Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Das übergeordnete Ziel dieser Analyse ist es, die Phagosomen-Geschwindigkeit in HIV-1-infizierten Makrophagen mithilfe einer einfachen manuellen Verfolgungsmethode zu quantifizieren. Der Vorteil dieses Protokolls liegt darin, eine einfache Methode bereitzustellen, um die relativen Bewegungen von Objektgruppen innerhalb einer Zelle zu berechnen, die sich entweder bewegen oder verformen können. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Bewegung von Phagosomen in GFP-positiven infizierten Makrophagen, könnte jedoch auch für andere intrazelluläre Kompartimente in fluoreszenzmarkierten Zellen verwendet werden.

Nach der Infektion humaner, aus Monocyten abgeleiteter Makrophagen und der Opsonisierung von Schafsblutzellen gemäß dem Textprotokoll ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines konfokalen Abbildungssystems, wie beispielsweise eines Spinning-Disk-Mikroskops, das mit einer Heizkammer bei 37 Grad Celsius und Kohlendioxid ausgestattet ist, durchführen. Vor Beginn des Experiments die Heizkammer einschalten, um die Mikroskopierbühne auf 37 Grad Celsius aufzuheizen. Anschließend das Mikroskop und den Computer einschalten und die Bildgebungssoftware laden.

Optimieren Sie die Bildgebungsparameter, wie beispielsweise Scangeschwindigkeit, Vergrößerung, Auflösung usw., um mindestens eine Zelle pro Bildfeld zu erhalten und alle Minute ein Bild zwischen 60 und 120 Minuten aufzunehmen. Stellen Sie die Bildgebungsplatte auf den Mikroskopständer. Passen Sie den Fokus und die Position an, um genau eine vollständige, mit HIV-1 infizierte Makrophage im Bildfeld zu finden.

Verwenden Sie geeignete Anregungs- und Emissionswellenlängen, basierend auf dem verwendeten Abildungssystem und dem verwendeten Farbstoff. Schließen Sie einen Hellfeldkanal ein. Optimieren Sie die Darstellung, indem Sie die Belichtungszeit anpassen.

Entfernen Sie als Nächstes die Imaging-Schale und geben Sie ein Milliliter Suspension von auf Schafen gezüchteten Blutzellen, oder SRBC-Suspension, mit siebenmal zehntel der sechsten SRBCs pro Milliliter, in die Schale. Zentrifugieren Sie die Schale bei 500 × g für zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die Phagozytose zu synchronisieren, notieren Sie anschließend den Zeitpunkt am Ende der Zentrifugation und stellen Sie die Schale zurück auf den Objekttisch. Optimieren Sie den Fokus und legen Sie die obere und untere Grenze des Stapels mit einem Schrittabstand von 0,3 Mikrometern fest.

Beginnen Sie mit der Erfassung der Z-Stapel der GFP- und BF-Bilder durch die gesamte ZellDicke hindurch, und speichern Sie das Zeitraffervideo im nativen Dateiformat des Abbildungssystems. Um die Videobearbeitung durchzuführen, klicken Sie in der Videobearbeitungssoftware auf das Dropdown-Menü Apps und auf die Registerkarte Überprüfung mehrdimensionaler Daten. Um die Datei zu öffnen, klicken Sie auf Basisdatei auswählen und anschließend auf Verzeichnis auswählen.

Wählen Sie im Feld „Data Sets“ die zu analysierende Aufnahme aus und klicken Sie auf „View“. Um die Infektion in einer Z-Projektion darzustellen, wählen Sie im Feld „Wavelengths“ die Wellenlänge von 491 Nanometern aus und klicken Sie auf den Reiter „Z projection“ mit allen Ebenen. Um anschließend eine Zeitsequenz zu analysieren, wählen Sie im Feld „Wavelengths“ die BF-Wellenlänge aus und bestimmen Sie die optimale Ebene auf der Z-Achse, um äußere SRBCs, innere SRBCs und den Zellkern voneinander unterscheiden zu können.

