren Sie anschließend die Beine des Tieres mit chirurgischem Klebeband und reinigen Sie die Haut des hinteren Oberschenkels mit Povidon-Iod. Führen Sie einen Schnitt mit dem Skalpell durch. Legen Sie den Nervus ischiadicus frei, indem Sie mit zwei Nähnadeln eine Öffnung zwischen dem Musculus quadriceps femoris und dem Musculus biceps femoris schaffen.Danach eine 0,9 %ige Natriumchloridlösung auf den Nerv auftragen und überschüssige Feuchtigkeit mit fusselfreiem Papier abnehmen. Anschließend das Basisende einer Glas-Mikropipette in flexible Schläuche einführen. Die Mikropipette vorsichtig durch Aspiration mit einer ausreichenden Menge DNA-Lösung füllen.Ziehen Sie nun vorsichtig die distale Seite des Nervs mit einer Nadel nach oben, um den freigelegten Nerv anzuheben. Führen Sie die Glas-Mikropipette an der distalen Stelle des Nervs ein und injizieren Sie die DNA-Lösung, indem Sie leichten positiven Druck ausüben, bis der Nerv grün erscheint. Bringen Sie danach eine klemmenförmige Platinelektrode etwa ein bis zwei Millimeter vom Nerv entfernt an.Füllen Sie den Spalt zwischen der Elektrode und dem Nerv mit 0,9%iger Natriumchloridlösung. Applizieren Sie elektrische Impulse auf die Injektionsstelle mithilfe eines Elektroporators. Drehen Sie nach dem ersten Impulsset die Elektrode um und geben Sie ein weiteres Impulsset ab.Anschließend reinigen Sie die Elektroporationsstelle mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung und wiederholen Sie den Vorgang am kontralateralen Nervus ischiadicus. Nach der Elektroporation verschließen Sie den Schnitt mit Cyanoacrylatkleber. Danach reinigen Sie die Wunde mit Povidon-Iod. Entfernen Sie die Gesichtsmaske vom Tier und lassen Sie es mindestens eine Stunde lang auf der elektrischen Wärmeplatte, um eine vollständige Erholung von der Anästhesie zu ermöglichen. Anschließend kehren Sie das Jungtier zur Mutterratte zurück. Verabreichen Sie Carprofen, ein nicht-steroidales entzündungshemmendes Medikament, oder Buprenorphin, ein opioidisches Analgetikum, falls erforderlich.Hier ist ein repräsentatives Bild eines transfizierten Nervus ischiadicus zu sehen. Der Nerv wurde am P3 mit einem RFP-exprimierenden Plasmid transfiziert und am P7 fixiert. Dies ist ein repräsentatives Bild einer RFP-transfizierten Zelle am P7, das die Kolokalisation mit S100, einem Marker für Schwann-Zellen, zeigt. Und dies ist ein repräsentatives Bild eines RFP-transfizierten Nervus ischiadicus am P14, das die Kolokalisation mit MBP, einem Marker für myelinisierende Schwann-Zellen, zeigt.Ein repräsentatives Bild eines Ischiasnervs, der mit GFP- und RFP-exprimierenden Plasmiden kotransfiziert wurde, ist hier dargestellt. Die transfizierten Schwann-Zellen exprimierten gleichzeitig GFP und RFP. Diese Abbildung zeigt ein Bild myelinisierender Schwann-Zellen am P31, die am P3 transfiziert wurden, zu dem Zeitpunkt, zu dem die Myelinisierung beginnt, sowie ein Bild myelinisierender Schwann-Zellen am P31, die am P14 transfiziert wurden, zu dem Zeitpunkt, zu dem die meisten großen Axone myelinisiert werden.Diese Bilder legen nahe, dass die Transfektion myelinisierender Schwann-Zellen nicht nur in neonatalen, sondern auch in ausgereifteren Nerven erreicht werden kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine Elektroporation an den Ischiasnerven durchgeführt wird.

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