Name: Das Drosophila Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Augen-Antennen-Imaginalscheiben und -Gehirnen mit fluoreszenzmarkierten Klonen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken dem Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Brückner und Istvan Ando für die Fliegenstöcke und Antikörper. Wir danken Marek Jindra und Colin Donohoe für ihre Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde gefördert durch den Sofja Kovalevskaja Award to M.U. der Alexander von Humboldt-Stiftung und das DFG-Projekt UH243/1-1 to M.U. der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

HINWEIS: Diese Arbeit nutzt die eyFLP1; act&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP; FRT82B, wannen Gal80 MARCM 82B Grüne Tester Linie 11. Quer durch die MARCM 82B Grüne Tester Jungfrauen zu Männern von Stämmen wie w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut Genotyp nachgeben Nachkommen , in der mitotischen Rekombination zwischen den rechten Arm der 3. homologen Chromosomen auftreten. Auf diese Weise homozygoten mutanten Klone zur Gen - c zur FRT82B Stelle distal angeordnet wird innerhalb des EAD und Gehirn Neuroepithel erzeugt werden. Diese Klone werden exprimieren GFP - Transgen ein und dsRNA für die Gen - b (Abbildung 1A). Verschiedene eyFLP-MARCM Tester Linien für die Rekombination auf dem X, 2L, 2R, 3L und 3R wurden eingerichtet und sind in der Fliege-Community zur Verfügung. 1. Fly Handling, Kreuze und Staging <ol><li> Erweitern Sie den entsprechenden MARCM Tester Lager bei Raumtemperatur durch mehrere bo bevölttles zugleich. Drehen Sie die Erwachsenen in frische Flaschen alle 2-3 Tage, so dass genügend Jungfrauen für nachfolgende Kreuze gesammelt werden. HINWEIS: Bei der Jungfrauen sammeln, vermeiden eine längere Exposition zu CO 2 als das weibliche Fruchtbarkeit beeinträchtigt. </li><li> Je nach Umfang des Experiments eingerichtet fly Kreuze in Fläschchen mit mindestens 10 MARCM Tester Jungfrauen und 4 Rüden (zB für die Abbildung von fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung) oder in Flaschen mit mindestens 30 Jungfrauen und 10 Männer (zB für RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität). </li><li> Raise Nachkommen bei 25 ° C unter einem langen Tag 16 Stunden / 8 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus. Flip Eltern in neue Fläschchen / Flaschen alle 24 Stunden, um reproduzierbare Durchführung von Larven erleichtern und Übervölkerung zu verhindern. HINWEIS: Beim Start am Tag 6 nach der Eiablage (AEL), der späten dritten Larvenstadium Kontrollarven Stop Fütterung, beginnen wandern und Puparium-Bildung ein. Im Gegensatz dazu kann der Beginn des Larven-pupal Übergang dEverlegt oder nicht existent in Larven mit EAD hyperplastische oder maligne klonale Tumoren tragen. </li></ol> 2. Sammeln Dritte Larvenstadium <ol><li> Für die Immunfärbung, sammeln etwa 20 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden einer Pinzette vorsichtig Larven zu holen aus dem Fläschchen oder Flasche und übertragen diese in einen Embryo Glasschale gefüllt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). <ol><li> Für die RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität, sammeln mindestens 80 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden Sie eine Spritzflasche PBS in eine Fliege Flasche mit Larven zu spritzen, bis die Oberfläche bedeckt ist. </li><li> Erweichen Sie die oberen Schichten der Nahrung mit einem Spatel und gießen Sie die Lebensmittel Maische Larven in eine Petrischale enthält. Mit einer Pinzette, Pick sanft Larven und übertragen diese in einen Embryo Glasschale mit PBS gefüllt. </li></ol></li><li> Waschen Sie Larven mit PBS until alle Speisereste entfernt. Überprüfen Sie die Larven unter dem Fluoreszenzstereomikroskop mit 8 bis 16 - facher Vergrößerung , alle &quot;Leopard - Larven&quot; zu verwerfen, die während des Larvenkörper (2A, 2B und siehe Diskussion Sektion) random GFP-positive Flecken führen. HINWEIS: Für die RNA-Isolierung umfassen einen vorletzten Waschschritt in 70% EtOH für 1 min. </li><li> Die Schale enthält ausgewählte Larven in PBS auf Eis, bis Dissektion. Prozess Larven innerhalb von 30 min negativen Auswirkungen von Kälte und Hunger zu vermeiden. </li></ol> 3. Dissection von Larvae <ol><li> Um den EAD unter einem Stereomikroskop sezieren, ein Paar Zangen verwenden, um sanft den mittleren Teil der Larve gegen die Glasschale unten drücken. Mit der zweiten Zange, greifen die Larven Mundhaken und ziehen Sie sie vom Körper weg (Abbildung 2C). HINWEIS: Die Zugkraft ist oft ausreichend, um die Optik Stiele Anschluss des EAD pai zu brechenr den Hirnlappen. Wenn das Gehirn oder seine Teile zu EAD und ihre Anwesenheit verbleiben, ist nicht für weitere Anwendungen gewünscht, schneiden Sie die Optik Stiel mit Hilfe der beiden Paare von Zangen. Für invasive Tumoren (zB ras V12 scrib 1) die Verbindung zwischen EAD und den Hirnlappen zunehmend mit der Zeit durch überwuchert und die Migration klonalen Zellen verdeckt wird. <ol><li> Um den EAD / Gehirn - Komplex mit einem intakten Bauchmark (VNC) (2D) herzustellen, verwenden Pinzette eine Larve in der Mitte des Körpers zu schneiden. Entsorgen Sie die hintere Hälfte. </li><li> Halten Sie die vordere Hälfte des Larvenkörpers zwischen den Spitzen einer Zange, drehen Sie die Larve von innen nach außen, indem sie mit der Spitze der zweiten Zange in den Mund Haken schieben und durch die Kutikula über sie mit dem ersten Zangenpaar rollen. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie alle Fremdgewebe (zB Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm) , während das EAD Paar verlassen oderder EAD / Gehirn-Komplex mit den Mundhaken verbunden. Entwirren die Mundhaken von der darüber liegenden Kutikula. Free the VNC durch die axonalen Projektionen Trennen erstrecken Körpermuskulatur und Epidermis (1B, 2C, 2D). HINWEIS: Die Mundhaken zur sicheren Handhabung von Gewebe mit einer Pinzette ermöglichen und effizienter Versenkung und einfache Erkennung von Gewebe während des Waschens zu erleichtern. Dissected EAD Änderung Morphologie relativ schnell, wenn in PBS nicht fixierten gehalten. Begrenzen Sie die Dissektion Zeit auf 20-30 min. </li><li> Um das Gewebe zu übertragen, Mantel ein P20 Mikropipettenspitze durch die restliche Körper Pipettieren Gerippen mehrmals auf und ab. Um die größeren EAD / Hirn-Komplexe übertragen, schneiden Sie die P20 Mikropipette Spitze mit einer Schere. HINWEIS: Das Beschichtungsverfahren ist entscheidend Klebe- und den Verlust von sezierten Gewebe während der Übertragung zu verhindern. Die Verwendung einer P20 Mikropipette minimiert die Übertragung von PBS in Fixierungslösung, unerwünschte Verdünnung zu begrenzen. <ol><li> Für die Immunfärbung, übertragendie seziert EAD in ein 0,5-ml-Röhrchen mit 400 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PFA für größere EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität. ACHTUNG: PFA ist hochgiftig. Schutzhandschuhe tragen und Kleidung. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäute. </li><li> Für die RNA-Isolierung übertragen die seziert EAD in eine neue Glasschale mit kaltem PBS gefüllt. Verwenden einer Pinzette zu reinigen EAD aus den Ring und Lymphdrüsen, Probe Verunreinigungen zu minimieren. </li><li> Nehmen Sie den EAD aus den Mundhaken durch die Verbindung zwischen den Antennenscheiben Trennen und Mundhaken mit einer Pinzette (Abbildung 2E). Um RNA-Abbau und die Genexpression Artefakte zu vermeiden, begrenzen die Dissektion Zeit auf 30 min. Fahren Sie mit Schritt 7 fort. HINWEIS: Ein erfahrener Forscher kann etwa 60 Larven in 30 min ohne Zeit für die Larven Sammlung und Waschen benötigt sezieren. Die Gesamt-RNA-Ausbeuten hängen von der EAD Größe, die unter Genotypen und developmenta variierenl Stufen. Dissection von 80-100 Steuer EAD Paare von späten dritten Larvenstadium sollte 5-8 &amp; mgr; g Gesamt-RNA erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Befestigung, Immunostaining und Montage <ol><li> Fix Proben in PFA Fixativ für 25 min, während bei Raumtemperatur Taumel. Die Fixierungszeit ohne Veränderung Gewebemorphologie und die Antigenität von Proteinen bis zu 60 min verlängert werden. </li><li> Entfernen Sie die Fixierlösung und Waschproben mit PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) dreimal für 10 min ein Nutator verwenden. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen von PBST für jeden Waschschritt (400 &amp; mgr; l / 0,5 ml Röhrchen). HINWEIS: Fest EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität nicht Immunofärbung erfordern. GFP-Signal bleibt gut sichtbar nach der Fixierung. Gehen 4.4 für die endgültige Präparation zu treten. <ol><li> Für die Immunfärbung, Block Gewebe in 200 ul einer Blockierungslösung (PBST mit 0,3% BSA) für 20 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. <ol><li> Inkubieren mit primary Antikörper bei 4 ° C über Nacht in 100 ul einer Blockierungslösung verdünnt unter leichtem Schütteln. Wenden Sie sich an primären Antikörper Datenblatt oder der veröffentlichten Literatur für empfohlene Antikörperverdünnung. HINWEIS: Die primäre Antikörperverdünnung kann optimiert werden müssen. </li><li> Nach fünf 10 min Waschen in PBST, Fleckengewebe mit den fluoreszierenden sekundären Antikörpern verdünnte Lösung bei der Blockierung während sanft für 2 Stunden bei Raumtemperatur schütteln oder über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Wash Proben dreimal 10 min in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Ersetzen PBST mit 500 ul DAPI-Färbelösung. F-Actin beschriften, fügen phalloidin an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert mit DAPI-Färbelösung. Nach 15 min im Dunkeln Nutation, wasche Gewebe einmal für 10 min mit PBST. HINWEIS: F-Aktin Kennzeichnung unabhängig durchgeführt von DAPI-Färbung werden kann. </li><li> Für die endgültige Präparation Schritt übertragen Gewebe zurück in eine PBS-gefüllten Glasschale mit einem 1 ml pi mitPette. Mit den beiden Zangen die Mundhaken abschneiden. <ol><li> Trennen Sie die Gehirne, die zur Quantifizierung der Invasivität von der EAD verwendet wird, durch die Optik Stiel als bewachsen EAD schneiden könnte die Analyse erschweren. </li></ol></li><li> Geben Sie einen Tropfen des Montagemedium (15 &amp; mgr; l für eine 22 mm x 22 mm Deckglas) auf einer objektiven Folie. Mit Hilfe der Zangenspitzen, zu verteilen, das Medium in eine dünne Schicht. Übertragen EAD, Gehirn oder die EAD / Gehirn-Komplexe in die Montagemedium mit einer P20 Mikropipette. </li><li> Verwenden Sie die Zangenspitzen oder ein Wolframstab Gewebe zu verteilen und die VNC auf der Folie zu begradigen. </li><li> Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, während, erste Berührung einer Kante einer Deck zur Montagemedium und dann langsam tiefer auf die Montagemedium mit Hilfe einer Pinzette Montage. Verwenden Sie kleine Stücke von Filterpapier oder Gewebe wischen Überschüssiges Montagemedium rund um die Deck Kanten zu absorbieren. HINWEIS: DABCO / Poly (Vinylalkohol) 4-88 Eindeckmediums verhärtetbei 4 ° C innerhalb einer Stunde. Folien können für Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 5. Die konfokale Imaging <ol><li> Erwerben Sie einzelne konfokale Schnitte und Stapeln ein konfokales Mikroskop mit 20X, 40X und 60X Öl Ziele ausgestattet werden. </li><li> Verhindern Pixelsättigung. Verwenden Sie gleiche Bildaufnahmeparameter einschließlich Bildauflösung, Lasereingangsleistung, Gain, Offset, Bildmittelung, einer Schrittweite in einer z-Serie und halten Sie diese Einstellungen für alle Genotypen für den Vergleich von Pixelintensitäten zwischen verschiedenen Genotypen 21,22 zu ermöglichen. HINWEIS: Für die Visualisierung von EAD / Gehirn-Komplex, maximale Projektionen erzeugen und Stich jeweiligen Nachbar Bilder. Für die endgültige Bildvorbereitung, verwenden Post Bildverarbeitungssoftware für Tafelaufbau und Helligkeit und Kontrast einzustellen. </li></ol> 6. Quantifizierung der Tumorinvasivität <ol><li> Definieren Sie ein Punktesystem, das die verschiedenen Ebenen der Tumor invasivenes charakterisierens das räumliche Muster der Invasion und die Menge an GFP-positiven Zellen unter Berücksichtigung in das Gehirn und VNC verbreiten. Bereiten Bewertungsbögen zur Dokumentation (3A). </li><li> Berg mindestens 80 intakten Gehirn für jeden Genotyp auf einer Folie unter Verwendung von 40 &amp; mgr; l des Eindeckmediums pro 24 mm x 50 mm Deckglas befestigt. <ol><li> Damit unvoreingenommene Scoring, fragen Sie eine neutrale Partei, die die Folien zu anonymisieren, so dass die Scoring-Verfahren unvoreingenommen ist. Bewerten anonymisierten Dias durch zwei voneinander unabhängige Labor Mitglieder. Disc Genotypen erst nach dem Zählen fertig ist. </li></ol></li><li> Werten Sie den Grad der Bösartigkeit von einem blinden Scoring-berittener Gehirne unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem GFP-Filtersatz ausgestattet. Verwenden Sie eine Markierung Gehirne zu kennzeichnen , die bereits angezeigt wurden Doppelzählungen (3B) zu vermeiden. