Name: Effiziente Sporulation von Saccharomyces cerevisiae In einer 96-Multiwell-Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Sporulation von Saccharomyces cerevisiae im 96-Well-Format für Hochdurchsatz-Screenings. Diese kostengünstige Methode mit optimierter Belüftung ermöglicht genetische Untersuchungen in der Hefe.

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Diese Arbeit wurde von einem Joseph P. Healey Zuschuss von der University of Massachusetts Boston (LSH) und R15 GM86805 vom NIH (LSH) unterstützt. SMP wird teilweise durch eine Sanofi-Genzyme Fellowship an der University of Massachusetts Boston unterstützt.

1. Vorbereitung für Sporulation . Anmerkung: Die Medien in diesem Protokoll beschrieben werden , hergestellt unter Verwendung Standardrezepturen und -verfahren 13,17 Tabelle 1 gibt die Formulierung für 1 L der verschiedenen Medien in diesem Protokoll verwendet. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bactopepton </td><td style="width: 50px;"> Hefeextrakt </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> Traubenzucker </td><td style="width: 70px;"> KALIUMACETAT </td><td style="width: 60px;"> Glycerol </td><td style="width: 60px;"> ddH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPG-Platten </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD-Platten </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD Flüssigkeit </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1,000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA Flüssigkeit </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1,000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> Sporulation Medien </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1,000 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Medienformulierungen Die Beträge werden für 1 l Medien gegeben. Einzelheiten über MedienZutaten können in der Materialtabelle. <ol><li> Wenn alle sporulierendem Zellen die gleichen Genotyps sein, gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Thaw Hefestamm auf einem YPG (YPGlycerol) Platte verwendet werden. Wachsen Hefe für 12-16 h bei 30 ° C. Wichtig ist, dass SK1 Zellen auch sollte, so SK1 Stämme zur Sporulation balanciert nicht zu lange auf YPG-Platten belassen werden, oder sie können auf der Platte sporulieren. Hinweis: Ein frisch aufgetauten Belastung auf YPG gezüchtet wird bevorzugt, wie Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle oxidative Phosphorylierung benötigt, und wählt somit für Zellen, die funktionelle mitochondrialen DNA aufweisen. SK1 Zellen haben eine Tendenz, funktionelle Mitochondrien-DNA zu verlieren und petites. Funktionelle mitochondrialer DNA ist für die Sporenbildung benötigt. </li><li> Streak Hefe aus der YPG Platte auf eine YPD (YPDextrose) Platte für einzelne Kolonien. Wachsen Hefe auf YPD-Platte 24-28 h bei 30 ° C. </li><li> Nach etwa 36 bis 48 h Wachstum auf YPD festen Medien, starten Sie eine 25 ml YPD-Kultur eine einzige Kolonie mitvon der YPD Platte. Wachsen diese Kultur , bis die Zellen etwa OD 600 = 4,0 bis 7,0 liegen. Führen Sie diesen Schritt bei 30 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln. </li><li> Von der YPD - Kultur, eine entsprechende Menge an Zellen verwenden , um 1000 ml YPA (YPAcetate) Kultur beginnen , die OD 600 = 0,1 für jede 96 - Well - Platte Bedarf in Abschnitt 2. wachsen Hefe in einem 30 ° C Schüttelinkubator ist (bei ​​220 Schütteln rpm) , bis die Kultur OD 600 zwischen 1,3 bis 1,5 ist. Hinweis: Impfen 100 ml YPA Kultur für jede 96 Multiwellplatte in Abschnitt 2. Zum Beispiel zu sehen sein, wenn vier 96 Mikrotiterplatten Screening, 400 ml YPA Kultur benötigt. Beginnend mit 10% mehr Volumen in der YPA Kultur ist notwendig, gegen Verdunstungsvolumenverlust zu schützen. Typischerweise wird es zwischen 12 bis 16 Stunden dauern , Zellen , die die entsprechenden OD 600 zu erreichen; die Zeit kann in Abhängigkeit vom Genotyp des Hefestamm variieren. YPA ist die presporulation Medien. Pregrowthin Acetat hilft Expression von Genen (wie IME1) induzieren für einen effizienten und synchronen Sporulation 6 benötigt. </li><li> Spin bei 1.800 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min Zellen in YPA gewachsen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen 1x mit 0,5 Volumen sterilen autoklaviert entsalztem Wasser. Spin wieder, und entsorgen Sie waschen. Die Zellen in 1x Volumen Sporulation Medien. Weiter zu Abschnitt 