Name: Herstellung von CD4 + T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie die Herstellung von CD4+ T-Zellen zur Analyse von GD3- und GD2-Gangliosid-Membranexpression durch Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kleiner Zellpopulationen für Leukämieforschung.

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Wir danken Dr. José Luis Daniotti für seine Kommentare. Wir danken Dr. J. Arturo Pimentel und dem Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM für die Unterstützung bei der Aufnahme der konfokalen Bilder. I.M.-D. und T.M.V.C. wurden durch Zuschüsse 157634 und 253596 des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), der Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. unterstützt. ist Stipendiat (245192) von CONACYT. Wir danken auch der Roten Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Periphere Blut von gesunden männlichen Spendern wurde mit Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung des Ausschusses für Bioethik des Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos erhalten. 1. Isolierung und Aktivierung von humanen naiven CD4 + T - Zellen <ol><li> Sammeln 2 ml peripherem Blut abgeleitet von gesunden menschlichen Spendern durch informierte Zustimmung und verdünnt mit 2 ml sterilem PBS-EDTA (1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Fügen Sie das verdünnte Blut langsam oben auf 3 ml Saccharose - Lösung mit 1,077 Dichte wie zuvor 8 beschrieben. Hinweis: differentielle Migration während der Zentrifugation durch Unterschiede in der Dichte verursacht wird Erythrozyten verursachen vollständig und eine Schicht aus weniger dichten mononukleären Zellen sedimentieren oberhalb bilden. 2 ml von peripherem Blut etwa 0,5 x 10 6 naive CD4 + T - Zellen nach der purificati rendernauf Schritte. </li><li> Zentrifuge 30 min bei 250 × g bei 21 ° C (Verwendung Rotor für Rundbodenröhrchen mit festen Winkel von 30 mm) ohne Unterbrechung des Gradienten von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Nach der Zentrifugation kann die PBMCs eindeutig als weißer Ring beobachtet werden. Sammeln Sie die PBMCs mit einer Pipette und Transfer zum sterilen Röhrchen zum Waschen. </li><li> Nach drei Waschungen mit PBS-EDTA - Lösung bei 250 × g für 10 min ablaufen zur Reinigung von naiven CD4 + T - Zellen. Sortierverfahren oder mehrere Arten von Reinigungs Kits sind für diesen Zweck zur Verfügung. Vorzugsweise verwenden&gt; 1 x 10 7 PBMCs zur Reinigung. <ol><li> Reinige naive CD4 + T - Zellen durch negative Selektion mit magnetischen Kügelchen. Führen negative Selektion mit anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR und CD235a (Glycophorin A) Antikörper. Beurteilen Sie den Prozentsatz der Reinheit durch die Bestimmung CD4 + CD45RA + Zellen durch fLow-Zytometrie. Hinweis: Optional, gehen über Nacht Inkubation von PBMCs bei 37 ° C und 5% CO 2 mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in 10 ml supplementiertem Medium monocyte Adhärenz zu fördern und weiterhin mit naiver CD4 + T - Zell - Reinigung. Die effiziente Gewinnung von naiven CD4 + T - Zellen aus peripherem Blut hängt weitgehend von dem Reinigungssystem. </li></ol></li><li> Vorbereitung 24-well-Zellkulturplatten durch Zugabe von 250 &amp; mgr; l pro Vertiefung von PBS mit 5 &amp; mgr; g / ml anti CD3 monoklonaler Antikörper und Inkubation bei 37 ° C mindestens 2 h für. Hinweis: Platten mit 96 Vertiefungen verwendet werden , wenn eine kleinere Anzahl von naiven CD4 + T - Zellen verwendet werden (zB 2 x10 4 -1 × 10 5). </li><li> Entfernen Sie die anti CD3-Antikörper Verdünnung aus dem 24-Loch-oder 96-Well-Platten und waschen Sie die Platten zweimal mit sterilen 1x PBS. </li><li> Verdünnen der naiven CD4 + T - Zellen mit&gt; 95% Reinheit (CD4 +CD45RA +) auf eine Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in advanced RPMI 1640 - Medium mit 3% fötalem Rinderserum (oder RPMI mit 10% Serum ergänzt), 2 mM Glutamin und Antibiotika (1 U / ml Penicillin, 1 &amp; mgr; g / ml Streptomycin). Hinweis: Wenn Gangliosid Lokalisierung in PBMCs erforderlich ist, folgen dem gleichen Protokoll zur Verdünnung und Stimulation wie unten beschrieben. </li><li> In 500 ul der Zellverdünnung zu