Speichern Sie die Video-Montagen, indem Sie auf den Tab Auswahl Xs und anschließend auf Bilder laden klicken. Speichern Sie schließlich die geladenen Bilder im TIFF-Format. Nachdem Sie das manuelle Verfolgungs-Plugin für Image J heruntergeladen haben, öffnen Sie das Plugin in Image J und anschließend die zu analysierende Bildsequenz.

Geben Sie die Einstellungen ein, wie beispielsweise das Zeitintervall, das die Zeitspanne zwischen benachbarten Einzelbildern angibt, und die XY-Kalibrierung, die die Distanz pro Pixel darstellt. Um die Verfolgung zu starten, klicken Sie auf „Add Track“ und anschließend auf das Zentrum einer SRBC zum ersten Zeitpunkt, zu dem sie internalisiert wird. Das nächste Bild wird automatisch angezeigt.

Der Einfachheit halber können Sie während der Verfolgung das Helligkeits- und Kontrastfenster im Hellfeldkanal (BF) verwenden, um die SRBCs besser zu erkennen. Klicken Sie in allen Einzelbildern weiterhin auf das Zentrum der SRBCs, um deren unterschiedliche Positionen über die Zeit zu erfassen. Zwischen jeder SRBC-Verfolgung klicken Sie auf „End Track“ und anschließend auf „Add Track“, um eine neue Spur zu beginnen.

Die Verfolgungsnummer ändert sich in der zweiten Spalte der Ergebnistabelle. Beginnen Sie mit der Verfolgung des Zellkerns, um dessen Position in allen Einzelbildern zu erfassen, indem Sie wie zuvor auf dessen Zentrum klicken. Speichern Sie die Daten in einer Tabellenkalkulation, öffnen Sie diese anschließend in einer Tabellenkalkulationssoftware und erstellen Sie eine neue Datei für die Tabellenkalkulation.

Übertragen Sie in diese neue Datei die Zeit sowie die X- und Y-Koordinaten der SRBCs und des Zellkerns. Berechnen Sie abschließend mithilfe der Tabellenkalkulationssoftware die zurückgelegte Distanz der Phagosomen, die SRBCs enthalten, in Richtung des Zellkerns, sowie die Geschwindigkeit der Phagosomen während der ersten fünf Minuten nach der Internalisierung der SRBCs gemäß dem Textprotokoll. Die Analyse der Phagosomenbewegung in lebenden, mit HIV infizierten Makrophagen in Echtzeit unter Verwendung der Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie wird hier gezeigt.

Die Einstellungen für den Hellfeldkanal sind entscheidend, um den Zellkern zu erkennen und externe von internalisierten SRBCs zu unterscheiden. Dieses Diagramm zeigt die zurückgelegte Distanz eines Phagosoms in nicht infizierten HMDMs in den ersten fünf Minuten nach der Internalisierung eines SRBCs in Abhängigkeit von der Zeit. Die Geschwindigkeit des Phagosoms entspricht der Steigung der hier dargestellten linearen Regressionskurve.

Letztlich wurde in dieser Studie beobachtet, dass die Phagosomen-Geschwindigkeit während der ersten fünf Minuten nach der Internalisierung in HIV-infizierten HMDMs im Vergleich zu nicht infizierten HMDMs geringer ist. Diese Methoden zeigten, dass die Bewegung der Phagosomen in das Zellzentrum und damit die Reifung der Phagosomen zu Phagolysosomen in HIV-infizierten Makrophagen beeinträchtigt war. Nach dem Erwerb kann eine Zelle für die korrelative Elektronenmikroskopie weiterverarbeitet oder die gesamte Zellpopulation für die klassische Immunfluoreszenzmikroskopie und die statistische Analyse fixiert werden.

Die Phagozytose ist sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen. Daher sollte die Temperatur in der Heizkammer und im Kulturmedium der Kulturschale während des gesamten Verfahrens konstant bei 37 Grad Celsius gehalten werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern gefährlich sein kann, und ergreifen Sie entsprechende Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Biosicherheitslabor sowie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung, gemäß den örtlichen gesetzlichen Vorschriften.