2. </li></ol></li><li> Bei Verwendung von Zellen für die Sporulation , die von verschiedenen Genotypen sind, (dh transformiert mit verschiedenen Plasmiden oder verschiedene Mutationen enthalten, in der Regel erhalten , und als gefrorene Vorräte gespeichert), array Zellen der verschiedenen Genotypen in eine 96 - Multiwell - Format. Dann gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Verwenden Sie eine sterile 96 Zinke Frogger Zellen aus aufgetauten gefrorenen Bestände in 96 Multiwellplatte zu übertragen (s) auf YPG festen Medien. Wachsen Hefe über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Mit einem sterilen 96 Zinke Frogger, Transfer-Zellen von YPG festen Medien auf YPD feste Medien oder selektivefeste Medien (dh synthetische Minimalmedien Aminosäuren fehlen, wenn die Zellen Plasmide enthalten , die Auswahl benötigen). Hefe wachsen bei 30 ° C bis Kolonien für jeden Stamm gebildet werden, typischerweise 1 Tag auf YPD und 2 Tage, wenn selektiven Medien notwendig. </li><li> Aliquot 1,2 ml YPD flüssigen Medien oder selektive flüssige Medien in jede Vertiefung einer 96 tief 2 ml Multiwellplatte. Transfer-Zellen aus festen Medien in flüssige Medien ein Frogger mit, Deckel mit einem Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten und wachsen über Nacht in 30 ° C Schüttler bei 220 Umdrehungen pro Minute schütteln. Hinweis: Zur Minimierung von Verschmutzung, Abdeckplatten mit den Kunststoffdeckel aus einem rechteckigen Petrischale. Halten Deckel anstelle ein Stück Klebeband, so dass die Luftzirkulation minimal eingeschränkt ist. </li><li> Zentrifugenplatten bei 1.800 × g für 5 min, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen Sie Medien von Zellen; Add 500 ul YPA in jede Vertiefung und resuspendieren in der YPA pelletierten Zellen. Abdeckungmit Kunststoffdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. </li><li> Wachsen Zellen für 15 Stunden bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln. Weiter zu Abschnitt 2. </li></ol></li></ol> 2. sporulierendem Zellen in einer 96-Multiwell-Format <ol><li> Fügen Sie entweder ein 3 mm sterilen festen Glasperle oder eine sterile 5 mm x 2 mm magnetischen Rührstab in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 1,3 ml Brunnen. (Siehe Repräsentative Ergebnisse unten für eine Diskussion darüber , ob eine Perle oder einen Rührstab zu verwenden.) </li><li> Wenn alle Zellen des gleichen Genotyps gescreent werden, um 2.2.1 gehen. Wenn Zellen von verschiedenen Genotypen gescreent werden, um 2.2.2 gehen. <ol><li> Nehmen Sie Zellen aus Schritt 1.1.5 und aliquoten 500 ul Zellen plus Medien in jede Vertiefung der 96 Multi-Well-Platte. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3. </li><li> Spin-Zellen, die für 5 min in YPA von 1.2.4 bei 1.800 xg sind, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen vonf Medien aus Zellen. Hinzufügen 500 ul Sporulation Medium zu jeder Vertiefung gegeben und resuspendieren pelletierten Zellen in der Sporulation Medien. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3. </li></ol></li><li> Bei Verwendung einer Glasperle, Platz Proben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute für die Sporenbildung. Wenn eine magnetische Rührstab verwenden, Ort Proben auf einer Rührplatte innerhalb einer 30 ° C-Inkubator für Sporulation. Hinweis: Die genaue Rührgeschwindigkeit für die magnetischen Rührstäbe nicht sehr wichtig ist, solange alle Balken bewegen sich energisch und die Kultur belüftet wird. </li><li> Zu überwachen, die Progression durch Sporulation werden Proben aus der Kultur sporulierenden zur Visualisierung, In 6 ul von Zellen aus der sporulierenden Kulturen auf 24 &amp; mgr; l der Sporulation Medium in einer 96-Well-Deckplatte (1: 5-Verdünnung). Lassen Sie Zellen für 5 Minuten absetzen, bevor Zellen mit einem inversen Mikroskop zu untersuchen. Hinweis: In Wildtyp-SK1 Zellen, kompakt reifen Sporen von 3 bilden6 Stunden nach der Übertragung auf die Sporulation Medien. Progression durch Sporulation kann durch Mikroskopie unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, wie beispielsweise ein Kernmarker (dh HTB2-mCherry 18) zu untersuchen , die meiotische Teilung oder eine prospore Membranmarker (dh G20 19) zu untersuchen sporen Morphogenese überwacht werden. Alternativ kann die Bildung von refractile Sporen Nomarski DIC-Mikroskopie beginnend etwa 12 Stunden nach dem Transfer auf die Sporulation Medien gesehen werden. </li></ol>

