Name: Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die In-vitro-Integrationsaktivität von HIV-1-Präintegrationskomplexen aus infizierten SupT1-Zellen messen. Diese Methode erfordert minimale PIC-Präparation und unterstützt die Entwicklung neuer antiretroviraler Therapien.

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Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse DA024558, DA30896, DA033892 und DA021471 von der NIDA / NIH auf CD unterstützt. Wir erkennen auch die RCMI Zuschuss G12MD007586, die Vanderbilt CTSA UL1RR024975 gewähren, die Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA Zuschuss U54 RR026140 vom NCRR / NIH, der U54 Zuschuss MD007593 vom NIMHD / NIH, und die Gewährung P30 AI110527 Tennessee CFAR.

1. Virus-Produktion HINWEIS: Um die hohe Titer von infektiösen HIV-1 erzeugen, transfizieren die menschliche embryonale Nieren (HEK) Zelllinie 293T mit einem infektiösen HIV-1 molekularen Klon ein aktiviertes Dendrimer-basierten Transfektionsreagenz verwenden. Es wurde beobachtet, dass das Calciumphosphat-Transfektionsverfahren vergleichbare Ergebnisse ergibt. <ol><li> In einer biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) lab, seed 3 x 10 6 293T - Zellen pro 10 cm - Schale in 8 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin und Streptomycin. Kultur die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N. </li><li> Am nächsten Tag für Zellen in jeder 10 cm - Schale Transfizieren verdünnen 8 ug pNL4-3 Plasmid DNA (Materials Tabelle) bis zu einem Endvolumen von 300 &amp; mgr; l DMEM fehlt Serum und Antibiotika. In 80 ul des Transfektionsreagenz, gut mischen durch Pipettieren, und Inkubation bei RTVon 5 bis 10 min für die Transfektion Komplexbildung. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den Schalen von Aspiration und 7 ml pro Schale mit frischem DMEM, das Serum und Antibiotika. </li><li> In 1 ml DMEM, das Serum und Antibiotika zur Transfektion komplex, mischen durch Pipettieren, und fügen Sie diese Mischung auf die Zellen. Vorsichtig schwenken die Schale gleichmäßige Verteilung der Transfektion Komplexe zu erleichtern. </li><li> Unmittelbar übertragen Sie die Zellen an die BSL3 - Labor, in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO 2, und die Kultur der Zellen für 48 h. </li><li> Sammeln Sie die virushaltige Gewebekulturüberstand mit einer Pipette und dann übertragen sie in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren und Schutt, und filtern dann den Überstand durch ein 0,45 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter. </li><li> Um jegliche Übertrags Plasmid-DNA in diesem zellfreien Viruspräparation zu beseitigen, Behandlung mit DNase 1 (20 ug / ml) bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Zur Quantifizierung derHIV-1 - Titer, verwenden Sie die p24-spezifische Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), da es eine schnelle und zugänglich Methode für den Routineeinsatz 22 ist. HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die p24-ELISA die physikalische Titer (Anzahl der Viruspartikel) misst. Alternativ liefert das Virus-assoziierten RT-Aktivität messen (exogenen RT-Assay) oder Virus-Infektiosität (TZM-bl Indikatorzellleitungsbasierte Infektiosität-Assays) exclusive Auslesung von infektiösen Viruspartikeln. </li></ol> 2. Virus-Infektion von Sup-T1-Zellen (BSL3 Lab) <ol><li> In einem BSL2 lab pflegen Sup-T1 - Zellen zwischen 1,0 x 10 6 und 2,0 x 10 6 Zellen / mL in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium , ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, Penicillin und Streptomycin (Aufteilungsverhältnis von 1 : 2 alle 2 - 3 d). Pool die Sup-T1-Zellen aus den Kulturflaschen, gut mischen durch Pipettieren und bestimmen die Lebendzellzahl durch eine Zählkammer und die Trypanblau staining Verfahren. <ol><li> Bereiten Sie die erforderliche Anzahl von Aliquoten von 80 x 10 6 Zellen (pro Virusinfektion) in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen in einem Schwenkbecherrotor bei 500 xg und 25 ° C für 5 min. Ohne das Zellkulturmedium entfernt wird, übertragen die Röhrchen pelletierten Zellen zur BSL3 lab für die weitere Verarbeitung enthält. aspirieren vorsichtig das Zellkulturmedium aus dem Rohr, ohne das Zellpellet zu stören. </li></ol></li><li> Fügen Sie eine angemessene Menge an DNase I behandelten Virusinokulum zu den Zellen in das Röhrchen und mischen Sie gut durch vorsichtiges Pipettieren. 