Name: Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Erfahren Sie das Screening von Antikörperfragmenten für Bindung und Löslichkeit mittels bakterieller Inner-Membran-Display-Technik in Escherichia coli. Diese Methode nutzt den Twin-Arginin-Translokationsweg zur Qualitätskontrolle des Protein-Faltens.

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Wir danken Tomer Zohar für die Arbeit an scFv-Screening- und Charakterisierungsassays. Ein Teil dieser Arbeit wurde durch die Auszeichnung Nummer F32CA150622 des National Cancer Institute (an AJK) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder der National Institutes of Health wieder.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Antikörper für zytoplasmatische Aktivität ist eine schwierige Aufgabe aufgrund der reduzierenden Milieu des Cytoplasmas Technik, die die Bildung von Bindungen Stabilisierungs Disulfid 6,7 behindert. Dies bewirkt, dass die meisten Antikörper sein cytoplasmatisch inaktiv, wenn sie nicht für die Stabilität und Löslichkeit im Zytoplasma konstruiert sind, zusätzlich zu den für die Bindungsaffinität konstruiert werden. Die vorhandenen Methoden der Phagen - Display, Bakterien-Oberflächen - Display sowie Anzeigeverfahren Hefe Oberfläche verwenden alle die sekretorischen Weg 14-16 zur Darstellung von genetisch manipulierten Antikörper, aber diese Verfahren haben keine Mittel intrazellulär Faltung zu konstruieren. Antikörper entwickelt, mit Innenmembran-Display haben zytoplasmatische Stabilität verbessert und die Löslichkeit, da die Faltung Qualitätskontrolle des Tat-Weg Translokation von Antikörpern verhindert, die schlecht gefaltet und instabil im Zytoplasma. Dieses Verfahren vereinfacht den iterativen Prozess Engineering intrazellulären Antikörper für Affinität and Löslichkeit, da die beiden Eigenschaften in einem Schritt entwickelt werden. Obwohl dieses Verfahren für das Engineering Antikörper mit Löslichkeit in der reduzierenden intrazellulären Umgebung entworfen wurde, könnte sie auch auf Engineering Antikörper angewendet werden, in nicht-reduzierenden Bedingungen zu funktionieren, da die Proteine ​​dieses Verfahren beibehalten konstruiert unter Verwendung ihrer Faltung in der oxidierenden Umgebung des Periplasmas. Obwohl diese Technik den Prozess von Engineering-Antikörpern mit hoher Affinität und hoher Zytoplasma-Löslichkeit vereinfacht, mehrere Einschränkungen wichtig, zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll verwenden. Wenn die sekundären Bildschirm ELISA-Signale analysieren zu identifizieren viel versprechende scFv-Varianten ist die Schwelle für anspruchsvolle zwischen potenziell interessante Varianten und diejenigen, die nicht zeigen können ausreichende antigenbindende nicht wahrscheinlich, bis offensichtlich zu sein, nachdem mehrere Klone weiter charakterisiert. Es ist wichtig, für eine verbesserte Bindung über den Eltern-Antikörpers zu schauen; aber,eine ungewöhnlich hohe Signal 29 oder Aggregation - Effekte durch Avidität 30 sein könnte, eine Herausforderung , die nicht nur in der Innenmembran - Display - Screening - Ansatz ist. Eine wesentliche Einschränkung zu erinnern, wenn dieses Protokoll verwenden die Unfähigkeit ist Sphäroplasten nach Panning zu erholen, da sie nicht lebensfähig (nicht veröffentlichte Daten) sind. Dies erfordert die DNA-Amplifikation und Transformationsschritte, die Antikörper-kodierenden Plasmide zu erholen. Mehrere kritische Schritte des Protokolls ermöglichen die gleichzeitige Engineering von Falten und Binden von Antikörpern. Für das Screening erfolgreich zu sein, wobei das scFv-Bibliothek gescreent muss als Fusion mit dem ssTorA Signalpeptid exprimiert werden. Ohne diese Sequenz, Antikörper werden nicht an den Tat - Weg geleitet werden und somit nicht in das Periplasma transloziert 19 wird. Zusätzlich ist es zwingend notwendig, dass ein C-terminales Epitop-Markierung an die Antikörper fusioniert ist Nachweis der angezeigten Antikörper in dem Behälter zu ermöglichen,ding-Assays. Offensichtlich ist die E. coli - Stamm verwendet , um die scFvs auszudrücken