anti CD3-beschichteten Vertiefungen und auf nicht-beschichteten Vertiefungen (Kontrollzellen) in der 24-Well-Platte. Alternativ dazu werden 100 ul der Zellverdünnung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Füllen Sie die Stimulationsbedingungen von naiven CD4 + T - Zellen in anti CD3 - beschichteten Vertiefungen durch Zugabe von 1 &amp; mgr; g / ml anti - CD28 - Antikörper. </li><li> Halten die ruhenden CD4 + T - Zellen als Kontrolle in den nicht-beschichteten Vertiefungen ohne Zusatz von anti CD28 Antikörper. Inkubieren Sie die ruhenden und aktivierten CD4 + T - Zellen für 0-72 h unter Standardbedingungen von 37 °C und 5% CO 2. </li><li> Um zu überprüfen , eine ausreichende Aktivierung zu bewerten durch Durchflusszytometrie der Expression des CD69 frühen Aktivierungsmarker (16 Stunden nach der Aktivierung) oder CD25 späten Aktivierungsmarkers (48 Stunden nach der Aktivierung) in ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T bei 37 ° C inkubierten Zellen und 5% CO 2 in Abwesenheit oder Anwesenheit von anti CD3 / CD28 - Antikörper 9,10. </li></ol> 2. Die Einhaltung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen <ol><li> Sterilisieren 12 mm runden Deckgläsern durch Autoklavierung und UV-Lichtexposition für mindestens 15 min. </li><li> Platz Deck in sterile 24-Well-Zellkulturplatten. Hinweis: Bei Kulturen , die mit weniger als 1 x 10 5 Zellen es bevorzugt ist , mit angepaßten kleinen Vertiefungen slide Kammern zu verwenden Dispersion von Zellen in dem Deckglas zu verhindern. </li><li> Coat Deckgläser (oder Gleitkammer) mit 200 &amp; mgr; l Poly-L-Lysin (MG 150-300 KDa) 0,1% (w / v) Lösung und Inkubation für 5 min bei room Temperatur (RT), zu entfernen und trocken für mindestens 1 Stunde bei RT. </li><li> Vorsichtig mischen und sammeln Sie die ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen aus den 24-Well - Platten. Zählen Sie die Zellen und bei Bedarf anpassen mit frischem ergänzten Medium zu übertragen , 1 x 10 5 Zellen auf die Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser. Inkubieren der Zellen für mindestens 6 Stunden bei 37 o C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Sammeln und Fixierung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen <ol><li> Das Medium von kultivierten ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen vorsichtig entfernen. </li><li> In 500 ul RT sterilem PBS langsam. Hinweis: vorsichtige Zugabe und Entnahme von Lösungen aus den Vertiefungen verhindert, dass die Ablösung von Zellen aus dem Deckglas. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie eine weitere 500 ul PBS gründlich Kulturmedien entfernen. </li><li> Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l filtrierte 4% Paraformaldehyd (filtRation entfernt Mikropartikel, die mit Mikroskopie-Analyse) und Inkubation für 30 min bei RT (bevorzugt) oder über Nacht bei 4 ° C stören können. Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige und flüchtige Verbindung. Es ist bekannt, ein menschliches Karzinogen zu sein. Verwenden Sie sorgfältig mit einem geeigneten Sicherheitsprotokoll. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen mindestens zweimal mit PBS bei RT. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder halten die Plattenvertiefungen mit 500 ul PBS bei 4 ° C für mehrere Tage, bis Färbung. Hinweis: Sterility während dieses Prozesses hilft das Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden. </li></ol> 4. Die Färbung, Montage und Visualisierung durch konfokale Mikroskopie <ol><li> Entfernen Sie die PBS aus den Vertiefungen. Hinzufügen 500 ul kaltem Blockierungspuffer (1x PBS, 0,5% Standardqualität Rinderserumalbumin, 1% fötalem Rinderserum, pH 7,4). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis. </li><li> Entfernen Sie den Blockierungspuffer sorgfältig und fügen Sie die primären Antikörper (anti Ganglioside GD3 Klon R24, GD2 Klon 14G2a),PE-konjugiertem anti CD25 und APC-konjugiertem anti-TCR und Isotypen in Blockierungspuffer auf 2,5 &amp; mgr; g / ml verdünnt Kontrollen. </li><li> Inkubiere 2 h auf Eis oder über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Langsam orbitale Bewegung bevorzugt. </li><li> Entfernen Sie den Antikörper vorsichtig und langsam mit 500 ul PBS. Zweimal wiederholen. </li><li> Fügen Sie die sekundären Antikörper (FITC konjugiertem anti IgG3 für R24 ​​anti GD3, Alexa Fluor 488 konjugiert oder Alexa Fluor 647-konjugiertem anti IgG2a für 14G2a anti GD2) verdünnt Puffer auf 0,1 &amp; mgr; g / ml in Blocking. </li><li> Inkubieren für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln ohne Schütteln. </li><li> Waschen dreimal in PBS wie in 4.4) beschrieben. Halten Sie die Vertiefungen mit PBS genug, die Entwässerung von Proben zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen Hoechst 333.258 stain verdünnt in PBS auf 0,1 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Inkubiere 15 min bei RT und zu entfernen. Waschen dreimal in PBS. </li><li> Legen Sie die Folien auf einem Papiertuch und fügen Sie 20 ul Befestigungslösung (50% Glycerin in PBS) oder kommerzielle Montagelösungs zu vermeiden, Fading und Abschrecken von Proben. </li><li> holen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer feinen Pinzette und legen Sie es auf die Montagelösung. Sicherzustellen, dass die Seite der Deck wo Zellen gebunden sind in Kontakt mit der Lösung ist. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack und analysieren Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. </li></ol> 5. Isolierung von RNA <ol><li> Bereiten anti CD3-Antikörper (5 ug / ml) beschichtete 96-Well-Platten. Inkubieren 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen / Vertiefung in 100 ul Kulturmedium , supplementiert mit anti CD28 - Antikörper (1 ug / ml) , um den Stimulus zu vervollständigen. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 0-72 Stunden. </li><li> Nach verschiedenen Post-Aktivierungszeiten setzen die Zellen in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Hinzufügen 500 ul PBS und Zentrifugation bei 250 xg für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 1ml Trizolreagenz. </li><li> Inkubieren für 5 min bei RT und halten Sie die Probe bei -8076; C für mindestens 24 Std. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wenn nötig. Hinweis: Verlassen der Probe bei -80 ° C für mindestens 24 Stunden verbessert RNA-Ausbeute. Verwendung von Handschuhen Auch ist wichtig, RNA-Abbau durch RNasen zu vermeiden. </li><li> Abzutauen die Probe durch Inkubation bei 37 ° C für 2 min in einem Wasserbad. </li><li> In 200 ul Chloroform und kräftig mit der Hand für 30 Sekunden (gegen aggressive Mischung von RNA vermeiden durch Vortexen). Inkubiere 5 min bei RT. </li><li> Zentrifuge 15 min bei 12000 × g bei 4 ° C. </li><li> Wiederherstellen der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 500 ul Isopropanol und wird das Röhrchen dreimal. </li><li> Inkubiere 10 min bei RT und zentrifugieren für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen durch Umdrehen. </li><li> 1 ml eiskaltem 75% Ethanol und Zentrifuge 10 min bei 12000 × g bei 4 ° C. </li><li> Vollständig den Überstand verwerfen und öffnen, indem man den Deckel des Rohres das RNA-Pellet trocknen. Nichte: An diesem Punkt ist das Pellet nicht deutlich sichtbar. Fahre dennoch fort. </li><li> Das Pellet in 20 ul UPW Wasser. Berechnen der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren durch Messen der 260 nm und 280 nm Extinktion unter Verwendung von Nanodrop. </li><li> Gehen Sie sorgfältig, um die Synthese von cDNA mit einer herkömmlichen Reverse-Transkriptase-Kit und nach dem Herstellerprotokoll. Anmerkung: Ungefähr 0,5-2 &amp; mgr; g RNA wird erhalten aus 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen. cDNA kann von 100 ng RNA verwendet, und in Echtzeit-PCR-Reaktionen, ohne die Notwendigkeit für niedrige Eingangs RNA Kits synthetisiert werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden , Ganglioside oder Proteine in Zellsuspensionen von CD4 + T - Zellen oder andere Immunzellen (zB PMBCs, 5) aus einer kleinen Anzahl von Zellen ausgehend zu lokalisieren. Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen und nicht-haftenden Eigenschaften, den Erwerb von fluoreszenzmikroskopische Bilder führt zu einer schlechten Informationen oder niedriger Qualität, wenn die Zellen nicht richtig eingehalten werden. D...