80 x 10 6 Zellen, verwendet werden 30 ml DNase I-behandelte Virus (50 &amp; mgr; g p24-Äquivalent - Virus). HINWEIS: Isolation von funktionellen PICs erfordert die Zielzellen mit sehr hohen Multiplizitäten der Infektion zu infizieren (MOI). </li><li> Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig zwischen zwei 6-Well - Gewebekulturplatten (dh 12 x 2,5-ml - Anteile; verwenden 2 Platten pro InfektIon). </li><li> Für spinoculation, legen Sie die Kulturplatten in Plattenträger und Zentrifuge eine Schwingbecherrotor bei 480 × g und 25 ° C für 2 h verwendet wird. </li><li> Inkubieren der spinoculated Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 Stunden. </li></ol> 3. Ernte und Lyse von infizierten Zellen (BSL3-Labor) <ol><li> Pool der Zellen jeder Infektion entspricht, von den Kulturplatten in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (ca. 30 ml insgesamt). </li><li> Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg und 25 ° C für 10 min. Vorsichtig absaugen (verwenden Sie alternativ mit einer Pipette) den Überstand aus dem Rohr. </li><li> Um jegliche Restviruspartikel zu entfernen, Waschen jedes Zellpellet durch Zugabe von 2 ml Puffer K - / - (150 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM MgCl 2) und Zentrifugieren der Probe bei 300 xg und 25 ° C für 10 Minuten. Dann, ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen oder durch eine Pipette. </li><li> Repeat Schritt 3.3. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig restliche Puffer von einer Mikropipette. Resuspendieren jedes Zellpellet in 2 ml eiskaltem Lysepuffer K + / + (Puffer K - / - mit 0,025% Digitonin ergänzt, 1 mM DTT, 20 ug / ml Aprotinin), mischen Inhalt durch vorsichtiges Pipettieren, und in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 4. Herstellung von Cytoplasma-PICs (BSL3-Labor) <ol><li> Rock die Proben auf einem Rotationsschüttler bei RT für 10 min. </li><li> Zentrifugiere die Proben mit dem Rotor vorgekühlt auf 4 ° C, bei 1500 xg und 4 ° C für 4 min. </li><li> Ohne das Pellet zu stören, übertragen sorgfältig den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 16.000 xg und 4 ° C für 1 min. </li><li> übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen RNase A (20 mg / mL) auf eine Endkonzentration von 20 ug / ml (2 &amp; mgr; l für 2 ml PICs) und Inkubieren der Inhalt bei RT für 30 min (kein rocking). &lt;/ Li&gt; <li> Hinzufügen , Saccharose (60% w / v in Puffer K - / -) bis zu einer Endkonzentration von 7% und gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren. Bereiten Sie Aliquoten (zB 200 &amp; mgr; l) der PICs in Mikrozentrifugenröhrchen, flash-freeze in flüssigem Stickstoff, und in einem -80 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung. </li></ol> 5. In - vitro - Integration (IVI) Tests unter Verwendung von HIV-1 PICs <ol><li> Bereiten Sie die Ziel-DNA in der IVI-Assay verwendet, indem ein 2,0 kb-Region von der phiX174 Plasmid-DNA mit PCR Amplifikation unter Verwendung von maßgeschneiderten Primern, phiX174-F und phiX174-R. <ol><li> Bauen Sie die PCR - Gemisch , wie in Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler die thermischen Zyklusbedingungen unter Verwendung der in Tabelle 2 empfohlen. Gel-Reinigung des PCR-Produktes unter Verwendung eines Gel-Reinigungskits (nach vom Hersteller empfohlenen Protokoll), und speichern die gereinigten Ziel-DNA als Aliquots bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> In 600 ng der Ziel-DNA zu 200 - &amp; #181 L aliquote Menge von PICs, gut mischen und für 45 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Hinweis: IVI Reaktionen Ziel - DNA Weglassen oder einschließlich eines Integrase - Inhibitor (zB Raltegravir) sind Kontrollreaktionen empfohlen. </li><li> Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von IVI SDS, EDTA und Proteinase K bis zu Endkonzentrationen von 0,5%, 8 mM und 0,5 mg / ml. Mischen Sie die Reaktionsinhalt gründlich und Inkubation über Nacht bei 56 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, reinigen die Gesamt-DNA aus dem IVI Reaktion durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 16.000 xg und RT. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen an Phenol zur entproteinierte Probe, mischen kräftig durch Verwirbelung und Zentrifuge für 2 min. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase und übertragen sie in ein frisches Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 1: 1 Phenol: Chloroform-Mischung, mischen kräftig durch Verwirbelung und Zentrifuge for 2 min. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform, kräftig mit Verwirbelung und Zentrifuge für 2 min. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. </li><li> DNA auszufällen, fügen Glykogen auf eine Endkonzentration von 0,1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l, 3 M Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M und 2,5 Volumina 100% igem Ethanol (eiskaltem). Vortex mischen, Zentrifuge kurz den Inhalt zu sammeln, und legen Sie den Schlauch bei -80 ° CO / N. </li><li> Am nächsten Tag zentrifugieren der Probe für 30 min bei 16.000 xg und 4 ° C für 30 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Hinzufügen 500 &amp; mgr; l von 80% Ethanol (eiskaltem) zu dem Pellet und Zentrifuge bei 16.000 xg und 4 ° C für 10 min. Luft trocknen den DNA-Pellet bei RT und gründlich in 50 ul Nuklease-freies Wasser suspendieren. Speichern der DNA-Proben bei -20 ° C. </li></ol> 6. PCR Assays für die Quantifizierung von PIC Aktivität <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; HINWEIS: Die Kopienzahl von HIV-1-DNA der Ziel-DNA integriert in eine nested PCR Strategie quantifiziert wird, die zwei Sätze von Primern und 2 aufeinanderfolgende Runden der PCR verwendet. <ol><li> Führen der ersten Runde konventionellen PCR unter Verwendung von Primern, die das virale LTR und die phiX174 DNA (LTR und phiX174 Primern, jeweils) Targeting die Übergänge der integrierten HIV-1-DNA zu amplifizieren. <ol><li> Bauen Sie die Erstrunden-PCR - Gemisch , wie in Tabelle 3 beschrieben. Bauen Sie einen Master-Mix aller Komponenten der Matrizen-DNA auszuschließen, verzichten 45-ul-Aliquots in separate PCR-Röhrchen, und mit 5 &amp; mgr; l Template-DNA oder Nuklease-freies Wasser (Kontrolle). </li><li> Führen Sie die PCR in einem Thermocycler die thermischen Zyklusbedingungen unter Verwendung der in der Tabelle empfohlen 4. </li></ol></li><li> Führen der zweiten Runde qPCR unter Verwendung von Primern, die einen kurzen Bereich des viralen LTR (LTR-R und LTR-U-Primer) flankieren, um selektiv die integrierte vDNA Sequenzen aus dem ersten ro amplifizierenund PCR-Produkte. Um die integrierten vDNA Kopienzahlen bestimmen, um eine Standardkurve zu erzeugen um den Faktor 10 Reihenverdünnungen von bekannten Kopienzahlen (zB 10 0 - 10 8) des HIV-1 molekularen Klon. <ol><li> Montieren Sie die zweite Runde qPCR Mischung , wie in Tabelle 5 beschrieben. Bauen Sie einen Master-Mix aller Komponenten der Matrizen-DNA auszuschließen, sorgfältig verzichtet werden 25 &amp; mgr; l-Aliquots in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer 96-Well-PCR-Reaktionsplatte, und fügen Sie dann 5 ul der ungereinigtem ersten Runde PCR-Produkte oder Nuklease-freies Wasser (steuern). Führen Sie alle qPCR Reaktionen in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Laden Sie die PCR - Platte in die Echtzeit - PCR - Instrument und führen qPCR mit den Zyklusbedingungen empfohlen in Tabelle 6. </li><li> Analysieren Sie die Daten, die eine geeignete Software. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen und nicht-finanziellen Interessen.