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Gehirne in jede der definierten invasive Kategorien pro Genotyp fallen. Bestimmen Sie die statistischen significance mit einem Chi-Quadrat - Test (3C). </li></ol> 7. RNA-Isolierung, DNase Behandlung und Qualitätsprüfung HINWEIS: Alle Reagenzien (Lösungen Kunststoff, Kunststoff) in den folgenden Schritten verwendet werden, sollten frei von RNase-Aktivität sein. Immer Handschuhe tragen und eine chemische Haube für die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln verwendet werden. <ol><li> Übertragen Sie die saubere EAD mit einer beschichteten P20 Mikropipettenspitze in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Lassen Sie Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens vorsichtig entfernen PBS und ersetzen Sie es mit 100 &amp; mgr; l RNA Lysereagenz (ausreichend für bis zu 140 EAD). </li><li> Lyse Gewebe durch Verwirbelung. An dieser Stelle können die Proben tiefgefroren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C gelagert oder direkt mit einem Standard-RNA-Isolierung Protokoll verarbeitet. HINWEIS: Die Proben von ähnlichen Genotypen aus mehreren Dissektion Runden kann einmal in RNA Lysereagenzes gepoolt werden. </li><li> Füllen Sie das Probenvolumen auf 0,9 ml mit RNA Lysereagenzes. In 0,2 ml Chloroform und mischen Proben vigoronuierlich für 15-20 Sek. </li><li> Nach 2 bis 3 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugiert werden die Proben bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen farblos obere wässrige Phase, die RNA in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören. Halten Sie sich von der Inter weg, wie es Proteine ​​und genomische DNA enthält. HINWEIS: Die rückgewonnene Volumen sollte zur Homogenisierung verwendet etwa 60% des Volumens der RNA Lysereagenz sein. </li><li> Auszufällen die RNA durch Zugabe von 0,5 ml Isopropylalkohol. Vortex und Inkubation Proben bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Zentrifugiere die Proben bei 10.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet einmal mit 600 &amp; mgr; l 75% Ethanol. Nach einer kurzen Wirbel und Zentrifugation (10.000 × g für 7 min bei 4 ° C) alle Ethanol verwerfen und lassen Sie wischen das RNA-Pellet lufttrocken für 5-10 min das offene Rohr mit einem sauberen Tuch platzieren. HINWEIS: Das RNA-Pellet könnte als winziger opak / weiß st sichtbar seinam Boden des Röhrchens oder unsichtbar reif. Die restlichen Ethanol Tropfen können vorsichtig mit P10 Mikropipettenspitze entfernt werden. </li><li> Löse RNA in 50 ul DEPC-behandeltem Wasser durch Vortexen oder vorbei Lösung einige Male durch eine Pipettenspitze. </li><li> Um eine Kontamination mit genomischer DNA minimieren, Behandlung Gesamt-RNA mit DNase durch Zugabe von 50 ul einer Mischung, enthaltend 1 ul DNase (2 U / ul) und 10 ul 10x-Puffer DNase in DEPC-behandeltem Wasser. Vortex und Spin-down. </li><li> Inkubieren Proben bei 37 ° C in einem Wasserbad oder einem Heizblock für 30 bis 40 min. Nach der Inkubation wurden 100 ul DEPC-behandeltem Wasser in jeder Probe hinzu. </li><li> Um die enzymatische Aktivität und saubere RNA von DNase zu inaktivieren, 200 &amp; mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) -Lösung, vortex für 1 min und zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 7 min bei 4 ° C. </li><li> Sorgfältig Transfer-RNA in ein frisches Röhrchen die obere wässrige Phase enthält. In gleichen Volumen (200 ul)Chloroform, mischen und den Zentrifugationsschritt von oben wiederholen. </li><li> Sammeln sorgfältig die obere Phase und auszufällen RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 , hergestellt in DEPC H 2 O und 2,5 Volumen 100% Ethanol. Gut mischen durch Vortexen. HINWEIS: Durch Hinzufügen 0,5 ul Glykogen (20 ug / ul) zu einer Fällung Mischung hilft, die RNA-Pellet zu visualisieren. RNA-Verlust, verwenden silikonisierte, Low-Bindung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu minimieren. </li><li> Auszufällen RNA bei -20 ° C für mindestens 1 Std. HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht durchgeführt werden. Proben können auch bei -80 ° C platziert. </li><li> Pellet RNA durch Zentrifugation bei 10.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Waschen und Trocknen des Pellets nach der Beschreibung in 7.9. </li><li> Man löst RNA in 10-15 ul DEPC-behandeltem Wasser. Store RNA bei -80 ° C. </li><li> Bestimmen Menge und Reinheit der RNA wurde durch OD bei 230 nm gemessen wird, 260 nm und 280 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen RNA concentration durch die Konvention, dass 1 OD bei 260 nm Anwendung 40 ug / ml RNA entspricht. HINWEIS: Die A 260/280 Verhältnis von &quot;reinen&quot; RNA ist gleich 2,0 , während ein A 260/230 - Verhältnis im Bereich von 2,0 bis 2,2 liegen. RNA - Proben mit einem A 260/280 - Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 sind geeignet für Downstream - Anwendungen wie cDNA - Synthese. Für die Herstellung von mRNA-seq Bibliotheken die Qualität und Quantität von RNA sollte unter Verwendung eines automatisierten Elektrophorese-System überprüft werden. Das 28S / 18S-Verhältnis sollte über 1,8 sein. </li></ol>

