Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vitro Integrationsaktivität von Präintegrationskomplexen (PICs) zu messen, die aus HIV-1-infizierten SupT1-Zellen isoliert wurden. Diese Methode wird einige der Schlüsselfragen der HIV-Biologie beantworten, insbesondere die Frage, wie bestimmte Wirtsfaktoren und virale Faktoren, wie z. B. das virale Kapsid, eine Rolle bei der Integration der HIV-1-DNA spielt, und uns dabei helfen, neue Ziele für die antiretrovirale Therapie zu entwerfen oder zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass für die Messung der Integrationsaktivität in vitro eine relativ geringe Menge des Präintegrationskomplexes (PIC) benötigt wird.

Die Auswirkungen dieser Technik können sich sowohl auf die Diagnose als auch auf die Therapie von HIV-1-AIDS erstrecken, und dies liegt daran, dass die früheren Versionen dieser Technik entscheidend für die Entdeckung von HIV-1-Integrase-Hemmern waren, die heute eines der wichtigsten Anti-HIV-Medikamente im klinischen Einsatz sind, so dass diese Methode nicht nur zum Verständnis der HIV-1-Integration verwendet werden kann. Es kann aber auch zur Untersuchung anderer Retroviren wie RSV und MLV angewendet werden. Dieses Protokoll wird von Dr. Muthukumar Balasubramaniam, einem Postdoktoranden im Labor, vorgeführt. Um SupT1 mit HIV-1 zu infizieren, halten Sie in einem BSL-2-Labor SupT1-Zellen zwischen einem und zwei mal 10 bis zum sechsten Zellen pro Milliliter in einem Medium des Roswell Park Memorial Institute oder RPMI, das mit 10 % FBS und Pen-Strep ergänzt wird.

Nach der Erzeugung hoher Titer von infektiösem HIV-1 gemäß dem Textprotokoll werden die SupT1-Zellen aus den Kulturflaschen gepoolt, durch Pipettieren gut gemischt und die Trypanblau-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer verwendet, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Aliquotieren Sie acht mal 106 Zellen pro Virusinfektion in konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 mal g und 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie die Röhrchen mit den pelletierten Zellen zur weiteren Verarbeitung in das BSL-3-Labor, ohne das Zellkulturmedium zu entfernen, und saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus dem Röhrchen ab, ohne das Pellet zu stören.

Geben Sie anschließend 30 Milliliter DNase I-behandeltes Virusinokulum zu den Zellen und mischen Sie es durch vorsichtiges Pipettieren, dann verteilen Sie die Mischung gleichmäßig auf zwei Sechs-Well-Gewebekulturplatten. Für die Spinokulation legen Sie die Kulturplatten in Plattenträger und zentrifugieren sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 480 mal g und 25 Grad Celsius für zwei Stunden, dann inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um die infizierten Zellen zu ernten und zu lysieren, werden die Zellen, die jeder Infektion entsprechen, in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gepoolt.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g und 25 Grad Celsius für 10 Minuten, dann aspirieren oder pipettieren Sie den Überstand vorsichtig. Um alle verbleibenden Viruspartikel zu entfernen, waschen Sie jedes Pellet durch Zugabe von zwei Millilitern Puffer K minus minus und schleudern Sie die Probe erneut. Entfernen Sie dann den Überstand vorsichtig durch Aspiration oder mit einer Pipette, ohne das Pellet zu stören, bevor Sie den Waschvorgang noch einmal wiederholen. Nachdem Sie alle Pufferreste vorsichtig mit einer Mikropipette entfernt haben, verwenden Sie den eiskalten Lysepuffer K plus plus, um jedes Pellet vorsichtig wieder zu suspendieren und in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.

Um zytoplasmatische Präintegrationskomplexe (PICs) herzustellen, schütteln Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, legen Sie die Röhrchen dann in einen auf vier Grad Celsius vorgekühlten Rotor und zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang bei 1.500 g und vier Grad Celsius. Ohne das Pellet zu stören, den Überstand vorsichtig in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und eine Minute lang bei 16.000 g und vier Grad Celsius drehen. Den Überstand vorsichtig in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen, dann RNase A bis zu einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zugeben und den Inhalt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, ohne zu schaukeln.

Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 7 % zugeben und durch vorsichtiges Pipettieren gut mischen, dann Aliquots der PICs in Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten. In flüssigem Stickstoff schockfrosten und zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius stellen. Um die Ziel-DNA vorzubereiten, die im In-vitro-Integrations- oder IVI-Assay verwendet wird, assemblieren Sie die PCR-Gemische, um eine 2,0-Kilobasen-Region aus der phiX174-Plasmid-DNA unter Verwendung der speziell angefertigten Primer phiX174-Forward und phiX174-Reverse zu amplifizieren, und führen Sie die PCR mit dem Programm gemäß dem Textprotokoll durch.

Nach der Gelreinigung und Aliquotierung der Probe werden 600 Nanogramm Ziel-DNA zu 200 Mikrolitern PICs hinzugefügt. Gut mischen und bei 37 Grad Celsius 45 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die IVI-Reaktion durch Zugabe von SDS, EDTA und Proteinase K, mischen Sie dann den Reaktionsinhalt gründlich und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 56 Grad Celsius.

Um die Gesamt-DNA aus der IVI-Reaktion zu reinigen, fügen Sie der deproteinisierten Probe am nächsten Tag ein gleiches Volumen Phenol hinzu. Kräftig mischen, indem Sie es vortexen und zwei Minuten lang zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase und überführen Sie sie in ein frisches Röhrchen, bevor Sie die Phenolextraktion wiederholen, und fügen Sie dann ein gleiches Volumen von einem zu eins Phenolchloroform hinzu.

Mischen Sie die Probe durch Vortexen und zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang, dann überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Nach der Extraktion mit Chloroform gemäß dem Textprotokoll fällt die DNA aus der wässrigen Phase aus, indem Sie 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter Glykogen, 0,3 molare Natriumacetate und 2,5 Volumen eiskaltes 100%iges Ethanol hinzufügen. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius auf.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 g und vier Grad Celsius für 30 Minuten und entfernen dann vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Um eine PCR zur Quantifizierung der PIC-Aktivität durchzuführen, beginnen Sie mit der ersten Runde der konventionellen PCR unter Verwendung von Primern, die auf die virale LTR und die phiX174-DNA abzielen, um die Verbindungen der integrierten HIV-1-DNA zu amplifizieren. Assemblieren Sie den Mastermix abzüglich der Matrizen-DNA, wie hier beschrieben, geben Sie dann 45 Mikroliter Aliquots in separate PCR-Röhrchen ab und fügen Sie fünf Mikroliter Matrizen-DNA oder nukleasefreies Wasser als Kontrolle hinzu.

Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler mit dem im Textprotokoll beschriebenen Programm durch, führen Sie dann eine zweite Runde der quantitativen PCR durch und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. In diesem IVI-Assay wurden SupT1 mit DNAse I, behandeltem HIV-1 und dem Fehlen oder Vorhandensein des HIV-1-Integrase-Inhibitors Raltegravir spinokuliert. Nach der Inkubation wurden PICs isoliert und die gereinigte DNA auf die Integration der viralen DNA analysiert.

Wie hier gezeigt, integrieren die HIV-1-PICs die assoziierte virale DNA robust in die Ziel-DNA und die IVI-Effizienz der PICs war in den mit Raltegravir ergänzten Reaktionen stark reduziert, was stark auf die in diesem Assay gemessene Integrationsaktivität in die HIV-1-Integrase hindeutet. Die Kontrollreaktionen zeigten keine Integrationsaktivität. Darüber hinaus amplifizierte die Kontrolle, die die Taq-Polymerase in der ersten PCR-Runde ausschloss, keine Integrationsprodukte.

Bemerkenswert ist, dass die Daten der PICs-Kontrolle allein darauf hindeuteten, dass die verschachtelte qPCR-Strategie spezifisch die integrierte virale DNA maß, nicht aber die PIC-assoziierte virale DNA. Zusammengenommen zeigen diese Daten die PIC-assoziierte Integrationsaktivität. Nach der Beherrschung können die Viruspräparation und PCR-Assays zur Quantifizierung der PIC-Aktivität in einer Woche abgeschlossen werden.

Die Infektion der SupT1-Zellen und die Isolierung der PICs aus den infizierten Zellen kann an einem Tag durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HIV-1-PICs isoliert und die In-vitro-Integrationsaktivität misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit hohen Titern von infektiösem HIV-1 äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, einschließlich Schutzkleidung wie Schürzen und Kittel, Doppelhandschuhe und Schutzbrillen.