Biochemische Analysen von retroviralen PICs haben kritische Einblicke in den Mechanismus der retroviralen DNA-Integration zur Verfügung gestellt. Die Messung der Integration Aktivität von retroviralen PICs kann durch die Bildung von Plaque-Assay, Southern-Blot-Analyse und verschachtelte qPCR erreicht werden. Die experimentelle Strategie der Plaque - Assay ist arbeitsaufwendig , und verwendet eine indirekte Methode 6 Integration zu messen, 7, <sup clas...

HIV-1-Replikation in der Zielzelle umfasst mehrere Schritte, im Großen und Ganzen gruppiert in zwei Phasen: frühe und späte Ereignisse. Die frühen Ereignisse beginnen , wenn HIV-1 sequentiell an den Oberflächenrezeptor Zielzelle bindet , CD4 und einem der beiden Co-Rezeptoren (CCR5 oder CXCR4) 1. Folglich wird die Virus-Zellmembranen verschmelzen, und das virale Capsid (CA) Kern in das Zytoplasma 2 freigegeben. Die CA Kern enthält die virale genomische einzelsträngige RNA (ssRNA) und mehrere Proteine, sowohl viralen und zellulären Ursprungs. Die CA-assoziierten viralen Proteine ​​umfassen Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN), zwei Enzyme, die während der frühen Ereignisse in der viralen Replikation kritischen Schritte vermitteln. Die RT und IN - Funktion in Zusammenhang mit Nucleoprotein - Komplexe, nämlich die reverse Transkription Complex (RTC) und das Präintegrationskomplexes (PIC), die jeweils 3, 4, 5 &lt;sup&gt;, 6. Die Enden des viralen Genoms ssRNA Hafen terminal repeat (R) Elemente benachbart zu der einzigartigen Sequenzen U5 (am 5&#39;-Ende) und U3 (am 3&#39;-Ende). Die RTC wandelt das virale ssRNA-Genom in eine doppelsträngige (ds) DNA-Kopie (vDNA). Diese umgekehrte Transkriptionsprozess resultiert auch in Duplizierung der U5 und U3 - Sequenzen, so lange terminale Wiederholungen (LTR) an beiden Enden der vDNA 7, 8 zu erzeugen. Anschließend katalysiert das PIC-assoziiertes in zwei aufeinanderfolgenden biochemischen Reaktionen, die die Integration der vDNA in das Wirtschromosom 9, 10, 11 ermöglichen. Zuerst wird im Zytoplasma, IN Multimere Eingriff beide LTRs 12 und ein Dinukleotid aus jeder der 3&#39;-terminalen Enden abzuspalten. Diese 3&#39;-End - Verarbeitung erzeugt an jedem 3&#39;-Ende (CA OH) der vDNA eine Hydroxylgruppe.Als nächstes Verkehre PIC an den Kern, wobei in der vDNA CA OH als Nucleophil verwendet beide Stränge der chromosomalen DNA in einer gestaffelten Art und Weise zu schneiden. Gleichzeitig Spleiße IN koordinativ an beiden Enden der vDNA der resultierenden Phosphodiesterbindungen auf gegenüberliegenden Stränge der chromosomalen DNA. Im Anschluss an diese Strangtransferschritt entfernt die Wirtszelle Maschinen die beiden ungepaarten Nukleotide am 5&#39;-Enden der vDNA und repariert die folgenden einsträngige Lücken an der Kreuzung von der Integrationsstelle. Die frühen Ereignisse also mit der Einrichtung eines integrierten DNA-Kopie (Provirus) des HIV-1-Genoms gipfeln. Das Provirus stellt eine geeignete Umgebung für die effiziente virale Genexpression, die einschließlich der Expression der Virus-kodierten Proteinen spätere Ereignisse initiiert; Montage des unreifen Virus; und Knospung, Release und Reifung in infektiöse Virionen 13. Gereinigte rekombinante retrovirale IN ist zuständigdurchzuführen, in vitro, beide 3&#39;-End - Verarbeitung und Strangtransferaktivitäten auf exogen zugeführt LTR artiges Substrat - DNA. Biochemische Untersuchungen so gereinigte rekombinante bei der Verwendung haben ergeben , kritische Aspekte der vDNA Integration 14, 15, 16, 17. Jedoch anders als in natürlichen Infektion, diese in vitro biochemische Reaktion unterstützt nicht abgestimmten Integration beider Enden der Substrat - DNA in das Ziel - DNA. Im Gegensatz dazu integrieren Retrovirus PICs isoliert aus akut infizierten Zellen concertedly beide Enden des endogenen vDNA in heterologe Ziel-DNA. Dies führte zu der weit verbreiteten Annahme und nachfolgende Verfeinerungen von I n - vitro - Integration (IVI) Assays isoliert nativen PICs mit. In der ersten