<ol><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+How+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPagliarini%2C+RA+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22">Science (New York, NY)</a>. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).</li>
<li>Turkel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BTB-zinc+finger+transcription+factor+abrupt+acts+as+an+epithelial+oncogene+in+Drosophila+melanogaster+through+maintaining+a+progenitor-like+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+Diverts+a+Host+TNF+Tumor+Suppressor+Activity+into+Tumor+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Drosophila%2C+RhoGEF2+cooperates+with+activated+Ras+in+tumorigenesis+through+a+pathway+involving+Rho1-Rok-Myosin-II+and+JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling.</a> Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).</li>
<li>Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sds22%2FPP1+links+epithelial+integrity+and+tumor+suppression+via+regulation+of+myosin+II+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling.</a> Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Drosophila+Tumors+Interrupt+Insulin+Signaling+to+Induce+Cachexia-like+Wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting.</a> Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127 (4), 851-860 (2000).</li>
<li>Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+of+the+eyeless+gene+of+Drosophila+to+the+Small+eye+gene+in+mice+and+Aniridia+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans.</a> Science. 265 (5173), 785-789 (1994).</li>
<li>Külshammer, E., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cross-linker+Filamin%2FCheerio+mediates+tumor+malignancy+downstream+of+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).</li>
<li>Külshammer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+Drosophila+transcription+factors+Ets21c%2C+Fos+and+Ftz-F1+drives+JNK-mediated+tumor+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).</li>
<li>Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+immune+response+of+blood+cells+to+tumors+and+tissue+damage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).</li>
<li>Chatterjee, N., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+%CE%A6C31+based+reporter+system+for+measuring+AP-1+and+Nrf2+signaling+in+Drosophila+and+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture.</a> PloS One. 7 (4), e34063(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Andersen, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TNF+receptor+Grindelwald+couples+loss+of+cell+polarity+and+neoplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth.</a> Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).</li>
<li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+body+and+organ+size+in+Drosophila%3A+recent+advances+and+outstanding+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems.</a> Front Endocrinol. 3 (49), (2012).</li>
<li>French, V., Feast, M., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+size+and+cell+size+in+Drosophila%3A+the+developmental+response+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature.</a> J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).</li>
<li>Ashburner, M., Bonner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+gene+activity+in+drosophila+by+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of gene activity in drosophila by heat shock.</a> Cell. 17 (2), 241-254 (1979).</li>
<li>Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effects+of+rearing+temperature+and+oxygen+on+the+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Biochem+Zool%22%5BJournal%5D)">Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster.</a> Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li>
<li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li>
<li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Die Techniken der genetischen Mosaiken in Drosophila zu erzeugen , gehören zu den anspruchsvollsten Werkzeuge für die Analyse und die Genfunktion 33 zu manipulieren. Das eyFLP-MARCM System leistungsfähig und robust erwiesen , da sie die Induktion von visuell markiert, genetisch definierte Klone in einer räumlich beschränkten Weise ermöglicht, also in Geweben , in denen die augenlose Enhancer aktiv 9,18 ist. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere genetische Läsionen in d...