muß auch die notwendige Tat - Weg Maschinen haben, aber dies gilt auch für die häufig verwendeten E. coli - Stämmen. Modifikationen an diesem Protokoll sind möglich sein Potenzial zur Verbesserung der Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften zu isolieren. Ein subtraktives Panning-Schritt kann vor dem Panning gegen das Zielantigen abgeschlossen werden, um die scFv Bibliothek von nicht erwünschten Bestandteile abzureichern. Die Bibliotheks Sphäroplasten können mit magnetischen Kügelchen mit BCCP allein oder beschichtet mit einer nicht-gewünschte Protein und die Sphäroplasten beschichtet inkubiert werden, die den Kügelchen binden können um die Bindung an das gewünschte Ziel vor Screenen der verbleibenden ungebundenen Sphäroplasten verworfen werden. Wie in den Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ein Verfahren ist die Affinität eines isolierten scFv zu verbessern, ist ein lösliches Konkurrent in der Panning Reaktion aufzunehmen mit den scFvs auf den Sphäroplasten angezeigt zu konkurrieren. Da der löslichen competitor ist ein gereinigtes Protein, keine DNA aus ihm amplifiziert, so dass nur Sequenzen der scFvs auf den Sphäroplasten angezeigt wird in der PCR-Reaktion gewonnen werden. Zusätzlich könnte diese Methode zur Entwicklung Andere Typen von Antikörpern oder nicht-Antikörper-bindende Proteine ​​ausgedehnt werden. E. coli Innenmembran - Display ist eine leistungsstarke Plattform für den Engineering - Antikörper mit hoher Affinität und ein hohes Maß an intrazellulären Löslichkeit. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für die effiziente Herstellung von Antikörpern in der intrazellulären Umgebung zu funktionieren gestaltet. Diese intrazellulären Antikörper werden bereits als potenzielle Therapeutika in einer Reihe von Bereichen untersucht, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen 31. Diese Technik wird mehr weit verbreiteten Einsatz von intrazellulären Antikörper als Werkzeuge für die Forschung und Medizin in diesen Bereichen und jedem anderen Bereich ermöglichen , wo ein Zielprotein in situ studying erwünscht ist .

Antikörper, die Falten und in der intrazellulären Umgebung funktionieren sind vielversprechend Werkzeuge für die Forschung und therapeutische Anwendungen. Sie haben die Fähigkeit , die Proteinaktivität zu modulieren , indem sie innerhalb der Zellen an ein Zielprotein bindende Protein-Protein - Wechselwirkungen zu verhindern, Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen stören, oder ein Substrat Zugang zu Enzyme 1-5 verhindern. Obwohl Antikörper für die intrazelluläre Anwendungen viel Potential haben, sie Engineering für die richtige Faltung und Löslichkeit in der intrazellulären Umgebung, während die Fähigkeit beibehalten an ein Zielantigen zu binden, ist eine Herausforderung. Das Reduktions zytoplasmatische Umgebung verhindert die Bildung der Disulfidbindungen normalerweise erforderlich für die stabile Faltung von Volllängen - Antikörpern und Antikörperfragmente, einschließlich Einzelketten - Variable - Fragment (scFv) -Antikörper 6,7. Eine Reihe der gerichteten Evolution Ansätze verwendet wurden Antikörper mit h Ingenieurigh Affinitäten für Target - Antigene 8-10. Diese Ansätze häufig Phagen - Display, Hefe Oberfläche Anzeige oder Bakterienoberfläche Anzeige zu screenen große Bibliotheken von Antikörpern 11-13 verwenden. Diese Methoden sind leistungsfähig und wirksam für Antikörper zu identifizieren , die an Ziele binden, aber sie hängen von den sekretorischen Weg Proteine zu transportieren , die 14 bis 16 angezeigt. Der Sekretionsweg transloziert ungefaltete Proteine ​​aus dem Reduktions Cytoplasma in das endoplasmatische Retikulum Lumen in Hefe oder in das Periplasma in Bakterien. Die Proteine falten dann unter oxidierenden Bedingungen und werden auf der Zelloberfläche oder in Phagenpartikel verpackt für die Bindungsaffinität 17,18 auf dem Bildschirm angezeigt. Als Ergebnis isolierten Antikörper mit diesen Techniken wird im Zytoplasma nicht notwendigerweise gut falten und intrazelluläre Löslichkeit oft müssen separat