berichteten retroviralen IVI-Assay, Zytoplasmaextrakte von Zellen mit einem rekombinanten Mäuse infiziertLeukemia Virus (MLV) , um das E. coli supF - Gen in seiner LTR beherberge diente als Quelle der IN - Aktivität und der DNA eines mutierten Lambda - Phagen - defekt in das lytische Wachstum wurde exogen als die Ziel - DNA zugeführt. Erfolgreiche Integration der rekombinanten DNA MLV Kopieren in die Phagen-DNA und die Expression supF anschließenden führte zur Wiederherstellung der Plaque-bildenden Fähigkeit der rekombinanten Phagen. Allerdings ist diese experimentellen Strategie ist mühsam und Maßnahmen Integration in indirekter Weise. Um solche Einschränkungen, ein Southern - Blot-basierte indirekte Endmarkierung Assay adressieren, die die PIC-assoziiertes IVI Aktivität als Maß für das endogene vDNA in exogene linearisierte Bakteriophage phiX174 - DNA integriert quantifiziert wurde 6 entwickelt, 7, 18. Obwohl dieses Verfahren ein direktes Maß der Integrationsereignisse liefert, relativ hohe Mengen an PIC Herstellung erforderlich sind, was eine technisch anspruchsvolle bleibtbemühen. Um dies zu umgehen, Nested-PCR - basierte Assays erfordern nur geringe Mengen an PICs wurden 4, 5 entwickelt, 19. In diesem Bericht beschreiben wir eine aktualisierte Version von einer verschachtelten PCR-basierten In - vitro - Methode entwickelt , um die HIV-1 - PIC-vermittelte Integration Aktivität zu rekapitulieren während einer natürlichen Infektion auftreten. Diese Methode verwendet die zytoplasmatischen Extrakten von HIV-1-infizierten Zielzellen als eine Quelle für endogene PIC-Aktivität, die mit einem quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen wird. Die Verfahren für die PICs zu isolieren und ihre Integrationsaktivitäten Messung angepasst sind, mit Modifikationen, von Protokollen , die vom Engelman Labor veröffentlicht 20. In diesem Verfahren wird die PIC-assoziiertes Integrations Aktivität initiiert durch eine exogene lineare Ziel - DNA 21 bietet, und die DNA - Produkte ausDiese Integrationsreaktion werden gereinigt und als Ausgangsmaterial für die nachfolgende PCR-basierte Quantifizierung verwendet. In der ersten Runde konventionellen PCR, die viral-Ziel-DNA-Übergänge unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert. In der zweiten Runde qPCR, LTR-spezifische Primer verwendet werden, um spezifisch die vDNA Bevölkerung aus der ersten Runde der PCR-Produkte bereichern. Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens. In - vitro - Studien mit retroviralen PICs haben zu erheblichen Fortschritten im Verständnis des Mechanismus der retroviralen DNA - Integration und in der Entwicklung von IN Inhibitoren geführt. Basierend auf der jüngsten verstärkten Fokus auf Mapping-HIV-1-Integrationsstellen, die Rolle von viralen und Wirtsfaktoren in HIV-1-Integration zu bestimmen und die Entwicklung neuer antivirale Medikamente gegen Arzneimittelresistenz Bekämpfung erwarten wir ein verstärktes Interesse an und weit verbreiteten Einsatz von IVI-Assays , wie die in diesem Bericht beschrieben ein. Dies wiederum, führt zuZukunft Verfeinerungen bei dem Verfahren Diversifizierung dadurch den Umfang seiner Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco" s modifizierter Eagle" s medium (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T Zellen (293T) </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 proviraler molekularer Klon pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Program </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect Transfektionsreagenz </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1-Zellen</td><td> American Type Culture Collection (ATCC)<td> > CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,2 - 7,5 (gebrauchsfertige Lösung)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid (KCl)-Lösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid (MgCl2) Lösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Sigma-Ald<rich /p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 Replikative