Krebs stellt eine der genetisch heterogene Gruppe von Krankheiten, deren Häufigkeit und Sterblichkeit dramatisch zunimmt, insbesondere bei älteren Menschen weltweit. Krebs stammt klonal aus einem Tumor-initiierende Zelle, die inhärente Tumorsuppressor Mechanismen entweicht und teilt außer Kontrolle. Die allmähliche Ansammlung von genetischen Läsionen, die kooperativ Wachstum, die Vermehrung und Beweglichkeit fördern, während der Tod und die Differenzierung Hemmung verwandelt die anfängliche gutartige Wucherung in eine hochmaligne, metastasiertem und tödlichen Tumor. Es hat sich gezeigt, dass zusätzlich zu genetischen Veränderungen, die Tumorprogression Veränderungen im umgebenden Stroma und Übersprechen zwischen den Tumor und mehrere Zelltypen (beispielsweise Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) in seiner Mikroumgebung erfordert. die molekularen Prinzipien zugrunde liegenden malignen Transformation einschließlich Tumor-Stroma-Interaktionen zu verstehen, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung von prevention und frühen Screening-Strategien, sowie neue und wirksame Behandlungen von Krebsmetastasen und Medikamentenresistenz zu bekämpfen. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein attraktives System für die Krebsforschung geworden 1-4 seiner schnellen Generationszeit wegen bemerkenswerte Erhaltung der Knoten zwischen Fliegen und Menschen, begrenzte genetische Redundanz und Fülle von fortgeschrittenen genetischen Werkzeugen , Signalisierung , die Manipulation von fast jedem Gen erleichtern ein temporär und räumlich beschränkten Weise. Genetisch definierte Tumoren unterschiedlicher Malignität reproduzierbar in Drosophila konstruiert werden durch Verstärkungs- und loss-of-function Mutationen in einer Untergruppe von Vorläufern in einem ansonsten Wildtyp - Gewebe unter Verwendung der MARCM Technik 5 einzuführen. Das MARCM Werkzeug kombiniert FLP / FRT (FLP - Rekombinase / FLP Recognition Target) -vermittelten mitotische Rekombination 6 mit FLP-out 7 und Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 ZielgenExpressionssysteme 9. Mit dieser Methode Expression jedes UAS-basierten Transgen, einschließlich Onkogen oder fluoreszierendes Protein cDNAs oder invertierte DNA-Wiederholungen für dsRNA-induced gene silencing, wird auf einen Klon von Zellen beschränkt werden, die einen bestimmten genetischen Locus und einen Gal4 Repressor aufgrund Rekombination verloren (1A). Geklonte Patches mit grün fluoreszierenden markiert (GFP) oder rot fluoreszierende Proteine (zB RFP, DsRed, mCherry) leicht während der gesamten Entwicklung, isoliert und analysiert verfolgt werden. Wichtig ist, dass ihr Verhalten direkt zum benachbarten Wildtyp-Gewebe verglichen werden. So relevante Fragen an die Zelle autonomen und nicht autonomen Auswirkungen der genetischen Läsionen können bequem untersucht werden. Ähnlich wie bei Säugetieren, nur Klone , bei denen mehrere onkogene Läsionen in Drosophila maligne kombiniert werden und die wichtigsten Merkmale von Säugetierkrebs rekapitulieren. Sie overproliferate, entziehen Apoptose induzieren Entzündung, unsterblich geworden und invasive und tötete schließlich den Host - 10-17. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung genetisch definierten klonale Tumoren im Auge / antennal und Hirngewebe von Drosophila - Larven der MARCM Technik. Das Verfahren beruht auf einem MARCM Tester Lager, das die Hefe FLP - Rekombinase unter der Kontrolle des eyeless Enhancer (eyFLP) 18,19 zum Ausdruck bringt. Auf diese Weise GFP-markierten Klone werden erzeugt sowohl in peripodial und Epithel des EAD und dem Neuroepithel des Gehirns gesamten embryonalen und Larvenstadien (1A, B und Referenz 20). Die Klone können leicht bis zum Erwachsenenalter verfolgt werden, wie der EAD entwickelt sich zum erwachsenen Auge, Antenne und Kopfkapsel während der neuroepithelium Aufstieg zu Neuroblasten gibt, die differenzierte Optik lobe Neuronen erzeugen. Zur Erleichterung der umfangreiche molekulare, funktionelle und phänotypische Charakterisierung des Mosaiks Gewebe, wir deSchreiber ein Protokoll für die Präparation des EAD und Gehirn von der dritten Larvenstadium und beschreiben, wie sie für drei verschiedene Anwendungen zu verarbeiten: (i) Nachweis von transgenen fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung, (ii) die Quantifizierung der Tumor Invasivität und (iii) Analyse Veränderungen der Genexpression eine quantitative Echtzeit - PCR (qRT-PCR) oder ein Hochdurchsatz - Sequenzierung mRNA (mRNA-seq) (1C) verwendet wird . Die Immunofärbung Protokoll kann jedes Protein von Interesse mit einem spezifischen Antikörper zu visualisieren verwendet werden. Transgene fluoreszierende Transkriptions Reporter ermöglicht eine bequeme und präzise räumlich-zeitliche Informationen über die Aktivität eines bestimmten Signalwegs. Zell-Abstammungslinie spezifischen Reportern, andererseits widerspiegeln qualitative und quantitative Veränderungen in Zellpopulationen im mosaic Gewebe und unter Tumoren von unterschiedlichen Genotypen. Die Quantifizierung von invasiven Verhalten erleichtert den Vergleich von Tumor Malignität zwischen Genotyps. Schließlich ist das Protokoll beschreibt, Erfassung und Verarbeitung von Mosaik EAD für die RNA-Isolierung eignet sich sowohl für kleine und große Downstream-Anwendungen wie Reverse Transkription, gefolgt von qRT-PCR und genomweite mRNA-seq sind. Die qualitativen und quantitativen Daten aus diesen Tests gewonnenen Ergebnisse liefern neue Einblicke in das soziale Verhalten von klonalen Tumoren. Außerdem produzieren sie eine solide Grundlage für funktionelle Untersuchungen über die Rolle einzelner Gene, genetische Netzwerke und Tumor-Mikroumgebung in verschiedenen Phasen und Aspekte der Tumorentstehung.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&uuml; RZM&UUML; hle Brecht, Eggenstein, Deutschland</td><td>00262-0500</td><td>Fliegenfutter Rezept: 20 L Fliegenfutter mit 160 g Agar, 360 g Hefe, 200 g Sojamehl, 1,6 kg gelbem Maismehl, 1,2 l Malzextrakt, 300 ml hellem Maissirup, 130 ml Propionsäure und 200 ml 15 % Nipagin zubereiten. Fliegenfutter sollte 1 Stunde lang bei 85&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Maissirup</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Deutschland</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Maismehl</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Deutschland</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Deutschland</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Sojamehl</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Deutschland</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Hefe</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Deutschland</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-4-benzoat/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>H5501</td><td>Bereiten Sie eine 15%ige Stammlösung mit 70% EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila Fliegenfutterfläschchen</td><td>vor Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchenstopfen</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Deutschland</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Fliegenfutterflaschen</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenstopfen</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Deutschland</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>81381</td><td>Rezeptur für Eindeckmedium: 6 g Poly(vinylalkohol) 4-88 in 39&nbsp; ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) und 12,5 ml Glycerin. Über Nacht bei 50&nbsp; umrühren &deg; C und Zentrifuge 20&nbsp; min bei 5.000 U/min. Geben Sie DABCO zum Überstand, um eine Endkonzentration von 2,5 % zu erhalten. Lagern Sie Aliquots bei -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan/ DABCO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>158127</td><td>4% PFA-Fixiermittel Rezept: 4&nbsp; g PFA in 80 ml Millipore H2O auf einer magnetischen Rührplatte, die auf 55 μg erhitzt wird &deg;C. 1 M NaOH tropfenweise zugeben, bis alle PFA-Partikel aufgelöst sind. Fügen Sie 10 ml 10x PBS hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Mischen Sie 100 & Mikro ein. l Triton X-100 und mit Millipore H2O auf 100 ml auffüllen. Aliquots bei -20 °C lagern. Wiederholtes Auftauen vermeiden. (ACHTUNG: PFA ist hochgiftig. Bereiten Sie das PFA-Fixiermittel in einem Abzug vor. Tragen Sie ein umluftunabhängiges Atemschutzgerät, Handschuhe und Kleidung. Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäuten vermeiden.)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>A3059</td><td>Rezept für Blockierungslösung: 0,3 % BSA in PBST auflösen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkiertes Phalloidin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, Molekulare Sonden</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Phalloidin-Stammlösung: Pulver (300 U) in 1,5 ml Methanol auflösen. Bei -20 °C lagern. Zum Färben in Verdünnung 1:250 (A12379, A22283) und 1:100 (A22284) in PBST verwenden.</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6335</td><td>DAPI Färbelösung: Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mg/ml in Millipore H2O vor und lagern Sie die Aliquote bei 4 μC. Wird in einer Verdünnung von 1:1.000 in PBST verwendet.</td></tr><tr><td>Maus-Anti-H2-Antikörper</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Verwendet in Verdünnung 1:500 in Blockierungslösung</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Verwendet in Verdünnung 1:500 in Blockierungslösung</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Embryoschale aus Glas (30&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadeln</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 x 50 mm (0,13-0,16&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Precision Wipes</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Präparier-Stereomikroskop</td><td>Olympus, Hamburg, Deutschland</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Olympus, Hamburg, Deutschland</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) mit DP72 CCD-Kamera</td><td>Ausgestattet mit dem schmalen blauen Bandpassfilter-Set zur Anregung von GFP anderer blau erregbarer Fluorochrome (Anregungsfilter BP460-480 nm, Barrierefilter BA495-540 nm) und schmalem grünen Anregungs- und Langpassbarrierenfilter für RFP und andere grün erregbare Fluorochrome (Anregungsfilter BP530-550, Barrierefilter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus, Hamburg, Deutschland</td><td>FV1000</td><td>Ausgestattet mit inversem IX81 Mikroskop. Ziele: 20 mal; UPlan S-Apo (NA 0,85), 40fach UPlanFL (NA 1.30) und 60-fach; UPlanApo (NA 1.35). Laser: UV-Laser Diode LD405 (50&nbsp; mW), Argon-Laser, mehrzeilig 457/(476)/ 488/515 (40&nbsp; mW), Gelb/Grün Laserdiode LD560 (15&nbsp; mW) und Red Laser diode 635 (20&nbsp; mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Drosophila Kühlbrutschrank</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Deutschland</td><td>&nbsp; Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Spritzflasche</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Digital Rocking Shaker</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Isol-RNA Lysereagenz</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>2302700</td><td>Das Protokoll ist kompatibel mit anderen TRIzol-basierten Reagenzien, z.B. , TRIreagent von Sigma (Kat. Nr.T9424), TRIzol Reagenz von Thermofisher (Kat. Nr. 15596).</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland</td><td>D5758</td><td>DEPC 1:1.000 in Millipore H2O verdünnen, über Nacht umrühren und autoklavieren.</td></tr><tr><td>Ultrareines Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&micro; l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure</td><td>Glycogen ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>27652.232</td><td>Bereiten Sie eine 3 M Natriumacetatlösung mit DEPC-H2O vor und stellen Sie den pH-Wert auf 5,2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td> ein<td></td><td></td>109634</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>100983</td><td>Bereiten Sie eine 75%ige EtOH-Verdünnung mit DEPC-H2O vor.</td></tr><tr><td>UV/Vis-Spektrophotometer NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrozentrifuge (gekühlt)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automatisierte Elektrophoresestation</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transkriptase</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien</td><td></td><td>Prepare 100 &micro; M Lagerlösungen in DEPC-H2O und Lagerung bei -20 > C</td></tr><tr><td>dNTP Mischung</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Frankreich</td><td>4030</td><td>Lager Aliquots von 25 &; Mikro; l bei -20°; C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Hartschalen-PCR-Platten 96-Well, dünnwandig</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>rp49 Forward</td><td>Primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien</td><td></td><td>5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'</td></tr><tr><td>rp49 Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien</td><td></td><td>5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien</td><td></td><td>5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgien</td><td></td><td>5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'</td></tr></tbody></table>