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<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
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<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für sporulierendem SK1 Hefe in einem 96 Multi-Well-Format. Belüftung ist der Schlüssel für die effiziente Sporulation, die die Verwendung von entweder einem Rührstab oder einer Glasperle in jeder Vertiefung erfordert. Wenn Zellen ohne entweder in einer 96-Mikrotiterplatte in einem Schüttelinkubator sporulierten sind eine Perle oder einem Rührstab, Sporulation nicht effizient Zellen. Nur ein geringer Anstieg der Sporulationseffizienz gesehen wird , wenn Zellen ohne entweder einen Wulst...

Sporulation in der Bäckerhefe wurde untersucht , Einblicke in viele Aspekte der Biologie zu schaffen, einschließlich der Kontrolle der Chromosomensegregation während der Meiose 1, Mechanismen der genetischen Rekombination 2, die Kontrolle der Entwicklung von Zelle 3 Signalisierung, Ernährungs - Management von Entwicklung 4, die Transkriptions Regulierung der Entwicklung 5 und die Prüfung der Sporenbildung 6. Sporenbildung beinhaltet eine neuartige Zellteilung Ereignis die Bildung neuer Membran Kompartimente innerhalb der Mutterzelle durch Abscheiden einer Schutzsporenwand 6 gefolgt beteiligt sind . Diese Studien , die sporulierendem Zellen oft nutzen die schnell sporulierendem Hefestamm SK1 zu untersuchen, die den Prozess der Sporulation in etwa 24 Stunden in einem relativ effiziente Art und Weise 7,8 eingehen können. Obwohl die Optimierung der Sporulationsbedingungen für Hefe - Knospung haben 9-13 beschrieben worden ist , diese Experiments geprüft Sporulation auf festen Medien oder in größerem Maßstab flüssige Kulturen, in denen die Sporenbildung durchgeführt wird Kulturröhrchen oder Kolben verwendet wird. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur sporulierenden Hefe in einem 96-Multiwell-Platten-Format. Wir finden, dass für dieses Verfahren, Belüftung für synchrone und effiziente Sporulation kritisch ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Sporulation ein kleinvolumiger Multiwell-Format zu gewährleisten. In einer 96 Multi - Well - Plattenformat sporulierendem ermöglicht Zellen für eine Multi - Well - Plattenformat, wie zum Screening für eine hohe Kopien Suppressoren mit einem gekachelten Bibliothek 14-16 optimierte Hochdurchsatztechniken und unter Verwendung von Reagenzien zu sehen sein.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml DeepWell Platten</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Für die Sporulation</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml DeepWell Platten</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Für das Wachstum vor der Sporulation, Schritt 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm Glasperle</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Für die Sporulation</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm Rührstab, Packung mit 12</td><td>Stück Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Für die Sporulation</td></tr><tr><td>96 gut frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>benötigt für Schritt 1.2</td></tr><tr><td>Bibliothekskopierer</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>wird für Schritt 1.2 benötigt; zur Verwendung mit dem rechteckigen</td></tr><tr><td>Petrischale</td> des Froggers <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>wird für Schritt 1.2</td></tr><tr><td>benötigt Bacto Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>wird für das Medium</td></tr><tr><td>benötigt Hefeextrakt</td><td>BD</td><td>212750</td><td>wird für das Medium</td></tr> benötigt <tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>wird für das Medium</td></tr><tr><td>Dextrose</td> <td>benötigtFisher</td><td>D16-3</td><td>wird für Medien benötigt</td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>wird für Medien</td></tr> benötigt <tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>wird für Medien</td></tr><tr><td>benötigt Schwarz 96 Well Glasbodenplatte</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>wird für Schritt 2.4 benötigt</td></tr></tbody></table>

