Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Faltungsqualitätskontrolle des Zwillings-Arginin-Translokationswegs zu nutzen, um die Bindung von Antikörperfragmenten und die intrazelluläre Faltung in einem einzigen Schritt zu beeinflussen, was bei der Entwicklung von Antikörpern zur intrazellulären Funktion Anwendung finden wird. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Herausforderungen im Bereich des Antikörper-Engineerings zu meistern, wie z. B. die Überwindung der Schwierigkeit, Antikörper so zu entwickeln, dass sie sich falten und in der reduzierenden zytoplasmatischen Umgebung richtig funktionieren. Nur Antikörper, die sich im Zytoplasma gut falten, werden angezeigt und auf Bindung getestet.

Dies bietet einen Vorteil gegenüber Hefe- und Phagendisplays, die auf sekretorische Wege zur Präsentation angewiesen sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf unsere Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen, da diese Krankheiten eine intrazelluläre Pathogenese beinhalten, auf die Antikörper abzielen könnten. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es eine Herausforderung ist, zu verstehen, wie man Sphäroplasten erzeugt und mit ihnen arbeitet.

Nachdem Sie die scFv-Bibliothek mit der ssTorA-Signalsequenz fusioniert und drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln gezüchtet haben, lassen Sie die scFv-Bibliothek über Nacht 15 bis 22 Stunden lang exprimieren. Nach der Inkubation messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte bei 600 Nanometern. Zentrifugieren Sie dann das berechnete Volumen der induzierten Kultur in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 12.000 g und Raumtemperatur für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 100 Mikroliter eiskalten Fraktionierungspuffer oder fB, um die Pellets wieder zu suspendieren. Zentrifugieren Sie dann die Proben eine Minute lang bei 12.000 g und Raumtemperatur. Nach Entfernen des Überstands verwenden Sie 350 Mikroliter eiskaltes fB, ergänzt mit 3,5 Mikrolitern 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym, um die Pellets zu resuspendieren.

Fügen Sie anschließend beim langsamen Vortexen der Röhrchen tropfenweise 700 Mikroliter 1 Millimolar EDTA hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen auf einem Röhrchenrotator bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um die Proben zu mischen. Entfernen Sie die Schläuche vom Rotator. Geben Sie 50 Mikroliter eiskaltes MgCl2 mit fünf molaren Punkten in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.

Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 11.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Ziehen Sie nun mit einer Mikropipette und einer Ein-Milliliter-Spitze langsam einen Teil des Pellets nach oben. Heben Sie dann das Röhrchen in einem Winkel mit der Öffnung direkt über einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen langsam aus dem Überstand und schieben Sie das Pellet in das neue Röhrchen.

Verwenden Sie nach dem Entfernen des überschüssigen Überstands einen Milliliter eiskaltes PBS, um die Sphäroplasten zu resuspendieren. Sphäroplasten müssen vor dem Panning vollständig resuspendiert werden, da nicht bindende scFvs, die in Aggregaten vorhanden sind, zu falsch positiven Ergebnissen beim Panning führen. Nach der Biotinylierung des Zielantigens gemäß dem Textprotokoll resuspendieren Sie die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen in ihrem Originalfläschchen.

Dann sieben bis 10 mal 10 bis 9. Kügelchen in eine 1,5 Milliliter Tube geben. Legen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen für zwei Minuten auf das Magnetgestell, um die Kügelchen an der Seite des Röhrchens zu sammeln, und pipettieren Sie, um den Überstand vorsichtig zu entfernen. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und verwenden Sie PBS, um die Kügelchen zu resuspendieren, ohne Blasen zu erzeugen.

Setze dann die Tube wieder in den Magneten ein und entferne den Puffer, bevor du die Kügelchen noch zwei Mal mit PBS wäschst. Geben Sie einen Milliliter Lysat, das das biotinylierte Antigen enthält, zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter sanfter Drehung. Nach der Inkubation verwenden Sie PBS mit 1% BSA, um die Kügelchen fünfmal zu waschen.

Verwenden Sie dann PBS mit 1%BSA, um die Kügelchen zu resuspendieren. Um die scFv-Bibliothek zu screenen, geben Sie zunächst viermal 10 zu den 9. Sphäroplasten und achtmal 10 zu den 8. Kügelchen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie ein x PBS mit 1 % BSA hinzu, um das Gesamtvolumen auf vier Milliliter zu bringen.

Dann aliquotiert man die Lösung in vier 1,5-Milliliter-Röhrchen zu je einem Milliliter und inkubiert die Reaktionen bei vier Grad Celsius, indem man sie fünf Stunden lang sanft dreht. Um die kügelchengebundenen Sphäroplasten für die PCR vorzubereiten, legen Sie die Panning-Reaktionsgefäße drei Minuten lang auf den Magneten. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen viermal wie zuvor mit einem x PBS mit 1%BSA.