das<em&gt; drosophila</em&gt; imaginalscheibe tumormodell: visualisierung und quantifizierung von genexpression und tumorinvasivität mit genetischen mosaiken

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster hat sich als leistungsfähiges experimentelles System für funktionelle und mechanistische Studien der Tumorentwicklung und -progression im Kontext eines gesamten Organismus erwiesen. Ausgeklügelte Techniken zur Erzeugung genetischer Mosaike erleichtern die Induktion von visuell markierten, genetisch definierten Klonen, die von normalem Gewebe umgeben sind. Die Klone können durch verschiedene molekulare, zelluläre und omics-Ansätze analysiert werden. In dieser Studie wird beschrieben, wie fluoreszenzmarkierte klonale Tumoren unterschiedlicher Malignität in den Augen-/Antennen-Imaginalscheiben (EAD) von Drosophila-Larven unter Verwendung der Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker (MARCM) erzeugt werden können. Es werden Verfahren beschrieben, wie das Mosaik, die EAD und das Gehirn aus den Larven gewonnen und für die gleichzeitige Bildgebung von fluoreszierenden transgenen Reportern und die Färbung von Antikörpern verarbeitet werden können. Um die molekulare Charakterisierung des Mosaikgewebes zu erleichtern, beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung der Gesamt-RNA aus dem EAD. Das Dissektionsverfahren ist geeignet, um EAD und Gehirne aus jedem Larvenstadium zu gewinnen. Das Fixierungs- und Färbeprotokoll für imaginale Scheiben arbeitet mit einer Reihe von transgenen Reportern und Antikörpern, die Drosophila-Proteine erkennen. Das Protokoll für die RNA-Isolierung kann auf verschiedene Larvenorgane, ganze Larven und erwachsene Fliegen angewendet werden. Die Gesamt-RNA kann für die Profilerstellung von Genexpressionsänderungen unter Verwendung von Kandidaten- oder genomweiten Ansätzen verwendet werden. Abschließend wird eine Methode zur Quantifizierung der Invasivität der klonalen Tumoren vorgestellt. Obwohl diese Methode nur begrenzt einsetzbar ist, ist ihr zugrundeliegendes Konzept auf andere quantitative Studien anwendbar, bei denen kognitive Verzerrungen vermieden werden müssen.

GFP-markierten Flecken von definierten Genotypen in Drosophila EAD, drei Arten von Klonen , um das Potential der eyFLP-MARCM Technik zeigen , wurden zu erzeugen induziert: (1) Kontrolle, die GFP allein, (2) maligne Tumore eine onkogene Form des kleinen exprimierenden G-Protein Ras (Ras V12) in einem Hintergrund von homozygoten Verlust eines Gens scribble Tumorsuppressor (Scrib 1) und (3) Bewachsen aber nicht-invasive Scrib 1...