konstruiert werden, wenn die Antikörper in intrazellulären Anwendungen verwendet werden. Verbesserndie Effizienz der Engineering - Antikörper , die in das Zytoplasma und gefaltet werden, wir zuvor berichtet , den Erfolg von MAD-TRAP (membranverankerten Anzeige für Tat-basierte Erkennung Assoziieren Proteine), ein Verfahren zum Screenen eines scFv - Antikörperbibliothek unter Verwendung von Escherichia coli inner- Membran - Display 19. Bakterielle Innenmembran Anzeige beruht auf der twin-arginine-Translokation (Tat) -Weg für den angezeigten Antikörpern Transport im Gegensatz zu anderen üblichen Anzeigemethoden, die den sekretorischen Weg verwenden. Der Tat - Weg enthält einen Mechanismus zur Qualitätssicherung , die erlaubt nur lösliche, korrekt gefaltete Proteine aus dem E. transportiert werden coli Zytoplasma über die innere Membran und in das Periplasma 20,21. Überexprimierten Tat Substrate (dh., Zielproteine an den Tat - Weg mit einer N-terminalen Fusion mit dem Tat - Signalpeptid ssTorA) , die in dem Zytoplasma und gefaltet sind eine langlebige Translokation bilden Zwischen mit dem N-Terminus in das Zytoplasma und der C-Terminus in das Periplasma 19. Dies ermöglicht die Anzeige von korrekt gefalteten Tat Substraten, einschließlich Antikörperfragmente auf der periplasmatischen Seite des E. coli innere Membran. Nachdem die äußere Membran durch enzymatischen Verdau entfernt Sphäroplasten zu erzeugen, werden Antikörper zu den extrazellulären Raum (Figur 1) ausgesetzt wird . Dies ermöglicht Tat Substrate auf der inneren Membran angezeigt für die Bindung an ein spezifisches Ziel gescreent werden. Wichtig ist, sorgt für die Tat-Weg nutzbar zu machen für Zelloberflächen-Display, dass nur die Antikörper in der Bibliothek, die im Zytoplasma gut gefaltet werden, werden für die Bindung abgefragt werden, so dass Simultaneous Engineering Affinität und intrazelluläre Faltung von Bindung. In diesem Protokoll beschreiben wir , wie auf der E. eine scFv - Bibliothek anzuzeigen coli innere Membran, die Bibliothek gegen ein Zielantigen schwenken, und führen Sie einen sekundären Bildschirm , um die vielversprechendsten Bestandteile der Bibliothek zu identifizieren. Während wir uns konzentrieren<html> das Protokoll über scFvs könnte das Verfahren zum Engineering jedes Protein, deren Anwendung verbindlich und intrazelluläre Faltung erfordert angewendet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Abbildung 1. Tat Innenmembran - Display. In E. coli, scFv - Antikörper , die als Fusion mit dem ssTorA Signalsequenz und korrekt gefalteten im Cytoplasma exprimiert werden , werden über die innere Membran transportiert. Eine Translokation Zwischenformen, wobei die scFvs in der inneren Membran mit dem N-Terminus in dem Zytoplasma und dem C-Terminus in das Periplasma verankert sind. Die E. coli äußeren Membran enzymatisch verdaute Sphäroplasten zu bilden, wodurch die verankerten Antikörper gegen den extrazellulären Raum freigelegt und zur Verfügung zum Nachweis Herstellung durch Verwendung eines Antikörpers, der auf dem angezeigten Antikörper an das C-terminal verschmolzenen Epitop - Tag bindet.Last / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<table><tbody><tr><td>scFv-Bibliothek</td><td>Variiert</td><td></td><td>Eine geeignete scFv-Bibliothek sollte aus einer kommerziellen oder akademischen Quelle bezogen werden.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli Zellen</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>Zellen müssen chemisch oder elektrokompetent sein, abhängig von der gewählten Transformationsmethode.</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco dehydrierte Nährmedien LB Brühe, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (Zelllyse-Waschmittel)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3.000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Zielantigen</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td>Aufgereinigtes Zielantigen kann gekauft oder hergestellt/gereinigt werden.