Das Drosophila Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie die Drosophila-Augenantennen-Imaginalscheiben und Gehirne, die genetisch definierte fluoreszenzmarkierte Klone tragen, seziert und verarbeitet werden können, um Veränderungen der Genexpression und Zellinvasivität sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Die beschriebenen Verfahren können dazu beitragen, neue Einblicke in die Rolle von Genen und Epithelentwicklung, Homöostase oder Krankheit zu gewinnen und die Mechanismen zu entschlüsseln, die ihrer Konkurrenz, kompensatorischen Proliferation oder interklonalen Interaktion zugrunde liegen. Der Hauptvorteil der Studie besteht darin, dass wir eine ganze Reihe von Protokollen zur Verfügung stellen, die auf eine eingehende quantitative und qualitative Analyse der genetischen Mosaike der Drosophila zugeschnitten sind.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu mit dem Drosophila-Modell arbeiten, Schwierigkeiten, weil sie die Augen-Antennen-Imaginalscheibe nicht von der anderen Imaginalscheibe unterscheiden können. Um die Erkennung von Augenantennen-Imaginalscheiben mit fluoreszierend markierten Klonen im Larvenkörper zu erleichtern, wird empfohlen, die ersten Dissektionen unter einem Fluoreszenzmikroskop durchzuführen. Die Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker oder MARCM ermöglicht die Erzeugung genetisch definierter klonaler Pflaster in einem ansonsten phänotypischen Wildtyp-Kontext.

Ein FLP, das von einem augenlosen Promotor angetrieben wird, katalysiert die Rekombination zwischen zwei FRT-Elementen, die eine Stoppkassette flankieren, die mit einem gelben Gen markiert ist. Nach der DNA-Replikation katalysiert FLP den Austausch der Nicht-Schwesterchromatiden zwischen den homologen Chromosomen, wodurch Schwesterchromatiden entstehen. Einer trägt das Wildtyp-Allel und den Gal80-Repressor, der andere die Mutante.

Bei der Mitose trennen sich diese und produzieren zwei Tochterzellen, von denen eine eine homozygote Mutante und die andere ein Wildtyp ist. Der Verlust des Gal80-Repressors ermöglicht die GFP-Expression in der Mutante, während die Wildtyp-Zellen GFP-negativ bleiben. Zu Beginn des Experiments ernten Sie Mosaiklarven, indem Sie PBS in die Fliegenflasche spritzen, um die Oberfläche des Futters zu bedecken.

Dann die oberste Schicht mit einem Spachtel aufweichen und den mit den Larven gefüllten Speisebrei in eine Petrischale gießen. Pflücken Sie die Larven vorsichtig und geben Sie sie in eine mit PBS gefüllte Embryoschale. Sammeln Sie mindestens 20 Larven für die Immunfärbung und 80 Larven für die Quantifizierung der Tumorinvasivität.

Waschen Sie die Larven mit PBS, um alle Speisereste zu entfernen. Mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop bei 8:16-facher Vergrößerung werden alle Leopardenlarven identifiziert und verworfen, d. h. diejenigen, die zufällige GFP-positive Flecken im ganzen Körper aufweisen. Die Schale mit den restlichen Larven in PBS bis zur Sektion auf Eis legen.

Um die Augen-Antennen-Imaginalscheibe unter dem Stereomikroskop zu präparieren, verwenden Sie eine Pinzette und greifen Sie die Larve vorsichtig in etwa 2/3 der Körperlänge hinter dem Kopf. Greifen Sie mit der zweiten Pinzette die Mundhaken der Larve und ziehen Sie sie vom Körper weg. Mit einer Pinzette werden die Mundhaken von der darüber liegenden Nagelhaut und Fremdgewebe wie den Speicheldrüsen und dem Fettkörper gelöst.

Alternativ können Sie zur Vorbereitung des Auge-Antennen-Bandscheiben-Hirnkomplexes unter Beibehaltung des ventralen Nervenstrangs eine Pinzette verwenden, um eine Larve in der Mitte des Körpers zu schneiden. Entsorgen Sie die hintere Hälfte. Halten Sie die vordere Hälfte des Larvenkörpers mit den Spitzen einer Pinzette fest, drehen Sie dann die Larve auf links, indem Sie die Mundhaken mit der Spitze des zweiten Paares nach innen schieben und die Nagelhaut mit dem ersten Pinzettenpaar darüber rollen.

Entferne vorsichtig sämtliches Fremdgewebe, einschließlich des Darms, des Fettkörpers und der Speicheldrüsen. Ziehen Sie die Mundhaken vorsichtig von der Nagelhaut weg. Lösen Sie den Auge-Antennen-Bandscheiben-Hirn-Komplex, der an den Mundhaken befestigt ist, indem Sie die axonalen Vorsprünge durchtrennen, die sich vom ventralen Nervenstrang zu den Muskeln und der Epidermis erstrecken.

Um das Gewebe zu übertragen, beschichten Sie zunächst eine P20-Mikropipettenspitze, indem Sie die verbleibenden Körperkörper mehrmals auf und ab pipettieren und dann mit derselben Spitze das präparierte Gewebe übertragen. Um größere Augen-Antennen-Bandscheiben-Hirnkomplexe zu übertragen, schneiden Sie die P20-Spitze vor, um die Öffnung zu vergrößern. Fixieren Sie die Proben in 400 Mikrolitern 4%PFA-Fixiermittel für 25 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie nutieren.