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, zu demonstrieren, wie man die Augen-Antennen-Imaginalanlagen und Gehirne von Drosophila disziert, die genetisch definierte, fluoreszenzmarkierte Klone enthalten, und wie man sie aufbereitet, um Veränderungen der Genexpression sowie die Invasivität von Zellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Die beschriebenen Verfahren können neue Einblicke in die Rolle von Genen bei der epithelialen Entwicklung, Homöostase oder Erkrankungen ermöglichen und helfen, Mechanismen zu entschlüsseln, die ihrer Konkurrenz, kompensatorischen Proliferation oder interklonalen Kooperation zugrunde liegen. Der Hauptvorteil der Studie liegt darin, dass wir eine umfassende Sammlung von Protokollen bereitstellen, die speziell auf eine detaillierte quantitative und qualitative Analyse genetischer Mosaiken in Drosophila zugeschnitten sind.Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Umgang mit dem Drosophila-Modell sind, Schwierigkeiten, da sie die Augen-Antennen-Imaginalscheibe nicht von den anderen Imaginalscheiben unterscheiden können. Um die Erkennung fluoreszenzmarkierter Klone in der Augen-Antennen-Imaginalscheibe innerhalb des Larvenkörpers zu erleichtern, wird empfohlen, die ersten Präparationen unter einem Fluoreszenzmikroskop durchzuführen. Die Mosaikanalyse mit einem unterdrückbaren Zellmarker (MARCM) ermöglicht die Erzeugung genetisch definierter klonaler Bereiche in einem ansonsten phänotypisch wildtypischen Hintergrund.Eine durch einen eyeless-Promotor angetriebene FLP-Rekombinase katalysiert die Rekombination zwischen zwei FRT-Elementen, die eine mit einem gelben Gen markierte Stop-Kassette flankieren. Nach der DNA-Replikation katalysiert FLP den Austausch der nicht-schwesterlichen Chromatiden zwischen den homologen Chromosomen, wodurch Schwesterchromatiden entstehen: eine trägt das Wildtyp-Allel und den Gal80-Repressor, die andere das mutante Allel.Bei der Mitose segre­gieren diese Chromosomen, sodass zwei Tochterzellen entstehen, von denen eine homozygot mutiert und die andere vom Wildtyp ist. Der Verlust des Gal80-Repressors ermöglicht die Expression von GFP in der mutierten Zelle, während die Zellen vom Wildtyp GFP-negativ bleiben. Um das Experiment zu beginnen, sammeln Sie mosaikartige Larven, indem Sie PBS in die Flasche spritzen, bis die Oberfläche des Nährbodens bedeckt ist.Danach die obere Schicht mit einem Spatel auflockern und die Nahrungssuspension mit Larven in eine Petrischale gießen. Die Larven vorsichtig aufheben und in eine Embryoschale überführen, die mit PBS gefüllt ist. Sammeln Sie mindestens 20 Larven für die Immunfärbung und 80 Larven zur Quantifizierung der Tumorausbreitung.Spülen Sie die Larven mit PBS, um alle Reste von Nahrung zu entfernen. Identifizieren Sie mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops bei 8:16x Vergrößerung die Leopardenlarven – diese weisen zufällig verteilte GFP-positive Flecken im gesamten Körper auf – und entsorgen Sie sie. Stellen Sie die Schale mit den verbleibenden Larven in PBS auf Eis, bis zur anschließenden Dissektion.Um die Augen-Antennen-Imaginalscheibe unter dem Stereomikroskop zu präparieren, verwenden Sie ein Paar Pinzetten und greifen Sie die Larve vorsichtig etwa bei 2/3 der Körperlänge hinter dem Kopf. Mit dem zweiten Paar Pinzetten fassen Sie die Mundhaken der Larve und ziehen sie vom Körper weg. Lösen Sie mit den Pinzetten die Mundhaken vorsichtig aus dem überlagernden Cuticula und überflüssigem Gewebe wie den Speicheldrüsen und dem Fettkörper. Alternativ zur Herstellung des Augen-Antennen-Diskus-Gehirn-Komplexes unter Beibehaltung des intakten ventralen Nervenstrangs schneiden Sie eine Larve mit der Pinzette in der Körpermitte durch. Entsorgen Sie die hintere Hälfte. Halten Sie die vordere Hälfte des Larvenkörpers mit der Spitze eines Paares Pinzetten fest und stülpen Sie die Larve dann um, indem Sie die Mundhaken mit der Spitze des zweiten Paares nach innen drücken und das Cuticula mit dem ersten Paar Pinzetten darüberrollen.Entfernen Sie vorsichtig das gesamte überflüssige Gewebe einschließlich des Darms, des Fettkörpers und der Speicheldrüsen. Ziehen Sie die Mundhaken sanft von der Cuticula weg. Lösen Sie den an den Mundhaken befestigten Augen-Antennen-Scheiben-Gehirn-Komplex, indem Sie die axonalen Fortsätze durchtrennen, die sich vom ventralen Nervenstrang zu den Muskeln und zur Epidermis erstrecken.Um das Gewebe zu übertragen, beschichten Sie zuerst eine P20-Mikropipettenspitze, indem Sie die verbleibenden Körperrückstände mehrmals auf- und abpipettieren, und verwenden Sie dieselbe Spitze anschließend, um das dissezierte Gewebe zu übertragen. Um größere Augen-Antennen-Disc-Hirn-Komplexe zu übertragen, schneiden Sie die P20-Spitze vorher an, um die Öffnung zu vergrößern. Fixieren Sie die Proben in 400 Mikrolitern 4 % PFA-Fixansatz 25 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln.Entfernen Sie dann das Fixierungsmittel und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST unter Nutation. Ersetzen Sie anschließend das PBST durch 500 Mikroliter DAPI-Färbelösung und führen Sie eine 15-minütige Nution im Dunkeln durch. Waschen Sie das Gewebe danach einmal für 10 Minuten mit PBST.Um die Dissektion abzuschließen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Gewebe zurück in eine mit PBS gefüllte Glaswanne zu überführen. Trennen Sie mit zwei Pinzettenpaaren die Gehirne, die zur Quantifizierung der Invasivität verwendet werden sollen, von den Augen-Antennen-Scheiben, indem Sie die optischen Stiele durchschneiden. Lösen Sie die Augen-Antennen-Scheiben, indem Sie sie von den Mundhaken abschneiden.Bringen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem abduktiven Objektträger auf und verteilen Sie die Flüssigkeit mit einer Pinzette zu einer dünnen Schicht. Um die Invasivität zu quantifizieren, geben Sie mindestens 80 fixierte, intakte Gehirne pro Genotyp auf einen einzelnen Objektträger. Richten Sie das Gewebe nach Wunsch gerade aus und positionieren Sie es.Berühren Sie vorsichtig eine Kante einer Deckglasplatte mit dem Medium und senken Sie sie mithilfe einer Pinzette langsam ab, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Verwenden Sie ein Labor-Tupferpapier, um überschüssiges Einbettmedium an den Rändern aufzusaugen. Das Gewebe kann nun mittels konfokaler Bildgebung untersucht werden.Bitten Sie eine unabhängige Person, die Objektträger zu anonymisieren, damit die Auswertung unvoreingenommen erfolgt. Lassen Sie die Objektträger außerdem unabhängig voneinander von mindestens zwei Forschern bewerten. Geben Sie die Genotypen erst nach Abschluss der Auswertung bekannt.Beurteilen Sie den Malignitätsgrad unter einem fluoreszenzbestückten Stereomikroskop mit GFP-Filteranordnung. Kennzeichnen Sie mit einem Marker die Gehirne, die bereits begutachtet wurden, um eine Doppelzählung zu vermeiden. Fluoreszenzkonfokale Aufnahmen zeigen aus Larven gewonnene Gehirne mit malignen RAS V12 scribble-Mutanten-GFP-markierten klonalen Tumoren, die mit DAPI gefärbt wurden.Die Abbildungen zeigen die vier verschiedenen Grade der Tumorausbreitung. Eine unvoreingenommene Quantifizierung ergab, dass die Hemmung der JNK-Signalübertragung und von RAS V12 scribbled one-Klonen die Tumorausbreitung unterdrückt. In Kontroll-Augen-Antennen-Scheiben markiert der JNK-empfindliche TRE-DsRED-Reporter lediglich einen schmalen Zellstreifen, der sich von der Antennen- zur Augenregion erstreckt.Dagegen war die TRE-DsRED-Aktivität in den GFP-positiven malignen klonalen Tumoren deutlich erhöht. Bis zum Tag 8 hatten die Tumorzellen die Augen-Antennen-Scheiben überwuchert und sich bis zum ventralen Nervenstrang ausgebreitet. Die eindringenden Tumorzellen zeigten im Vergleich zum umgebenden Gewebe außerdem eine stärkere JNK-Aktivierung.Während die Blockade von JNK die TRE-DsRED-Aktivität in den Tumorklonen eindeutig verringerte, zeigte eine Erhöhung der Laserintensität eine Steigerung in den epithelialen Zellen, die den Klonen benachbarten. Zusätzlich zeigte ein Hemolectin-delta-DsRED-Reporter, dass sich im Gegensatz zu einigen wenigen Hämocyt-Clustern, die in den Vertiefungen des Kontroll-Augen-Antennen-Epithels gefunden wurden, Hämocyten in dem aus malignen Tumoren bestehenden Augen-Antennen- und Gehirngewebe anreicherten. Bei der Hemmung von JNK sank die Zahl der assoziierten Immunzellen dramatisch.Die erhöhte Tumorinvasion, JNK-Aktivität und Hämozyteninfiltration gingen mit einer signifikanten Hochregulation von MMP1-mRNA einher, wie durch QRTPCR mit Gesamt-RNA, isoliert aus dissezierten mosaikartigen Augen-Antennen-Discs, bestimmt wurde. Sobald die Technik beherrscht ist, können über 60 Augendisk-Paare und Gehirne innerhalb von 30 Minuten disseziert werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Larven mit den gewünschten Genotypen zu erzeugen.Seien Sie beim Dissektieren schnell, aber präzise, um sicherzustellen, dass Proben, die für die RNA-Isolierung bestimmt sind, frei von RNS sind. Nach der Dissektion kann eine Western Blot-Analyse als Alternative zur Immunfärbung verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinausprägung zwischen verschiedenen Genotypen zu untersuchen. Die Erstellung genetischer Mosaiken und deren Analyse mit den beschriebenen Verfahren ermöglicht die Erforschung ansonsten letaler Mutationen sowie von Mechanismen der Onkogenkorporation. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mosaikartige Gewebe aus dem Augen-Antennen-Disk und Gehirne von Larven im dritten Larvenstadium disseziert und wie man sie für die Immunfärbung, die Visualisierung transgener und Reportergen-Aktivität, die RNA-Extraktion sowie die Quantifizierung der Invasivität aufbereitet.Es sei daran erinnert, dass PFA sowie Phenol-Chloroform und DAPI hochtoxisch sind und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen und Schutzkleidung stets beachtet werden sollten, wenn mit diesen Substanzen gearbeitet wird.