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primer</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Die Primersequenzen sind wie im Protokoll beschrieben.</td></tr><tr><td>10x T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucelotidkinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Stellen Sie sicher, dass der T4-Ligase-Puffer, der in der Primer-Phosphorylierungsreaktion verwendet wird, 1 mM ATP enthält.</td></tr><tr><td>5x Phusion HF Pufferpackung</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td> Desoxynukleotid <td></td></tr><tr><td>(dNTP) Lösungsmix, je 10 mM dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>Alternativ können auch andere High-Fidelity-Polymerasen verwendet werden, aber die Annealing-Temperatur in Tabelle 3 muss angepasst werden.</td></tr><tr><td>C1000 Touch-Thermocycler mit dualem 48/48-Schnellreaktionsmodul</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA-Gel-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel- und PCR-Reinigungssystem</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse Membranfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar allgemeine Polystyrol-Assay-Plattendeckel</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiter-Plattenschüttler</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Well EIA/RIA Easy Wash klare Mikroplatte aus Polystyrol mit flachem Boden und hoher Bindung</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Blotter Polycarbonat 96-Well-Replikationswerkzeug</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Instant fettfreie Trockenmilch</td><td>Qualität Biologisch</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (Polysorbat 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture-Reagenz (konzentriertes Zelllyse-Detergens)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler ANTI-FLAG M2-Peroxidase (HRP)-Antikörper, hergestellt in der Maus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4), 10&nbsp; N-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap Aluminiumfolie</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterielle inner-membran-display für das screening einer bibliothek von antikörperfragmenten

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antikörper, die für die intrazelluläre Funktion entwickelt wurden, müssen nicht nur eine Affinität zu ihrem Zielantigen haben, sondern auch löslich und korrekt gefaltet im Zytoplasma sein. Häufig verwendete Methoden für die Darstellung und das Screening rekombinanter Antikörperbibliotheken beinhalten keine Qualitätskontrolle der intrazellulären Proteinfaltung, und daher müssen die Antigenbindungsfähigkeit und die zytoplasmatische Faltung und Löslichkeit von Antikörpern, die mit diesen Methoden hergestellt werden, oft separat entwickelt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Screening einer rekombinanten Bibliothek von Antikörpern mit einkettigen variablen Fragmenten (scFv) auf Antigenbindung und korrekte zytoplasmatische Faltung. Die Methode nutzt den intrinsischen intrazellulären Faltungsqualitätskontrollmechanismus des Escherichia coli Twin-Arginin-Translokationswegs (Tat), um eine scFv-Bibliothek auf der inneren Membran von E. coli anzuzeigen. Der Tat-Signalweg stellt sicher, dass nur lösliche, gut gefaltete Proteine aus dem Zytoplasma transportiert und auf der inneren Membran angezeigt werden, wodurch schlecht gefaltete scFvs vor der Abfrage auf Antigenbindung eliminiert werden. Nach dem Entfernen der äußeren Membran werden die auf der inneren Membran angezeigten scFvs gegen ein Zielantigen geschwenkt, das auf magnetischen Kügelchen immobilisiert ist, um scFvs zu isolieren, die an das Zielantigen binden. Ein auf einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) basierendes Sekundärscreening wird verwendet, um die vielversprechendsten scFvs für eine weitere Charakterisierung zu identifizieren. Die Antigenbindung und die zytoplasmatische Löslichkeit können durch nachfolgende Mutagenese- und Screening-Runden verbessert werden, um Antikörper mit hoher Affinität und hoher zytoplasmatischer Löslichkeit für intrazelluläre Anwendungen zu entwickeln.