effiziente sporulation von<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; in einer 96-multiwell-format

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

In Zeiten von Ernährungsstress durchläuft Saccharomyces cerevisiae eine Gametogenese, die als Sporulation bekannt ist. Diploide Hefezellen, die an Stickstoff und Kohlenstoff hungern, leiten den Sporulationsprozess ein. Der Prozess der Sporulation umfasst die Meiose, gefolgt von der Sporenbildung, bei der die haploiden Kerne in umweltresistente Sporen verpackt werden. Wir haben Methoden für die effiziente Sporulation von knospenden Hefen in 96 Multiwell-Platten entwickelt, um den Durchsatz von Screening-Hefezellen auf Sporulationsphänotypen zu erhöhen. Diese Verfahren sind kompatibel mit dem Screening mit Hefe, die Plasmide enthält, die eine Nährstoffselektion erfordern, wenn geeignete Minimalmedien verwendet werden, oder mit dem Screening von Hefe mit genomischen Veränderungen, wenn ein reichhaltiges Präsporulationsschema verwendet wird. Wir sind der Meinung, dass bei dieser Methode die Belüftung während der Sporulation entscheidend für die Sporenbildung ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, die mit dem 96-Multiwell-Plattenformat kompatibel sind. Obwohl diese Methoden nicht das typische ~80%-Sporulationsniveau erreichen, das in großvolumigen Kolben-basierten Experimenten erreicht werden kann, erreichen diese Methoden zuverlässig ein Sporulationsniveau von etwa 50-60% in kleinvolumigen Multiwell-Platten.

<html> Um dieses Protokoll Beurteilung Sporulation Effizienzen aus sporulierenden Zellen in Multi - Well - Platten erhalten (wie oben beschrieben) wurden im Vergleich zu Zellen sporuliert Verwendung größerer Volumen in den Flaschen (Tabelle 2). Die Verwendung von Multiwell-Platten nicht erreicht die hohe Effizienz gesehen, wenn in Flaschen sporulierenden, wobei ~ 80% Wirkungsgrad routinemäßig gesehen werden kann. Sporulierendem in Mikrotiterplatten mit der richtigen Belüf...

Hier wird die Sporulation von Saccharomyces cerevisiae in einem 96er Multiwell-Format durchgeführt.

