Effiziente Sporulation von Saccharomyces cerevisiae In einer 96-Multiwell-Format

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, knospende Hefe effizient in einem 96-Well-Format zu sporulieren. Obwohl viele groß angelegte Screenings an der knospenden Hefe durchgeführt wurden, waren Hochdurchsatzstudien, die sich mit Meiose und Sporulation befassten, begrenzt. Die in diesem Video beschriebene Technik hat den Vorteil, dass sie Hefe effizient und kostengünstig in einem 96-Well-Format sporuliert, das mit dem Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist.

Die Idee zu dieser Methode kam mir, weil ich eine gekachelte Zwei-Mikron-Plasmidbibliothek verwenden wollte, um nach hohen Kopiensuppressoren einer Mutante zu suchen, die keine refraktilen Sporen bilden konnte. Anfangs waren meine Sporulationseffizienzen im 96-Well-Format schlecht. Ich stellte fest, dass dies auf eine unzureichende Belüftung zurückzuführen war.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie den SK1-Hefestamm auf eine Hefeextrakt-Peptonglycerin- oder YPG-Platte auftauen. Kratzen Sie mit einem sterilen Stäbchen eine kleine Menge Zellen aus dem Gefrierfläschchen mit der Glycerinbrühe und verteilen Sie sie auf einer YPG-Platte. Lass die Hefe 12 bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius wachsen.

Streichen Sie als Nächstes die Hefe von der YPG-Platte auf eine Hefeextrakt-Pepton-Dextrose- oder YPD-Platte für einzelne Kolonen. Lass die Hefe auf der YPD-Platte 24 bis 48 Stunden bei 30 Grad Celsius wachsen. Nach 24 bis 48 Stunden Wachstum auf festen YPD-Medien beginnen Sie eine 25-Milliliter-YPD-Kultur mit einer einzigen Kolonie aus der YPD-Platte.

Züchten Sie diese Kultur über Nacht in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 220 U/min, bis die Zellen einen OD600 von 4,0 bis 7,0 erreichen. Verwenden Sie am nächsten Tag eine angemessene Menge an Zellen aus der YPD-Kultur, um eine 125-Milliliter-Kultur in Hefeextrakt-Peptonacetat oder YPA mit einem OD600 von 0,1 zu beginnen. Züchten Sie die Kultur in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 220 U/min, bis der OD600 zwischen 1,3 und 1,5 liegt.

Übertragen Sie die Kultur in Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 1800X G in einer Tischzentrifuge, um die Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem Volumen von 0,5 Volumen sterilem autoklaviertem deionisiertem Wasser. Nochmals schleudern und das Wasser wegwerfen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem 1-fachen Volumen Sporulationsmedium. Zur Präparation von Zellen unterschiedlicher Genotypen werden zunächst Zellen aus aufgetauten Tiefkühlbeständen in einer 96er Multiwell-Platte auf YPG-Festträger überführt. Entflammen Sie einen 96-Zinken-Froschger und kühlen Sie ihn dann kurz auf einem Teller mit festem Medium ab, bevor Sie ihn mit den Hefekolonien berühren.

Lass die Hefe über Nacht bei 30 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag übertragen Sie die Zellen aus dem YPG-Festmedium auf das YPD- oder selektive Festmedium, je nach Genotyp des Stammes. In dieser Demonstration wird YPD verwendet.

Lass die Hefe bei 30 Grad Celsius wachsen, bis sich für jeden Stamm Kolonien gebildet haben. Aliquotieren Sie 1,2 Milliliter flüssiges YPD-Medium in jede Vertiefung einer 96-Deep-Well-Platte. Übertragen Sie die Zellen aus dem festen Medium in flüssige Medien.

Decken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel aus einer rechteckigen Petriplatte ab und halten Sie den Deckel mit einem Stück Klebeband fest, um die Luftzirkulation so wenig wie möglich einzuschränken. Züchten Sie die Zellen über Nacht in einem 30 Grad Celsius heißen Shaker bei 220 U/min. Am nächsten Tag fünf Minuten lang bei 1800X G zentrifugieren.

Gießen Sie das Medium ab und geben Sie 500 Mikroliter YPA in jede Vertiefung. Und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen. Decken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel ab, der mit Klebeband fixiert wird.