Die CD4 + T - Zellen dirigieren , die Immunantwort durch ihre Effektorfunktionen nach Aktivierung durch Antigen - präsentierende Zellen 1. Die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die während der Aktivierung moduliert werden können Einblick in eine grundlegende Prozess der Immunfunktion. Jedoch kann die Studie von naiven CD4 + T - Zellen kompliziert sein , weil sie eine sehr kleine Population von Zellen im Blut Peripherie 2 darstellen. Durch Fluoreszenzmikroskopie Mehrere Berichte haben die Lokalisierung verschiedener Moleküle beteiligt in CD4 + T - Zell - Aktivierung untersucht, vor allem Proteine an die Plasmamembran 3 verbunden. Die Ganglioside sind Sialinsäure Glycosphingolipide und obwohl sie in Nervenzellen intensiv untersucht worden , wo sie reichlich vorhanden, andere Zellen, wie Immunzellen sind auch ausdrücken Ganglioside mit biologisch relevanten Funktionen 4,5. Wir berichteten bereits that während der Aktivierung des menschlichen naiven CD4 + T - Zellen gibt es eine Aufregulation der α2,8 Sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 - Synthase) und die GM2 / GD2 - Synthase, dass die signifikante Oberflächen neoexpression von GD2 induzieren und die Hochregulation von GD3 Gangliosid 6. Weitere Studien von GD3, GD2 und andere Ganglioside in Immunzellen notwendig ist, ein Protein-basierte Teilansicht der Immunfunktion zu ergänzen. Üblicherweise wird die Untersuchung von Gangliosid - Expression auf Techniken wie Dünnschichtchromatographie (TLC) 7 basiert, aber diese Technik die räumliche Lokalisierung von Gangliosiden an der Plasmamembran oder in subzellulären Kompartimenten nicht erlaubt, biologische Analyse begrenzen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Antikörper-vermittelte Identifizierung und Lokalisierung von GD3 und GD2 - Ganglioside in der menschlichen naiven CD4 + T - Zellen und PBMCs nach anti-CD3 / anti-CD28 - Aktivierung. Mit diesem Protokoll es is auch möglich , das Gen und molekularen Expression von Gangliosiden in einer geringen Anzahl von Zellen in Suspension mit dem Erwerb von Bildern hoher Qualität 6, unter Berücksichtigung der geringen Größe von Lymphozyten (9 &amp; mgr; m) zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Erweiterter RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Ergänzt mit 3 % FBS-Maus-Anti-Human-CD3-Antikörper</td></tr><tr><td></td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3-Klonmaus</td></tr><tr><td>gegen Human-CD28-Antikörper</td><td>Ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6-Klon-Maus-Anti-Human-GD3</td></tr>&<tr><td>nbsp; Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24-Klon-Maus-Anti-Human-GD2-Antikörper</td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-53831</td><td>14G2a Klon</td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Anti-Maus-IgG3 -Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 konjugierter Antimaus</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 konjugiertes Antimaus</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T-Zell-Isolationskit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sortierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek Kammer-Objektträgersystem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Konfokales Lasermikroskop (Olympus)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI und IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Vorwärtssequenz Primer GD3 Synthase</td><td>5&akut;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse-Sequenz-Primer GD3-Synthase</td><td>5&akut;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Vorwärtssequenz-Primer GM2/GD2-Synthase</td><td>5&akut;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primer für Reverse-Sequenz GM2/GD2-Synthase</td><td>5&akut;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&akut;</td><td></td><td>Nr. 7</td></tr></tbody></table>