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben...

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

Wir haben 3D-Kokultur-Modelle für Live-Cell-Imaging entwickelt in Echtzeit von Interaktionen zwischen Brust-Tumor-Zellen und andere Zellen in ihrer Mikroumgebung, die Einfluss auf Progression zu einem invasiven Phänotyp. Diese Modelle können als Bildschirme für präklinische Arzneimittel auf parakrine-induzierte proteolytische, Chemokin / Zytokin-und Kinase-Signalwege in Invasivität-Ziels dienen.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen RAS wie V12 und Mutationen in Genen, die Zellpolarität wie gekritzelt, führen in das Tumorwachstum in Drosophila, wo Tumorzellen invasive Verhalten zeigen auch. Hier wird ein einfaches Protokoll für die Induktion und Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren präsentiert.

Ein Protokoll für genetische Induktion und Visualisierung von Gut-und invasiven Tumoren in Cephalic Komplexe von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, wie die Mosaik-Transgenese-Strategie im Zebrafisch verwendet werden kann, um die relativen Beiträge mehrerer Onkogene zur Tumorinitiierung und -progression in vivo schnell und effizient zu bewerten.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.

Induktion und Diagnose von Tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anleitungen für die anfängliche und fortgesetzte Allotransplantation von Drosophila-Tumoren in den Bauch erwachsener Wirte zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Neoplasie. Mit einem Autoinjektor-Gerät können Forscher eine verbesserte Effizienz und Tumorausbeute im Vergleich zu herkömmlichen, manuellen Methoden erzielen.

Tumorallotransplantation in Drosophila melanogaster mit einem programmierbaren Auto-Nanoliter-Injektor

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.

Modellierung von Hirntumoren in vivo unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die die Mutationssignaturen von Patienten repräsentiert

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Augen-Antennen-Imaginalscheiben und -Gehirnen mit fluoreszenzmarkierten Klonen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität.

Das Drosophila Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken (Video) | JoVE Journal

Das

Weitere Videos entdecken