Verwenden Sie dann 25 Mikroliter ddH20 pro Tube, um die Kügelchen zu resuspendieren. Wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie eine Ganzplasmid-PCR durch, um die Gene für beadgebundene scFvs zu amplifizieren, und rezirkulieren Sie dann das Plasmid aus dem PCR-Produkt. Wandeln Sie die gesamte Reaktion gemäß dem Textprotokoll in MC4100-entzerrte Zellen um.

Um Klone mit ELISA zu identifizieren, tauen Sie ein Röhrchen der gepannten Subbibliothek und die Platte auf LB-Agarplatten auf. Geben Sie 200 Mikroliter LB mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit rundem Boden. Entnehmen Sie mit einer Pipettenspitze eine einzelne Kolonie von der Agarplatte.

Legen Sie dann die Spitze in die erste Vertiefung der 96-Well-Platte und rühren Sie vorsichtig um, um sie zu impfen. Fahren Sie fort, eine Kolonie in jede Vertiefung zu impfen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden auf einem Mikroplattenschüttler.

Nach der Herstellung einer Zielantigen-Beschichtungslösung gemäß dem Textprotokoll geben Sie 50 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Hochbindungsplatte aus klarem Polystyrol-ELISA. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius. Als nächstes replizieren Sie die Kolonien aus den 96-Well-Kulturplatten auf Agarplatten gemäß dem Textprotokoll

Entleeren Sie dann die Beschichtungslösung von den ELISA-Platten und geben Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung, die gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde, in jede Vertiefung. Inkubieren Sie mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Geben Sie 20 Mikroliter eines konzentrierten Zelllyse-Detergens in jede Vertiefung der Kulturplatte mit rundem Boden und inkubieren Sie die Kulturplatte auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten.

Entleeren Sie die Blockierungslösung von den ELISA-Platten und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer, der gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde. Übertragen Sie nach dem Entfernen der letzten Wäsche 50 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Zelllyseplatte in die entsprechende Vertiefung der ELISA-Platte. Inkubieren Sie die Platten ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Leeren Sie die Proben von der ELISA-Platte und waschen Sie die Vertiefungen viermal. Bereiten Sie anschließend die Antikörperlösung zum Nachweis von scFvs gemäß dem Textprotokoll vor. Geben Sie 50 Mikroliter des Antikörpers in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die ELISA-Platten viermal mit Waschpuffer, bevor Sie 200 Mikroliter HRP-Substrat pro Vertiefung hinzufügen, das gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt wurde. Inkubieren Sie die Platten im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten. Um die Reaktion abzuschrecken, geben Sie 50 Mikroliter drei molare H2SO4 in jede Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um die Lösung zu mischen.

Messen Sie abschließend die Extinktion mit einem Plattenmesswert bei 492 Nanometern. In diesem Experiment wurden scFv-Antikörper scFv13 und scFv13. R4 wurden entweder mit der nativen ssTorA-Sequenz oder mit einem modifizierten ssTorA fusioniert, das vom Zwillings-Arginin-Translokationsweg, auch Tat-Signalweg genannt, nicht erkannt wird.ScFv.

R4 faltet sich gut und wird auf der inneren Membran exprimiert, wenn es mit nativem ssTorA infundiert wird. ScFv13 faltet sich nicht gut und wird nicht auf der inneren Membran angezeigt, unabhängig davon, mit welchem Tat-Signalpeptid es fusioniert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur Proteine, die das Tat-Signalpeptid enthalten und im Zytoplasma korrekt gefaltet sind, auf der inneren Membran angezeigt werden, so dass der Tat-Signalweg als Schirm für die intrazelluläre Faltung fungieren kann.

In diesem Experiment wurde eine fehleranfällige PCR-Bibliothek auf Basis von scFv13, die eine geringe Bindungsaffinität für Beta-Galactosidase aufweist, gegen Beta-Gal gepanpt. ScFv 1-4 wurde isoliert und zeigte eine höhere Bindungsaffinität zu beta-Gal als scFv13 sowie eine höhere zytoplasmatische Löslichkeit. Unter Verwendung von scFv 1-4 als Konkurrent gegen die scFv 1-4-Bibliothek der zweiten Generation wurden scFv 2-1 und 2-3 isoliert und zeigten eine noch höhere Bindungsaffinität für beta-Gal als für scFv13 1-4, was die gleichzeitige Entwicklung von Löslichkeit und Antigenbindung unterstreicht.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die von ELISA mit gereinigtem Lysat durchgeführt werden, um die Antigenspezifität zu überprüfen und die Bindungsaffinität isolierter Klone zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie einen Antikörper screenen, um die Bindung an ein Antigen von Interesse zu gewährleisten, indem Sie den Tat-Signalweg verwenden, um diese Bibliothek anzuzeigen, und magnetisches Bead-Panning verwenden, um Antigenbinder anzureichern und zu isolieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Schwefelsäure äußerst gefährlich sein kann und das Tragen einer geeigneten persönlichen Schutzausrüstung erforderlich ist.