herstellung von cd4<sup&gt; +</sup&gt; t-zellen für die analyse von gd3 und gd2 gangliosid membran-expression durch mikroskopie

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Die hierin beschriebenen Verfahren zur Aktivierung von naiven CD4 + T - Zellen in Suspension und deren Einhaltung in Deck für die konfokale Mikroskopie Analyse ermöglichen die räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Gangliosiden in CD4 + T - Zellaktivierung beteiligt, dass Komplement expression profiling Experimente wie Durchflusszytometrie, Western Blotting oder real-time PCR. Die Quantifizierung von Gangliosid Expression durch Durchflusscytometrie und ihre zelluläre Lokalisation durch Mikroskopie kann durch die Verwendung von anti-Gangliosid-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität erhalten werden. Dennoch beinhaltet eine angemessene Handhabung von Zellen in Suspension die Behandlung von Kulturplatten die notwendige Haftung für Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Erwerb erforderlich zu fördern. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung GD3 und GD2 Gangliosidexpression und Kolokalisation mit dem TCR bei naiven CD4 + T - Zell - Aktivierung. Auch Real-time PCR Experimente &lt;40.000 Zellen verwendet werden für die Bestimmung des GD3 und GM2 / GD2-Synthase-Gene beschrieben, kann das Gen-Analyse-Experimente zeigen, mit einer geringen Anzahl von Zellen und ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen niedrigen Eingangs RNA Kits durchgeführt werden.

Das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben macht eine gute Qualität der gezüchteten und eingehalten ruhenden und aktivierten menschlichen naiven CD4 + T - Zellen (Abbildung 1). Die aktivierten CD4 + T - Zellen zeigen die charakteristischen proliferative Profil (1B) im Vergleich zu dem Ruhezustand (1A). Der CD25 späten Aktivierungsmarker ist nützlich , um die effiziente Aktivierung bei 72 h durch konfokale Mikros...

Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T - Zellen zu bestimmen. mit &lt;40.000 Zellen sind auch Echtzeit-PCR-Experimente beschrieben, die keine zusätzlichen Low-Input-RNA-Kits erfordern.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Herstellung einer CD4+T-Zellsuspension zur Färbung zum Visualisieren der Lokalisation von GD3- und GD2-Gangliosiden auf der Zelloberfläche unter Verwendung einer geringen Anzahl von Zellen zu demonstrieren. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Membranglykolipiden bei einer geringen Anzahl kleiner Suspensionzellen, wie sie bei mononukleären Zellen der Fall sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass man die Expression und Lokalisation von Gangliosiden in geringen Mengen von CD4+T-Zellen bewerten kann, indem man die Probennutzung optimiert.Die Auswirkungen dieser Technik könnten sich auf die Forschung und Diagnose einiger Arten von T-Zell-Leukämien auswirken. Wie wir festgestellt haben, erhöhen einige Leukämiezelllinien die Expression der Ganglioside GD3 und GD2. Geben Sie zunächst zwei Milliliter peripheres Blut von gesunden menschlichen Spendern mit zwei Millilitern steriler PBS-EDTA-Lösung an.Den verdünnten Blut langsam auf drei Milliliter einer Saccharoselösung mit einer Dichte von 1,077 geben. Anschließend 30 Minuten bei 250 ×g und 21 °C ohne Bremse zentrifugieren, um den Gradienten der peripheren mononukleären Blutzellen zu erzeugen. Nach der Zentrifugation sind die PBMCs deutlich als weißer Ring erkennbar.Sammeln Sie die PBMCs mit einer Pipette und überführen Sie sie in ein steriles Gefäß zur Wäsche. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS-EDTA, reinigen Sie naive CD4+T-Zellen durch negative Selektion mit magnetischen Mikrokügelchen unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits. Sobald eine Population mit einer Reinheit von über 95 % an CD4+T-Zellen erreicht wurde, bereiten Sie 24-Loch-Zellkulturschalen vor, indem Sie 250 Mikroliter einer Lösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter anti-CD3 monoklonalem Antikörper in PBS in jedes Loch geben.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation die Anti-CD3-Antikörperverdünnung von den Platten und waschen Sie diese zweimal mit steriler 1x PBS. Verdünnen Sie anschließend die naiven CD4+-T-Zellen mit supplementiertem Advanced RPMI 1640-Medium auf eine Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter verdünnte Zellen in die mit anti-CD3 beschichteten Vertiefungen der 24-Loch-Platte hinzu. Vervollständigen Sie dann die Stimulierung der naiven CD4+-T-Zellen in den mit anti-CD3 beschichteten Vertiefungen durch Zugabe von einem Mikrogramm pro Milliliter anti-CD28-Antikörper. Inkubieren Sie die ruhenden und aktivierten CD4+-T-Zellen für 0 bis 72 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit sammeln Sie die ruhenden und aktivierten naiven CD4+-T-Zellen aus den 24-Loch-Platten. Führen Sie eine Zellzählung durch und verdünnen Sie gegebenenfalls die Zellen mit frischem supplementiertem Medium auf eine Konzentration von einem mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter. Geben Sie 500 Mikroliter der verdünnten Zellen in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, die mit poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser oder eine Objektträgerkammer enthält, und inkubieren Sie mindestens sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Nach der Inkubation werden die CD4+T-Zellen auf den Deckgläsern haften. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie dann langsam 500 Mikroliter sterile PBS hinzu. Die Zugabe von PBS während der Wäsche sollte besonders sorgfältig erfolgen, insbesondere wenn Objektträgerkammern mit weniger als 50.000 Zellen pro Vertiefung vorbereitet werden.Entfernen Sie das PBS und geben Sie weitere 500&nbsp;Mikroliter PBS in die Vertiefungen, um das Kulturmedium vollständig zu entfernen. Nach dem vollständigen Entfernen des PBS geben Sie 500&nbsp;Mikroliter filtriertes 4&nbsp;%-Paraformaldehyd hinzu und inkubieren 30&nbsp;Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung entfernen Sie das Fixativ und waschen mindestens zweimal mit PBS.Falls gewünscht, kann die Platte mehrere Tage bei vier Grad Celsius mit 500 Mikroliter PBS pro Vertiefung aufbewahrt werden. Entfernen Sie zunächst das PBS von den fixierten Zellen und geben Sie 500 Mikroliter kaltes Blockierpuffer hinzu. Inkubieren Sie 20 Minuten auf Eis. Während der Inkubation ist es wichtig, die Platte nicht heftig zu schütteln, da durch Schütteln die Zellen abgelöst werden können. Den Blockpuffer vorsichtig abpipettieren und Blockpuffer zugeben, der 2,5 Mikrogramm pro Milliliter eines der primären Antikörper oder PE-konjugiertes Anti-CD25, APC-konjugiertes Anti-TCR oder eine Isotyp-Kontrolle enthält. Zwei Stunden auf Eis inkubieren und vor Licht schützen oder über Nacht bei vier Grad Celsius.Nach der Inkubation die Antikörperlösung vorsichtig entfernen und langsam 500 Mikroliter PBS hinzufügen. Anschließend die geeigneten sekundären Antikörper, die in Blockierpuffer auf 0,1 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurden, hinzugeben. Vor Licht schützen und eine Stunde lang auf Eis inkubieren, wobei darauf zu achten ist, ein Schütteln zu vermeiden.Nachdem die Objektträger wie zuvor dreimal in PBS gewaschen wurden, wird die Hoechst-Färbung in PBS auf 0,1 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt zugegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert. Anschließend werden die gewaschenen Objektträger auf ein Papiertuch gelegt und 20 Mikroliter Eindecklösung oder einer kommerziellen Eindecklösung zugegeben, um das Verblassen und die Löschung der Fluoreszenz zu verhindern. Zum Schluss wird ein Deckglas mit feinen Pinzetten aufgenommen, umgedreht und so auf die Eindecklösung aufgesetzt, dass die Seite des Deckglases, an der die Zellen haften, mit der Lösung in Kontakt kommt.Decken Sie die Deckgläser mit Nagellack ab und analysieren Sie sie mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie. Dieses Bild zeigt die Hellfeld-Darstellung von fixierten CD4+ T-Zellen 72 Stunden nach der Aktivierung. Die Überprüfung einer effizienten Aktivierung nach der Färbung erfolgt mittels Anti-CD25-Antikörper, dargestellt in Rot.Das GD3-Gangliosid ist intrazellulär und an der Zelloberfläche von aktivierten CD4+-T-Zellen lokalisiert, wie durch Färbung mit anti-GD3-Antikörper in grün dargestellt. GD3, erneut in grün dargestellt, lokalisiert sich nicht zusammen mit dem TCR, der erneut in rot dargestellt ist, wie durch Färbung mit anti-GD3- und anti-TCR-Antikörpern nachgewiesen wurde. Allerdings ko-lokalisiert das GD2-Gangliosid mit dem TCR und CD4+-T-Zellen, wie durch Färbung mit anti-GD2, in grün dargestellt, und anti-TCR-Antikörpern, in rot dargestellt, gezeigt wurde.Die GD3-Gangliosid-Färbung zeigt die intrazelluläre und Zelloberflächen-Lokalisation in einer Untermenge aktivierter PBMCs. Die GD2-Gangliosid-Färbung hingegen zeigt die intrazelluläre und Zelloberflächen-Lokalisation in allen aktivierten PBMCs. Nach diesem Verfahren der Adhärenz und Manipulation der CD4+ T-Zellen können weitere Methoden wie die Färbung von intrazellulären Kompartimenten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der spezifischen intrazellulären Lokalisation oder Verarbeitung von Gangliosiden zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine geringe Anzahl von CD4+T-Zellen handhabt und haften lässt, um hochwertige fluoreszenzmikroskopische Bilder zur Analyse der Gangliosidexpression zu erhalten.