Die intrazelluläre Proteinfaltung Qualitätskontrollmechanismus des Tat - Weg in E. coli begrenzt Transport über die innere Zellmembran zu Proteinen , die in der reduzierenden zytoplasmatische Umgebung gut gefaltet werden. Durch Überexpression eines Fusions eines scFv mit dem ssTorA Signalsequenz (die Signalsequenz aus dem TorA - Protein, das natürlicherweise durch den Tat - Weg 20 transportiert wird), wird die Translokation ins Stocken geraten, was zu einer Anzeige von scFvs an der inneren Membran 19. Nach enzymatischer Zerstörung der äußeren Membran, werden die angezeigten Antikörper zum Screenen für Antigen-Bindungsaktivität zur Verfügung gestellt. Die Möglichkeit , die Vorteile des Tat - Weg für scFv - Anzeige aufzunehmen wurde von Karlsson et al. 19 gezeigt ist (Abbildung 6). Die scFv-Antikörper scFv13 und scFv13.R4 wurden entweder die native ssTorA Sequenz oder eine modifizierte ssTorA fusioniert, die das Arginin-Argininrest Paar erkannt fehlt durchdie Tat-Weg. scFv13.R4 wurde von Martineau et al entwickelt. von scFv13 durch vier Runden der gerichteten Evolution und bekannt ist gut 9 in das Zytoplasma zu falten. Dieser scFv wurde auf der inneren Membran angezeigt, aber nur , wenn sie als Fusion mit dem nativen ssTorA Signalsequenz (Abbildung 6) ausgedrückt. Konträr ist scFv13 nicht gut gefaltet cytoplasmatisch 9, so ist es nicht gut an der inneren Membran angezeigt, unabhängig von der Signalsequenz , an die es fusioniert ist. Außerdem, wenn die scFvs wurden in Zellen exprimiert, die das TatC Protein fehlte, eine wichtige Komponente der Tat Maschinen 20,28, Anzeige nicht beobachtet wurde, die wichtige Verbindung zwischen Innenmembran - Display und die Tat - Weg zeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur Proteine, die die Tat-Signalpeptid enthalten und dass die richtigen Einstellungen im Zytoplasma gefaltet sind an der inneren Membran angezeigt, in dem Transport durch den Tat-Weg als Bildschirm zu funktionieren für die intrazelluläre folding. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Abbildung 6. Der Nachweis der angezeigten scFvs auf der inneren Membran. Zytometrie Analyse Fluss wurde durchgeführt , um die Anzeige von schlecht gefalteten scFv13 und gut gefaltet scFv13.R4 auf der inneren Membran zu erkennen. scFvs wurden mit nativem ssTorA oder ssTorA (KK) fusioniert, wobei das Arg-Arg-Paar in der ssTorA Sequenz Lys-Lys modifiziert wurde. Die C-terminale FLAG-Epitop-Tags auf den scFvs wurden mit einem Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) detektiert -konjugiertem anti-FLAG-Antikörper. Zellen ohne TatC Protein (ΔtatC) und ssTorA-scFv13 ohne das FLAG - Tag wurden als Kontrollen getestet. M zeigt die mittlere Fluoreszenzwert. Wiedergabe aus Lit. 19 mit Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Inner-Membran-Display kann erfolgreich scFv-Antikörper mit hoher Affinität für ein Zielprotein und ein hohes Maß an Cytoplasma-Löslichkeit zu isolieren. Zusätzlich Anzeige nachfolgenden Runden der gerichteten Evolution unter Verwendung von inneren Membran Antikörper Merkmale 19 zu verbessern. Um dies zu demonstrieren, eine fehleranfällige Bibliothek PCR auf Basis von scFv13, die von Bindungsaffinität für β-Galactosidase ein niedriges Niveau hat, wurde gegen die β-Galactosidase Zielantigen verrissen über das Display und Panning-Methode in dem Protokoll beschrieben. scFv 1-4 wurde nach einer Runde der Mutagenese und Panning isoliert und zeigten höhere Bindungsaffinität zu &amp; beta; -Galactosidase als scFv13 (7A) und ein höheres Niveau der zytoplasmatischen Löslichkeit (7B). Eine neue Bibliothek, basierend auf scFv 1-4, wurde unter Verwendung von fehleranfälligen PCR gemacht, und Schwenken dieser zweiten Generation Bibliothek gegenβ-Galactosidase wurde durchgeführt, das eine Modifikation des beschriebenen Protokolls. Das Panning gegen β-Galaktosidase für die zweite Runde der Evolution wurde in Gegenwart von gereinigtem, löslichem scFv 14 als Konkurrent getan, um die Wahrscheinlichkeit zu verbessern, von Klonen mit höherer Affinität als scFv 1-4 isolieren. Nach dieser zweiten Runde der Mutagenese und Panning, scFv 2-1 und 2-3 scFv wurden isoliert, um die ELISA-basierten sekundären Screening verwendet wird. Diese scFvs nicht nur eine höhere Bindungsaffinität für β-Galactosidase als scFv13 ausgestellt, sondern auch eine bessere Bindung als die erste Runde Klon scFv 1-4 gezeigt. scFv 2-1 zeigten β-Galaktosidase - Bindungs vergleichbar mit der von scFv13.R4 (7A). scFv 2-3 zeigt auch eine weitere Erhöhung der zytoplasmatischen Löslichkeit im Vergleich zu scFv 14, Hervorhebung der simultanen Engineering von Löslichkeit und antigenbindende. Da Affinität und löslicher Expression der scFvs für gleichzeitig gescreent werden, ist es möglich, daß ein ausgewählter scFv moderate Löslichkeit aber hohe Bindung oder umgekehrt. Zum Beispiel hat scFv 2-1 unteren löslichen Expression als scFv 2-3, aber es zeigt eine höhere Bindungsaffinität an &amp; beta; -Galactosidase. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Abbildung 7. Ziel Bindung und Cytoplasmaexpression von scFv - Varianten Innenmembran - Display isoliert werden. (A) scFvs wurden im Zytoplasma von E. ausgedrückt coli - Zellen (z. B. ohne die ssTorA Signalsequenz) mit einem Hexahistidin (6 × His) Markierung und gereinigt Nickel-Nitrilotriessigsäure Spin-Säulen verwendet wird . Die Bindung der gereinigten scFvs an &amp; beta; -Galactosidase wurde mit einem ELISA gemessen. Gereinigtes scFvs wurden auf β-Galactosidase-beschichteten ELISA-Platten geladen werden, und die gebundenen scFvs wurden mit einem anti-6 × His-Antikörper nachgewiesen. Die Daten sind ein Durchschnitt von sechs Wiederholungen, und die Fehlerbalken zeigt Standardfehler des Mittelwerts.(B) Die löslichen und unlöslichen Fraktionen der Zellysate von Zellen, die scFvs cytoplasmatisch durch einen Western - Blot sondiert mit anti-6 × His - Antikörpers analysiert. Gesamtproteinkonzentration das Laden der Proben zu normalisieren, wurde verwendet. Abgedruckt (A) und angepasst (B) von der Referenz 19 mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir bieten eine Methode an, um gleichzeitig eine Bibliothek von Antikörperfragmenten auf Bindungsaffinität und zytoplasmatische Löslichkeit zu untersuchen, indem wir den Escherichia coli Twin-Arginin-Translokationsweg verwenden, der einen inhärenten Qualitätskontrollmechanismus für die intrazelluläre Proteinfaltung hat, um die Antikörperfragmente auf der inneren Membran anzuzeigen.

Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Faltungs-Qualitätskontrolle des Twin-Arginin-Translokationswegs zu nutzen, um die Bindung von Antikörperfragmenten und deren intrazelluläre Faltung in einem einzigen Schritt zu gestalten, was Anwendungen bei der Entwicklung von Antikörpern ermöglicht, die intrazellulär funktionieren sollen. Diese Methode kann helfen, zentrale Herausforderungen im Bereich der Antikörper-Entwicklung zu bewältigen, beispielsweise die Schwierigkeit, Antikörper so zu konstruieren, dass sie sich in der reduzierenden zytoplasmatischen Umgebung korrekt falten und ihre Funktion erfüllen. Nur Antikörper, die sich gut im Zytoplasma falten, werden exprimiert und auf ihre Bindungsfähigkeit getestet.Bietet einen Vorteil gegenüber der Hefe- und Phagendisplaytechnik, die auf sekretorischen Wegen für die Darstellung angewiesen sind. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zu unseren Therapien bei neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen, da diese Krankheiten eine intrazelluläre Pathogenese aufweisen, die durch Antikörper gezielt angegriffen werden könnte. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Verständnis dafür, wie man Sphäroplasten erzeugt und mit ihnen arbeitet, schwierig ist.Nachdem die scFv-Bibliothek mit der ssTorA-Signalsequenz fusioniert und drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln kultiviert wurde, erfolgt die Expression der scFv-Bibliothek über Nacht für 15 bis 22 Stunden bei 20 Grad Celsius und 225 U/min. Nach der Inkubation die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Spektrophotometer messen. Anschließend das berechnete Volumen der induzierten Kultur in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 12.000 × g und Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 100 Mikroliter eiskaltes Fraktionierungspuffer oder fB, um die Pellets erneut aufzuschwemmen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben bei 12.000 × g und Raumtemperatur für eine Minute. Nach dem Entfernen des Überstandes verwenden Sie 350 Mikroliter eiskaltes fB, ergänzt mit 3,5 Mikrolitern 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym, um die Pellets erneut aufzuschwemmen.Als Nächstes 700 Mikroliter 1-Millimolar-EDTA tropfenweise unter langsamer Vortexierung der Röhrchen zugeben und die Röhrchen anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Röhrchenrotator inkubieren, um die Proben zu mischen. Die Röhrchen vom Rotator nehmen. Jeweils 50 Mikroliter eiskaltes 0,5-Molar-MgCl2 zu jedem Röhrchen hinzufügen und 10 Minuten auf Eis inkubieren.Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 11.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nehmen Sie nun mit einer Mikropipette und einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze langsam einen Teil des Pellets auf. Halten Sie dabei das Gefäß schräg, sodass die Öffnung direkt über einem neuen 1,5-Milliliter-Gefäß steht, heben Sie die Pipettenspitze langsam aus dem Überstand und schieben Sie den Pellet in das neue Gefäß.Nach dem Entfernen des überschüssigen Überstandes die Sphäroplasten in einem Milliliter eiskaltem PBS resuspendieren. Die Sphäroplasten müssen vollständig resuspendiert sein, bevor mit dem Panning begonnen wird, da nicht bindende scFvs, die in Aggregaten vorliegen, zu falsch-positiven Ergebnissen beim Panning führen würden. Nach der Biotinylierung des Zielantigens gemäß dem Textprotokoll die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen im ursprünglichen Vial resuspendieren.Überführen Sie anschließend sieben bis zehn mal 10 hoch 9 Perlen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen mit den Perlen zwei Minuten lang auf den Magnetrack, um die Perlen an der Seitenwand des Röhrchens zu sammeln, und pipettieren Sie vorsichtig den Überstand ab. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und verwenden Sie PBS, um die Perlen erneut in Suspension zu bringen, wobei Sie darauf achten, keine Blasen zu erzeugen.Danach das Röhrchen erneut auf den Magneten stellen und den Puffer entfernen, bevor die Perlen zwei weitere Male mit PBS gewaschen werden. Fügen Sie ein Milliliter Lyset mit dem biotinylierten Antigen zu den Perlen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Rotation. Nach der Inkubation waschen Sie die Perlen fünfmal mit PBS, der 1 % BSA enthält.Verwenden Sie anschließend PBS mit 1 % BSA, um die Perlen erneut in Suspension zu bringen. Um die scFv-Bibliothek zu screenen, geben Sie zunächst vier mal 10 hoch 9 Sphäroplasten und acht mal 10 hoch 8 Perlen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 1 x PBS mit 1 % BSA hinzu, um das Gesamtvolumen auf vier Milliliter aufzufüllen.Aliquotieren Sie anschließend die Lösung auf vier 1,5-Milliliter-Röhrchen mit je einem Milliliter und inkubieren Sie die Ansätze bei vier Grad Celsius unter sanfter Rotation für fünf Stunden. Um die an die Kügelchen gebundenen Sphäroplasten für die PCR vorzubereiten, stellen Sie die Panning-Reaktionsröhrchen drei Minuten lang auf den Magneten. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen viermal wie zuvor mit 1× PBS mit 1 % BSA.Verwenden Sie anschließend 25 Mikroliter ddH2O pro Röhrchen, um die Perlen erneut in Lösung zu bringen. Führen Sie, wie im Textprotokoll beschrieben, eine Ganzplasmid-PCR durch, um die Gene für die an die Perlen gebundenen scFvs zu amplifizieren, und rekircularisieren Sie anschließend das Plasmid aus dem PCR-Produkt. Transformieren Sie die gesamte Reaktion gemäß dem Textprotokoll in MC4100-äquivalente Zellen.Um Klone mittels ELISA zu identifizieren, tauen Sie eine Röhre der gepoolten Teilbibliothek auf und impfen Sie sie auf LB-Agarplatten aus. Geben Sie 200 Mikroliter LB mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol in jedes Loch einer runden 96-Loch-Kulturplatte. Mit einer Pipettenspitze wird ein einzelner Kolonie von der Agarplatte entnommen.Bringen Sie dann die Spitze in das erste Loch der 96er-Platte und rühren Sie vorsichtig um, um zu impfen. Fahren Sie fort, jeweils eine Kolonie in jedes Loch zu impfen. Inkubieren Sie 20 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Mikroplatten-Shaker.Nach der Herstellung einer Beschichtungslösung für das Zielantigen gemäß dem Textprotokoll 50 Mikroliter der Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-High-Binding-klaren Polystyrol-ELISA-Platte geben. Die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Kolonien von den 96-Loch-Kulturplatten gemäß dem Textprotokoll auf Agarplatten replizieren.Danach die Beschichtungslösung aus den ELISA-Platten entfernen und 100 µL der gemäß dem Textprotokoll hergestellten Blockierungslösung in jedes Loch geben. Mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. 