Züchten Sie die Zellen 15 Stunden lang in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 220 U/min. Um eine gute Belüftung für eine effiziente Sporulation zu gewährleisten, geben Sie in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte entweder eine drei Millimeter sterile feste Glaskugel oder einen sterilen fünf Millimeter x zwei Millimeter großen Magnetrührstab. Wenn alle Zellen vom gleichen Genotyp sind, werden 500 Mikroliter Zellen plus Medium in jede Vertiefung der 96-Multiwell-Platte gegeben.

Decken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel ab, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn Zellen unterschiedlicher Genotypen sind, drehen Sie die Zellen, die sich in YPA befinden, fünf Minuten lang bei 1800X G und gießen Sie das Medium ab. Geben Sie 500 Mikroliter Sporulationsmedium in jede Vertiefung.

Und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen im Sporulationsmedium. Decken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel ab, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn Sie Glasperlen verwenden, legen Sie die Proben in einen Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 220 U/min, um die Sporulation zu gewährleisten.

Wenn Sie magnetische Rührstäbchen verwenden, legen Sie die Proben zur Sporulation auf eine Rührplatte in einem 30 Grad Celsius heißen Inkubator. Die genaue Rührgeschwindigkeit für die Magnetstäbe ist nicht sehr wichtig, solange sich alle Stäbe energisch bewegen und die Kultur belüftet ist. Entnehmen Sie 36 Stunden später die Proben, um den Verlauf durch die Sporulation zu überwachen.

Entnehmen Sie sechs Mikroliter Zellen aus jeder Sporenkultur und fügen Sie sie zu 24 Mikrolitern Sporulationsmedium in einer 96-Well-Deckglasplatte hinzu. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen, bevor Sie sie mit einem inversen Mikroskop untersuchen. Eine repräsentative Sporulation von zwei verschiedenen Stämmen ist in diesen Bildern von Zellen zu sehen, die mit einem 63X-Objektiv auf einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht wurden.

Refraktile Tetraden, die durch die Pfeilspitzen angedeutet werden, sind in der Wildtyp-Kultur zu sehen. Aber nicht in der Kultur, die die sporulationsdefizienten smk1-Delete-Zellen enthält. Es wurden Vergleiche zwischen der Sporulationseffizienz von Zellen, die in Multi-Well-Platten sporuliert wurden, und Zellen, die mit größeren Volumina in Kolben sporuliert wurden, durchgeführt.

Die Verwendung von Multi-Well-Platten erreichte nicht die hohe Effizienz, die routinemäßig bei der Verwendung des typischeren Protokolls der Sporulation in Kolben beobachtet wird. Die Sporulation in Multi-Well-Platten mit richtiger Belüftung kann eine ausreichende Sporulationseffizienz von mehr als 50 % erreichen, wobei die besten Ergebnisse mit einem fünf Millimeter dicken Rührstab erzielt werden. Angesichts der hohen Kosten der kleinen Rührstäbchen sind die Wirkungsgrade durch den Einsatz von Glasperlen jedoch vergleichbar.

Obwohl sowohl Fünf-Millimeter- als auch Sieben-Millimeter-Rührstäbchen in die Vertiefung einer 96-Multiwell-Platte passen, führte die Verwendung eines Sieben-Millimeter-Rührstäbchens zu einer schlechten Sporulationseffizienz. Der sieben Millimeter lange Rührstab in einer Vertiefung neigt dazu, mit einem Rührstab in einer angrenzenden Vertiefung zu interagieren. Verhindern, dass sich die Riegel richtig rühren, und sorgen für eine ausreichende Belüftung der Kultur.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hefezellen in Flüssigkulturen im 96-Well-Format effizient sporuliert werden können. Einmal gemeistert, kann dieser Prozess in sechs Tagen abgeschlossen werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um verschiedene mutierte Stämme, Plasmide oder niedermolekulare Inhibitoren auf ihre Wirkung auf Meiose und Sporulation zu untersuchen.

Nach seiner Entwicklung wurde diese Technik verwendet, um die Regulation des meiotischen Zellzyklus zu untersuchen und wie Zytokinese und Meiose bei der Sporulation in Saccharomyces cerevisiae gekoppelt sind.