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Dieses Video zeigt die in vitro Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen (THGM). Isolierte naive T-Zellen werden für die Differenzierung in THGM stimuliert, was durch den Nachweis einer hohen intrazellulären GM-CSF-Produktion und einer geringen Expression anderer T-Helferzell-spezifischer Zytokine bestätigt wird.

Eine in vitro Technik zur Unterscheidung von GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen von naiven T-Zellen

Dieses Video zeigt das Screening von immunmodulatorischen Verbindungen mittels fluoreszenzbasiertem Assay. Transgene T-Lymphozyten aus der Maus mit grün fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten werden mit diesen Verbindungen behandelt. Die verstärkten und reduzierten GFP-Signale ermöglichen die Identifizierung der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkungen der Verbindungen.

Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Analyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen in verschiedenen Zellzyklusstadien. Fluoreszenzmarkierte lebensfähige Zellen werden mittels Durchflusszytometrie selektiert, und die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusstadien werden anhand ihres DNA-Gehalts mit Antikörpern gegen zellproliferationsassoziiertes Kernprotein und einer Nukleinsäurefärbung identifiziert.

Ein Assay für die Zellzyklusanalyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen...

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Wir beschreiben hier eine Isolierungsmethode zur Gewinnung humaner endozervikaler intraepithelialer Lymphozyten für die Analyse von intraepithelialen gamma delta T-Zellen. Dieses Protokoll kann für die Aufreinigung von endozervikalen Gamma-Delta-T-Zellen durch magnetische Beads oder durch Zellsortierung erweitert werden.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.

Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Hier stellen wir das Protokoll für die schrittweise Rekonstitution synthetischer Antigen-präsentierender Zellen unter Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers und deren Verwendung zur Abfrage der synaptischen Ausgabe von aktivierten T-Zellen vor.

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Erfahren Sie die Herstellung von CD4+ T-Zellen zur Analyse von GD3- und GD2-Gangliosid-Membranexpression durch Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kleiner Zellpopulationen für Leukämieforschung.

Herstellung von CD4

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