Effiziente Sporulation von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; In einer 96-Multiwell-Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Hefe effizient im 96-Well-Format zur Sporulation zu bringen. Obwohl bereits viele großangelegte Untersuchungen an der Hefe durchgeführt wurden, waren Hochdurchsatzstudien zur Meiose und Sporulation bisher begrenzt. Die in diesem Video beschriebene Technik bietet den Vorteil, dass Hefe effizient und kostengünstig im 96-Well-Format gesporuliert werden kann, das mit Hochdurchsatz-Screenings kompatibel ist.Die Idee zu dieser Methode hatte ich zunächst, weil ich eine gekachelte Plasmidbibliothek mit zwei Mikrometern verwenden wollte, um nach Hochkopiezahlen-Suppressoren eines Mutanten zu screenen, der keine lichtbrechenden Sporen bilden konnte. Anfangs waren meine Sporulationseffizienzen im 96-Loch-Format schlecht. Ich stellte fest, dass dies auf unzureichende Belüftung zurückzuführen war.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den SK1-Hefestamm auf eine Hefe-Extrakt-Pepton-Glycerin- oder YPG-Platte auftauen. Verwenden Sie einen sterilen Stab, um eine kleine Menge Zellen aus dem Gefriervial mit dem Glycerinbestand abzukratzen, und verteilen Sie diese auf einer YPG-Platte. Kultivieren Sie die Hefe 12 bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius.Als Nächstes streichen Sie die Hefe von der YPG-Platte auf eine Platte mit Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, oder YPD, um einzelne Kolonien zu erhalten. Kultivieren Sie die Hefe 24 bis 48 Stunden bei 30 Grad Celsius auf der YPD-Platte. Beginnen Sie nach 24 bis 48 Stunden Wachstum auf festem YPD-Medium eine 25-Milliliter-YPD-Kultur unter Verwendung einer einzelnen Kolonie von der YPD-Platte.Züchten Sie diese Kultur über Nacht in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min, bis die Zellen einen OD600 von 4,0 bis 7,0 erreichen. Verwenden Sie am folgenden Tag eine geeignete Menge Zellen aus der YPD-Kultur, um eine 125-Milliliter-Kultur in Hefeextrakt-Pepton-Acetat, oder YPA, mit einem OD600 von 0,1 anzusetzen. Züchten Sie die Kultur in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min, bis der OD600 zwischen 1,3 und 1,5 liegt.Überführen Sie die Kultur in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1800×g in einer Tischzentrifuge, um die Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem halben Volumen steriler, autoklavierter, deionisierter Wasser. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie das Wasser.Suspendieren Sie die Zellen in einem 1X-Volumen an Sporulationsmedium. Um Zellen unterschiedlicher Genotypen vorzubereiten, werden Zellen aus aufgetauten Gefriervorräten in einer 96-Multiwell-Platte zunächst auf feste YPG-Medien übertragen. Sterilisieren Sie einen 96-Zinken-Frogger im Flamme und kühlen Sie ihn anschließend kurz auf einer Platte mit festem Medium ab, bevor Sie ihn mit den Hefe-Kolonien in Kontakt bringen.Züchten Sie die Hefe über Nacht bei 30 Grad Celsius. Überführen Sie am folgenden Tag die Zellen von YPG-Festmedium auf YPD- oder selektives Festmedium, abhängig vom Genotyp des Stammes. In dieser Demonstration wird YPD verwendet.Züchten Sie die Hefe bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien für jeden Stamm gebildet sind. Portionieren Sie 1,2 Milliliter flüssiges YPD-Medium in jedes Loch einer 96er-Tieflochplatte. Übertragen Sie die Zellen vom festen Medium in flüssiges Medium.Bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel von einer rechteckigen Petrischale und befestigen Sie den Deckel mit einem Stück Klebeband, um die Luftzirkulation minimal einzuschränken. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1800×g.Geben Sie das Medium ab und fügen Sie 500 Mikroliter YPA zu jedem Well hinzu. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen erneut. Bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel, der mit Klebeband fixiert wird.Züchten Sie die Zellen 15 Stunden lang in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min. Um eine ausreichende Belüftung für eine effiziente Sporulation zu gewährleisten, geben Sie in jedes Loch einer 96-Loch-Platte entweder eine sterile, feste Glasperle mit drei Millimeter Durchmesser oder einen sterilen magnetischen Rührstab mit fünf Millimeter Länge und zwei Millimeter Durchmesser. Falls alle Zellen denselben Genotyp aufweisen, portionieren Sie 500 Mikroliter Zellen inklusive Medium in jedes Loch der 96-Mehrfachplatte.Decken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel ab, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn die Zellen unterschiedliche Genotypen aufweisen, zentrifugieren Sie die Zellen in YPA bei 1800×g fünf Minuten lang und gießen Sie das Medium ab. Geben Sie 500 Mikroliter Sporulationsmedium in jede Vertiefung.Und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in dem Sporulationsmedium. Bedecken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn Glaskügelchen verwendet werden, stellen Sie die Proben in einen schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 220 U/min zur Sporulation.Wenn magnetische Rührstäbchen verwendet werden, stellen Sie die Proben auf eine Rührplatte innerhalb eines 30 Grad Celsius warmen Inkubators zur Sporulation. Die genaue Drehzahl für die magnetischen Rührstäbchen ist nicht sehr wichtig, solange sich alle Stäbchen kräftig bewegen und die Kultur belüftet wird. 36 Stunden später entnehmen Sie die Proben, um den Fortschritt der Sporulation zu überwachen.Entnehmen Sie sechs Mikroliter Zellen aus jeder sporulierenden Kultur und geben Sie sie zu 24 Mikrolitern Sporulationsmedium in einer 96-Well-Deckglasplatte hinzu. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang sedimentieren, bevor Sie sie mit einem invertierten Mikroskop untersuchen. Eine repräsentative Sporulation zweier unterschiedlicher Stämme ist in diesen Bildern von Zellen dargestellt, die mit einem 63X-Objektiv an einem invertierten Mikroskop visualisiert wurden.Lichtbrechende Tetraden, die durch die Pfeilspitzen markiert sind, sind in der Wildtyp-Kultur sichtbar. In der Kultur mit den spori­lations­unfähigen smk1-Löschmutanten hingegen nicht. Es wurden Vergleiche zwischen den Sporulationseffizienzen von Zellen angestellt, die in Mehr­fach­brunnenplatten gesporuliert wurden, und Zellen, die in größeren Volumina in Kolben gesporuliert wurden.Die Verwendung von Mehrwell-Platten erreichte nicht die hohe Effizienz, die üblicherweise bei der typischeren Methode der Sporulation in Kolben beobachtet wird. Die Sporulation in Mehrwell-Platten mit geeigneter Belüftung kann jedoch ausreichende Sporulationseffizienzen von über 50 % erreichen, wobei die besten Ergebnisse mit einem fünf Millimeter langen Rührstab erzielt wurden. Angesichts der hohen Kosten der kleinen Rührstäbe sind die mit Glasperlen erzielten Effizienzen jedoch vergleichbar.Obwohl sowohl 5 mm als auch 7 mm lange Rührstäbchen in die Vertiefung einer 96-Multiwellplatte passen, führte die Verwendung eines 7-mm-Rührstäbchens zu einer geringen Sporulationseffizienz. Das 7-mm-Rührstäbchen in einer Vertiefung neigt dazu, mit einem Rührstäbchen in einer benachbarten Vertiefung zu interagieren, wodurch verhindert wird, dass die Stäbchen ordnungsgemäß rühren und die Kultur ausreichend belüftet wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hefezellen effizient in flüssiger Kultur im 96-Loch-Format sporuliert werden können. Wenn der Vorgang einmal beherrscht ist, kann er bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Tagen abgeschlossen werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um verschiedene Mutantenstämme, Plasmide oder kleine Molekülinhibitoren auf ihre Wirkung auf Meiose und Sporulation zu untersuchen.Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik verwendet, um die Regulation des meiotischen Zellzyklus und die Kopplung von Zytokinese und Meiose bei der Sporulation in Saccharomyces cerevisiae zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

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Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

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Effiziente Sporulation von

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