20 µL eines konzentrierten Zelllysepuffers in jedes Loch der Rundbodenkulturschale geben und die Kulturschale 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Mikroplatten-Shaker inkubieren.Entleeren Sie die Blockierungslösung aus den ELISA-Platten und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit jeweils 200 µL Waschpuffer, der gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde. Nach dem Entfernen des letzten Waschschritts übertragen Sie 50 µL aus jedem Well der Zelllyseplatte in den entsprechenden Well der ELISA-Platte. Inkubieren Sie die Platten eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.Fahren Sie fort, indem Sie die Proben aus der ELISA-Platte entleeren und die Vertiefungen viermal waschen. Danach bereiten Sie die Antikörperlösung zur Detektion von scFvs gemäß dem Textprotokoll vor. Geben Sie 50 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.Waschen Sie die ELISA-Platten viermal mit Waschpuffer, bevor Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung HRP-Substrat hinzufügen, das gemäß der Herstelleranleitung zubereitet wurde. Inkubieren Sie die Platten 30 bis 60 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Zum Stoppen der Reaktion geben Sie 50 Mikroliter dreimolare H2SO4 in jede Vertiefung und pipettieren vorsichtig, um die Lösung zu mischen.Schließlich die Extinktion mit einem Plattenlesegerät bei 492 Nanometern messen. In diesem Experiment wurden scFv-Antikörper, scFv13 und scFv13.R4, entweder an die native ssTorA-Sequenz oder an eine modifizierte ssTorA-Sequenz fusioniert, die nicht durch den Twin-Arginin-Translokationsweg, auch Tat-Weg genannt, erkannt wird. scFv.R4 faltet sich gut und wird bei Fusion mit dem nativen ssTorA in der inneren Membran exprimiert. ScFv13 faltet sich dagegen schlecht und wird unabhängig vom verwendeten Tat-Signalpeptid nicht in der inneren Membran dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur Proteine, die über ein Tat-Signalpeptid verfügen und im Cytoplasma korrekt gefaltet werden, in der inneren Membran angezeigt werden. Dadurch kann der Tat-Weg als Screening-Verfahren für die intrazelluläre Faltung dienen.In diesem Experiment wurde eine fehleranfällige PCR-Bibliothek, die auf scFv13 basiert und eine geringe Bindungsaffinität für Beta-Galaktosidase aufweist, gegen Beta-Gal abgesiebt. scFv 1-4 wurde isoliert und zeigte eine höhere Bindungsaffinität zu Beta-Gal sowie eine größere cytoplasmatische Löslichkeit im Vergleich zu scFv13. Unter Verwendung von scFv 1-4 als Konkurrent gegen die Bibliothek der zweiten Generation scFv 1-4 wurden scFv 2-1 und 2-3 isoliert, die noch höhere Bindungsaffinitäten für Beta-Gal als scFv13 1-4 aufwiesen, wodurch die gleichzeitige Optimierung von Löslichkeit und Antigenbindung verdeutlicht wurde.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ELISA mit gereinigtem Lysat durchgeführt werden, um die Antigenspezifität zu überprüfen und die Bindungsaffinität der isolierten Klone zu bestimmen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie verstehen, wie man einen Antikörper daraufhin screenen kann, ob er an ein Antigen Ihrer Wahl bindet, indem der Tat-Sekretionsweg zur Darstellung der Bibliothek und die magnetische Bindebead-Panning zur Anreicherung und Isolierung von Antigenbindern verwendet wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Schwefelsäure äußerst gefährlich sein kann und das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung erforderlich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken ist eine bewährte Technik für Entdeckung von Peptid Affinität Reagenzien, eine robuste Alternative zu Antikörpern. Die halbautomatische Sortiermethode hierin wurde gestrafft, Biopanning um das Auftreten von Fehlalarmen zu verringern. Hier zeigen wir den Denkprozess und Techniken Bewertung der Kandidaten und nachgelagerte Analyse zu minimieren.

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

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Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

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Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

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Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

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