Form 1 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F Grundierung: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R Grundierung: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen und/oder IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA Polymerase </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick Gel-Extraktionskit </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Reinstes destilliertes Wasser </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) Puffer (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA)-Lösung, 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (gebrauchsfertige Lösung 20 mg/ml)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Phenol (äquilibriert mit 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 und 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glykogen (5 mg/ml Lösung)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (3 M, pH 5,2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Erste Runde LTR-Grundierung: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Erste Runde phiX174 Primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen und/oder IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Zweite Runde LTR-R Primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Zweite Runde LTR-U Fibel: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Taqman-Sonde der zweiten Runde: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen und/oder IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

messung von in vitro integration aktivität von hiv-1 preintegration komplexe

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1-Hüllproteine ​​eingreifen verwandten Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche, die durch die Freisetzung des viralen Capsid (CA) Kern in das Cytoplasma, gefolgt viral-Zellmembranfusion führt. Anschließend bezeichnet der virale Reverse Transkriptase (RT), als Teil eines gleichnamigen Nukleoproteinkomplex der reversen Transkription Complex (RTC), wandelt den viralen einzelsträngige RNA-Genom in eine doppelsträngige DNA-Kopie (vDNA). Dies führt zur Biogenese von anderen Nukleoprotein-Komplex, bezeichnet als die Präintegrationskomplexes (PIC), der sich aus der vDNA und assoziierter Virus-Proteinen und Wirtsfaktoren. Der PIC-assoziierten viralen Integrase (IN) orchestriert die Integration der vDNA in die chromosomale Wirts-DNA in einer zeitlich und räumlich reguliert zweistufiger Prozess. Zunächst verarbeitet die in der 3&#39;-Enden des vDNA im Zytoplasma und zweitens, nachdem der PIC an den Kern Verkehre, sie vermittelt Integration der verarbeiteten vDNA in die chromosomale DNA. Die PICs isoliertvon Zielzellen sind akut mit HIV-1 infiziert in vitro funktionell, da sie kompetent sind den zugehörigen vDNA in eine exogen zugesetztem heterologe Ziel - DNA zu integrieren. Solche PIC-basierte in vitro Integrationstests haben die mechanistischen Details der retroviralen Integration abgrenzen und zu entdecken IN Inhibitoren beigetragen. In diesem Bericht erarbeiten wir auf einem aktualisierten HIV-1 PIC Test, der zur Messung der in vitro Integration Aktivität von isolierten nativen PICs eine verschachtelte quantitative Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion (qPCR) -basierte Strategie beschäftigt.

Isolierung von HIV-1 PICs Ein Schema des Protokolls für die Isolierung von HIV-1 PICs von akut infizierten Sup-T1 - Zellen verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll wird von den Methoden von Engelman et al beschrieben abgeleitet. 19, 20. HIV-1 PICs sind Nucleoprotein - Komplexe , die in infizierten Zellen zu...

Dieser Bericht beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) präintegrierten Komplex (PIC) assoziierten Integrationsaktivität in den zytoplasmatischen Extrakten akut infizierter Zellen. Die Integration von PIC-assoziierter HIV-1-DNA in heterologe Ziel-DNA wird mit Hilfe einer verschachtelten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsstrategie quantifiziert.

Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vitro Integrationsaktivität von Präintegrationskomplexen (PICs) zu messen, die aus HIV-1-infizierten SupT1-Zellen isoliert wurden. Diese Methode wird einige der Schlüsselfragen der HIV-Biologie beantworten, insbesondere die Frage, wie bestimmte Wirtsfaktoren und virale Faktoren, wie z. B. das virale Kapsid, eine Rolle bei der Integration der HIV-1-DNA spielt, und uns dabei helfen, neue Ziele für die antiretrovirale Therapie zu entwerfen oder zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass für die Messung der Integrationsaktivität in vitro eine relativ geringe Menge des Präintegrationskomplexes (PIC) benötigt wird.Die Auswirkungen dieser Technik können sich sowohl auf die Diagnose als auch auf die Therapie von HIV-1-AIDS erstrecken, und dies liegt daran, dass die früheren Versionen dieser Technik entscheidend für die Entdeckung von HIV-1-Integrase-Hemmern waren, die heute eines der wichtigsten Anti-HIV-Medikamente im klinischen Einsatz sind, so dass diese Methode nicht nur zum Verständnis der HIV-1-Integration verwendet werden kann. Es kann aber auch zur Untersuchung anderer Retroviren wie RSV und MLV angewendet werden. Dieses Protokoll wird von Dr. Muthukumar Balasubramaniam, einem Postdoktoranden im Labor, vorgeführt. Um SupT1 mit HIV-1 zu infizieren, halten Sie in einem BSL-2-Labor SupT1-Zellen zwischen einem und zwei mal 10 bis zum sechsten Zellen pro Milliliter in einem Medium des Roswell Park Memorial Institute oder RPMI, das mit 10 % FBS und Pen-Strep ergänzt wird.Nach der Erzeugung hoher Titer von infektiösem HIV-1 gemäß dem Textprotokoll werden die SupT1-Zellen aus den Kulturflaschen gepoolt, durch Pipettieren gut gemischt und die Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer verwendet, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Aliquotieren Sie acht mal 106 Zellen pro Virusinfektion in konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 mal g und 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie die Röhrchen mit den pelletierten Zellen zur weiteren Verarbeitung in das BSL-3-Labor, ohne das Zellkulturmedium zu entfernen, und saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus dem Röhrchen ab, ohne das Pellet zu stören.Geben Sie anschließend 30 Milliliter DNase I-behandeltes Virusinokulum zu den Zellen und mischen Sie es durch vorsichtiges Pipettieren, dann verteilen Sie die Mischung gleichmäßig auf zwei Sechs-Well-Gewebekulturplatten. Für die Spinokulation legen Sie die Kulturplatten in Plattenträger und zentrifugieren sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 480 mal g und 25 Grad Celsius für zwei Stunden, dann inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um die infizierten Zellen zu ernten und zu lysieren, werden die Zellen, die jeder Infektion entsprechen, in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gepoolt.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g und 25 Grad Celsius für 10 Minuten, dann aspirieren oder pipettieren Sie den Überstand vorsichtig. Um alle verbleibenden Viruspartikel zu entfernen, waschen Sie jedes Pellet durch Zugabe von zwei Millilitern Puffer K minus minus und schleudern Sie die Probe erneut. Entfernen Sie dann den Überstand vorsichtig durch Aspiration oder mit einer Pipette, ohne das Pellet zu stören, bevor Sie den Waschvorgang noch einmal wiederholen. Nachdem Sie alle Pufferreste vorsichtig mit einer Mikropipette entfernt haben, verwenden Sie den eiskalten Lysepuffer K plus plus, um jedes Pellet vorsichtig wieder zu suspendieren und in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.Um zytoplasmatische Präintegrationskomplexe (PICs) herzustellen, schütteln Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, legen Sie die Röhrchen dann in einen auf vier Grad Celsius vorgekühlten Rotor und zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang bei 1.500 g und vier Grad Celsius. Ohne das Pellet zu stören, den Überstand vorsichtig in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und eine Minute lang bei 16.000 g und vier Grad Celsius drehen. Den Überstand vorsichtig in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen, dann RNase A bis zu einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zugeben und den Inhalt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, ohne zu schaukeln.Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 7 % zugeben und durch vorsichtiges Pipettieren gut mischen, dann Aliquots der PICs in Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten. In flüssigem Stickstoff schockfrosten und zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius stellen. Um die Ziel-DNA vorzubereiten, die im In-vitro-Integrations- oder IVI-Assay verwendet wird, assemblieren Sie die PCR-Gemische, um eine 2,0-Kilobasen-Region aus der phiX174-Plasmid-DNA unter Verwendung der speziell angefertigten Primer phiX174-Forward und phiX174-Reverse zu amplifizieren, und führen Sie die PCR mit dem Programm gemäß dem Textprotokoll durch.Nach der Gelreinigung und Aliquotierung der Probe werden 600 Nanogramm Ziel-DNA zu 200 Mikrolitern PICs hinzugefügt. Gut mischen und bei 37 Grad Celsius 45 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die IVI-Reaktion durch Zugabe von SDS, EDTA und Proteinase K, mischen Sie dann den Reaktionsinhalt gründlich und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 56 Grad Celsius.Um die Gesamt-DNA aus der IVI-Reaktion zu reinigen, fügen Sie der deproteinisierten Probe am nächsten Tag ein gleiches Volumen Phenol hinzu. Kräftig mischen, indem Sie es vortexen und zwei Minuten lang zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase und überführen Sie sie in ein frisches Röhrchen, bevor Sie die Phenolextraktion wiederholen, und fügen Sie dann ein gleiches Volumen von einem zu eins Phenolchloroform hinzu.Mischen Sie die Probe durch Vortexen und zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang, dann überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Nach der Extraktion mit Chloroform gemäß dem Textprotokoll fällt die DNA aus der wässrigen Phase aus, indem Sie 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter Glykogen, 0,3 molare Natriumacetate und 2,5 Volumen eiskaltes 100%iges Ethanol hinzufügen. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius auf.Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 g und vier Grad Celsius für 30 Minuten und entfernen dann vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Um eine PCR zur Quantifizierung der PIC-Aktivität durchzuführen, beginnen Sie mit der ersten Runde der konventionellen PCR unter Verwendung von Primern, die auf die virale LTR und die phiX174-DNA abzielen, um die Verbindungen der integrierten HIV-1-DNA zu amplifizieren. Assemblieren Sie den Mastermix abzüglich der Matrizen-DNA, wie hier beschrieben, geben Sie dann 45 Mikroliter Aliquots in separate PCR-Röhrchen ab und fügen Sie fünf Mikroliter Matrizen-DNA oder nukleasefreies Wasser als Kontrolle hinzu.Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler mit dem im Textprotokoll beschriebenen Programm durch, führen Sie dann eine zweite Runde der quantitativen PCR durch und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. In diesem IVI-Assay wurden SupT1 mit DNAse I, behandeltem HIV-1 und dem Fehlen oder Vorhandensein des HIV-1-Integrase-Inhibitors Raltegravir spinokuliert. Nach der Inkubation wurden PICs isoliert und die gereinigte DNA auf die Integration der viralen DNA analysiert.Wie hier gezeigt, integrieren die HIV-1-PICs die assoziierte virale DNA robust in die Ziel-DNA und die IVI-Effizienz der PICs war in den mit Raltegravir ergänzten Reaktionen stark reduziert, was stark auf die in diesem Assay gemessene Integrationsaktivität in die HIV-1-Integrase hindeutet. Die Kontrollreaktionen zeigten keine Integrationsaktivität. Darüber hinaus amplifizierte die Kontrolle, die die Taq-Polymerase in der ersten PCR-Runde ausschloss, keine Integrationsprodukte.Bemerkenswert ist, dass die Daten der PICs-Kontrolle allein darauf hindeuteten, dass die verschachtelte qPCR-Strategie spezifisch die integrierte virale DNA maß, nicht aber die PIC-assoziierte virale DNA. Zusammengenommen zeigen diese Daten die PIC-assoziierte Integrationsaktivität. Nach der Beherrschung können die Viruspräparation und PCR-Assays zur Quantifizierung der PIC-Aktivität in einer Woche abgeschlossen werden.Die Infektion der SupT1-Zellen und die Isolierung der PICs aus den infizierten Zellen kann an einem Tag durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HIV-1-PICs isoliert und die In-vitro-Integrationsaktivität misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit hohen Titern von infektiösem HIV-1 äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, einschließlich Schutzkleidung wie Schürzen und Kittel, Doppelhandschuhe und Schutzbrillen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer...

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Dieses Video zeigt einen sekretierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Assay unter Verwendung von HEK-Blue Interferon-α/β-Reporterzellen zur Quantifizierung der Typ-I-Interferone (IFNs), die nach Stimulation plasmazytoider dendritischer Zellen durch HIV-1-infizierte CD4+ T-Zellen freigesetzt werden.

Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays

Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Erfahren Sie, wie Sie die In-vitro-Integrationsaktivität von HIV-1-Präintegrationskomplexen aus infizierten SupT1-Zellen messen. Diese Methode erfordert minimale PIC-Präparation und unterstützt die Entwicklung neuer antiretroviraler Therapien.

Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

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