Entfernen Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Proben dreimal 10 Minuten lang mit PBST unter Nutation. Ersetzen Sie anschließend den PBST durch 500 Mikroliter DAPI-Färbelösung und nutieren Sie ihn 15 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie das Tuch einmal für 10 Minuten mit PBST.

Um die Dissektion abzuschließen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Gewebe zurück in eine PBS-gefüllte Glasschale zu übertragen. Mit zwei Pinzettenpaaren wird das Gehirn, das zur Quantifizierung der Invasivität verwendet werden soll, von den Augen-Antennen-Scheiben getrennt, indem die optischen Stiele durchtrennt werden. Befreien Sie die Augenantennenscheiben, indem Sie sie von den Mundhaken abschneiden.

Geben Sie einen Tropfen Einbettmittel auf einen abduktiven Objektträger und verteilen Sie die Flüssigkeit mit einer Pinzette in einer dünnen Schicht. Um die Invasivität zu quantifizieren, platzieren Sie mindestens 80 fixierte intakte Gehirne für jeden Genotyp auf einem einzigen Objektträger. Richten Sie das Gewebe auf und positionieren Sie es wie gewünscht.

Berühren Sie vorsichtig eine Kante eines Deckglases mit dem Medium und senken Sie es langsam mit Hilfe einer Pinzette ab, um Blasenbildung zu vermeiden. Verwenden Sie ein Labortuch, um überschüssiges Einbettmedium an den Rändern aufzusaugen. Das Gewebe kann nun mittels konfokaler Bildgebung untersucht werden.

Bitten Sie eine neutrale Partei, die Folien zu anonymisieren, damit die Bewertung unvoreingenommen ist. Und lassen Sie die Folien unabhängig voneinander von mindestens zwei Forschern bewerten. Geben Sie Genotypen erst nach Abschluss der Bewertung weiter.

Beurteilen Sie den Grad der Malignität unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop, das mit einem GFP-Filterset ausgestattet ist. Die Verwendung eines Markers kennzeichnet Gehirne, die bereits angesehen wurden, um Doppelzählungen zu vermeiden. Fluoreszierende konfokale Bilder zeigen Gehirne, die von Larven seziert wurden, die bösartige RAS V12-Scribble-mutierte GFP-markierte klonale Tumoren trugen, die mit DAPI gefärbt wurden.

Die Panels repräsentieren die vier verschiedenen Grade der Tumorinvasivität. Die unverzerrte Quantifizierung zeigte, dass die Hemmung des JNK-Signalwegs und der RAS V12-gekritzelten One-Klone die Tumorinvasivität unterdrückten. In Kontroll-Augenantennenscheiben markiert der JNK-sensitive TRE-DsRED-Reporter nur einen schmalen Streifen von Zellen, der von der Antenne zum Augenteil verläuft.

Im Gegensatz dazu war die Aktivität von TRE-DsRED bei den GFP-positiven malignen klonalen Tumoren deutlich erhöht. Am 8. Tag überwucherten die Tumorzellen die Augen-Antennen-Bandscheiben und breiteten sich auf den ventralen Nervenstrang aus. Auch die eindringenden Tumorzellen zeigten im Vergleich zum umgebenden Gewebe eine erhöhte JNK-Aktivierung.

Während die Blockierung von JNK die TRE-DsRED-Aktivität in den Tumorklonen deutlich reduzierte, zeigte eine Erhöhung der Laserintensität eine Verbesserung der Epithelzellen, die an die Klone benachbart waren. Zusätzlich zeigte ein Hämolektin-delta-DsRED-Reporter, dass sich im Gegensatz zu einigen Hämozytenclustern, die in den Vertiefungen des Kontrollaugenantennentelepithels gefunden wurden, Hämozyten im Augenantennen- und Hirngewebe ansammelten, das aus bösartigen Tumoren bestand. Nach Hemmung von JNK nahm die Anzahl der assoziierten Immunzellen dramatisch ab.

Die erhöhte Tumorinvasivität, JNK-Aktivität und Hämozyteninfiltration gingen mit einer signifikanten Hochregulation von MMP1 mNRA einher, die durch QRTPCR anhand von Gesamt-RNA bestimmt wurde, die aus präparierten Mosaik-Augen-Antennen-Scheiben isoliert wurde. Einmal gemeistert, können über 60 Augenscheibenpaare und Gehirne innerhalb von 30 Minuten präpariert werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine ausreichende Anzahl von Larven des gewünschten Genotyps zu erzeugen.

Seien Sie beim Präparieren schnell, aber präzise, um Proben, die für die RNA-Isolierung bestimmt sind, RNS-frei zu halten. Nach dem Dissektionsverfahren kann der Western Blot als Alternative zur Immunfärbung verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinexpression zwischen verschiedenen Genotypen zu beurteilen. Die Erstellung genetischer Mosaike und deren Analyse mit den beschriebenen Verfahren ermöglicht die Erforschung von ansonsten letalen Mutationen und von Mechanismen der onkogenen Korporation und Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mosaikgewebe der Augen-Antennen-Scheibe und des Gehirns von Larven des dritten Stadiums seziert und wie man sie für die Immunfärbung, Visualisierung der transgenen und Portaktivität verarbeitet, RNA-Extraktion und die Quantifizierung der Invasivität.

Denken Sie daran, dass sowohl PFA als auch Phenol-Chloroform und DAPI hochgiftig sind und dass bei der Arbeit mit diesen Mitteln immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen und -kleidung getroffen werden sollten.